Name: Malachit-Green-Assay zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Inhibitoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Lernen Sie den Malachit-Grün-Assay zur Entdeckung von Hsp90-Inhibitoren in der Krebsforschung kennen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Screening-Analyse von ATPase-Aktivitäten.

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Diese Studie wurde durch das Korea Research Fellowship (KRF) Programm, Postdoktorand der National Research Foundation of Korea (NRF), finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT unterstützt (NRF-2019H1D3A1A01102952). Die Autoren danken dem KIST-Zuschuss und dem Zuschuss des Ministeriums für Ozeane und Fischerei mit der Nummer 2MRB130 für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts.

1. Malachit-Grün-Assay im Labormaßstab
<ol><li>Herstellung des Assay-Puffers<ol><li>Bereiten Sie den Assay-Puffer gemäß der Zusammensetzung und Zubereitung in Tabelle 1 vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellung von Phosphatstandards<ol><li>Verwenden Sie 1 mM Phosphatstandard, der im Malachitgrün-Assay-Phosphat-Assay-Kit enthalten ist (gelagert bei 4 °C).</li>
		<li>Pipettieren Sie 40 μl 1 mM Phosphatstandard in 960 μl Reinstwasser, um 40 μM Phosphatlösung (Vormischlösung) zu erhalten. Fügen Sie die Vormischungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Reinstwasser hinzu, um eine serielle Verdünnung von Phosphat von 0 bis 40 μM zu bilden.</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung der Hefe Hsp90<ol><li>Verwenden Sie Hefe Hsp90 mit einer Glyceringehaltskonzentration von 0,66 mg/ml. Kurz vor Gebrauch auf Eis auftauen.</li>
		<li>Verwenden Sie 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) Hefe Hsp90 für eine messbare ATPase-Aktivität. Stellen Sie sicher, dass der optische Dichteunterschied nach Zugabe von Malachitgrün-Reagenz zwischen der Leer- und der Positivkontrolle mindestens 0,5 und weniger als 1,0 beträgt. Hier wurde festgestellt, dass die Absorptionsdifferenz zwischen dem Rohling (ohne Hsp90) und der Positivkontrolle (mit Hsp90) 0,510 beträgt.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von ATP<ol><li>1 mg ATP wird in eine Durchstechflasche mit 453,39 μl Reinstwasser übertragen, um 4 mM Stammlösung zu erhalten. Führen Sie Gewichtsberechnungen auf der Grundlage von wasserfreiem ATP (Molekulargewicht [m.w.] = 551,14) durch. Bereiten Sie ATP frisch zu, da es mit der Zeit spontan hydrolysieren kann.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Vertiefung 4 μl ATP-Stammlösung hinzu, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,2 mM (endgültiges Gesamtvolumen der Assay-Vertiefung von 80 μl) zu erhalten. Fügen Sie ATP als letzte Komponente zur Reaktion hinzu, indem Sie eine Mehrkanalpipette verwenden, so dass alle Reaktionen gleichzeitig beginnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung von Geldanamycin (GA)<ol><li>Bereiten Sie einen Vorrat von 10 mM GA vor, indem Sie 1 mg in 178,37 μl DMSO (m.w. = 560,64) auflösen. Unter Verwendung der Stammlösung werden 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM und 0,00128 mM Lösung in DMSO durch serielle Verdünnung hergestellt.</li>
		<li>Fügen Sie 2 μl dieser Stammlösungen zu jeder Vertiefung hinzu, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM bzw. 0,000032 mM zu erhalten.</li>
		<li>Bereiten Sie die Bohrungen wie in Tabelle 2 und Tabelle 3 beschrieben vor, wobei die Bohrungen den Leerstein (Puffer + Wasser + DMSO) und die Negativkontrolle (Hsp90 im Puffer + Wasser + DMSO) enthalten. Als Positivkontrolle dienen die GA-haltigen Brunnen (Hsp90 im Puffer + Wasser + GA).</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Wellplatten und Reihenfolge der Zugabe<ol><li>Bereiten Sie 96-Well-Platten mit dem in Tabelle 2 dargestellten Layout vor. Für Verbindungen, die eine Absorption bei 620 nm aufweisen, bereiten Sie eine separate Vertiefung vor, um die Absorption bei dieser Wellenlänge aufzuzeichnen. Bereiten Sie keine separate Vertiefung für GA vor, da GA bei 620 nm keine Absorption für die im Assay verwendete Konzentration zeigt.</li>
		<li>Bereiten Sie jeden Bestandteil mit dem Gesamtvolumen jedes Bestandteils vor, wie in Tabelle 3 dargestellt.</li>
		<li>Richten Sie Assay-Vertiefungen ein, indem Sie jeder Vertiefung hochreines Wasser hinzufügen. Fügen Sie anschließend die erforderliche Menge Assay-Puffer und eine zusammengesetzte Lösung (z. B. GA-Lösung) hinzu.</li>
		<li>Geben Sie dann Hsp90 in die entsprechenden Vertiefungen und schütteln Sie die Platten 2 Minuten lang auf einem Tellerschüttler bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Fügen Sie 4 μl ATP-Lösung mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Wickeln Sie den Teller in Alufolie ein und schütteln Sie ihn 2 Minuten lang auf einem Tellerschüttler (200 U/min) bei Raumtemperatur. Die Platte bei 37 °C 3 h inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung und Zugabe von Malachitgrün-Reagenz<ol><li>Das Malachitgrün-Reagenz besteht aus den Reagenzien A (Ammoniummolybdat in 3M HCl) und B (Malachitgrün und Polyvinylalkohol). Bringen Sie das Reagenz vor Gebrauch auf Raumtemperatur. Mischen Sie die Reagenzien A und B in einem Verhältnis von 100:1 (1.000 μl:10 μl). Bereiten Sie diese innerhalb von 3 Stunden vor Gebrauch vor, da sie instabil ist und sich nach 3 Stunden zu zersetzen beginnt.</li>
		<li>Nach 3 h des Schritts 1.6.5 wird die Reaktion durch Zugabe von 20 μl malachitgrünem Reagenz, das in der gleichen Reihenfolge wie ATP zugegeben wird, mit einer Mehrkanalpipette gestoppt.</li>
		<li>Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Absorption der Platte bei 620 nm in einem Plattenlesegerät gemessen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hochdurchsatz-Screening von Hsp90-Inhibitoren mittels Malachit-Grün-Assay
HINWEIS: Das Protokoll für das Hochdurchsatz-Screening ähnelt der Methodik im Labormaßstab. Das finale Wellvolumen beträgt jeweils 80 μL. Es gibt jedoch einen geringfügigen Unterschied in der Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien. Bei der Methode im Labormaßstab gibt es fünf Stufen der Lösungszugabe (34 μl Wasser, 32 μl Puffer, 2 μl Verbindung in DMSO, 8 μl Hsp90 und schließlich 4 μl ATP-Lösung). Im Gegensatz dazu gibt es bei HTS drei Stufen der Zugabe (40 μl Pufferlösung, die Hefe Hsp90 enthält, 2 μl DMSO in 18 μl Wasser, das die Verbindungen enthält, und schließlich 20 μl in Wasser gelöstes ATP). Die minimale Menge an Lösung, die im HTS-Setup genau pipettiert werden kann, beträgt 20 μl. Daher wird ein Unterschied beim Pipettieren zwischen Labor- und HTS-Waage beobachtet.
<ol><li>Herstellung von Assay-Puffer (pH 7,4)<ol><li>Verwenden Sie für HTS den gleichen Puffer wie für den Malachit-Grün-Assay im Labormaßstab (Tabelle 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung der Hefe Hsp90<ol><li>Verwenden Sie Protein mit einer Glyceringehaltskonzentration von 0,66 mg/ml. Kurz vor Gebrauch auf Eis auftauen.</li>
		<li>Verwenden Sie 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) Hefe Hsp90 in jeder Vertiefung, was eine messbare ATPase-Aktivität liefert.</li>
		<li>Verdünnen Sie das Protein (8 μl) in Puffer (32 μl) für jede Vertiefung. Das endgültige Gesamtarbeitsvolumen für jede Vertiefung beträgt 40 μl bei einem Gesamtassay-Volumen von 80 μl.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von 0,8 mM ATP<ol><li>Lösen Sie 1 mg ATP in 2.267 μl destilliertem Wasser auf, um eine 0,8 mM Lösung zu erhalten. Das Gesamtarbeitsvolumen für jede Vertiefung beträgt 20 μl bei einem Gesamtassay-Volumen von 80 μl.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Geldanamycin (GA)/Testpräparaten<ol><li>Bereiten Sie einen GA-Bestand von 0,8 mM in DMSO vor, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Verdünnen Sie 10 μl des GA-Stammes mit 90 μl Wasser, um eine Endkonzentration von 80 μM zu erhalten.</li>
		<li>Verwenden Sie 20 μl der 80 μM GA-Lösung in geeigneten Assay-Wells (endgültiges Gesamt-Assay-Well-Volumen = 80 μl), was eine endgültige Well-Konzentration von 20 μM ergibt. Dies dient als Positivkontrolle.</li>
		<li>Für Testverbindungen sind Lösungen in DMSO entsprechend der gewünschten Konzentration für die Bewertung vorzubereiten.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 μl DMSO in 90 μl Wasser für die Zugabe zu Leer- (Puffer + Wasser + DMSO) und Negativkontrollbrunnen (Hsp90 in Puffer + Wasser + DMSO) vor. Die Testverbindungen werden in ähnlicher Weise bei einer Endvertiefungskonzentration von 100 μM hergestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Design der Assay-Platten und Reihenfolge der Zugabe<ol><li>Verwenden Sie vier Hauptplatten, eine Verbundplatte und vier Additionsplatten mit Reagenzienvorräten, um den Assay einzurichten (Abbildung 2 und Tabelle 4).</li>
		<li>Fügen Sie zusätzlich Platte A 90 μl Assay-Puffer in jede Vertiefung hinzu; zusätzlich Platte B 90 μl Puffer mit Hsp90 in jede Vertiefung geben; zusätzlich zu den Platten C und D 90 μl ATP bzw. 90 μl Malachitgrün-Reagenz in jede Vertiefung geben (Tabelle 5 und Tabelle 6).</li>
		<li>Von der Additionsplatte A und der Platte B werden 40 μl Lösung aus jeder Vertiefung mit einem automatisierten Mehrkanal-Dosiersystem auf die Hauptplatte 1 und 2 bzw. 3 und 4 übertragen. Hier kam die Laborautomations-Workstation Biomek(R) FXP zum Einsatz (Abbildung 2 und Tabelle 6).</li>
		<li>Aus jeder Vertiefung der Verbundplatte werden 20 μl der Lösung auf die Hauptplatten 1, 2, 3 und 4 übertragen (Abbildung 2). Schütteln Sie die Teller 1 Minute lang in einem Shaker (200 U/min).</li>
		<li>Aus jeder Vertiefung der Zugabeplatte C (ATP) werden 20 μl Lösung auf die Hauptplatten 1, 2, 3 und 4 übertragen (Abbildung 2). Schütteln Sie die Teller 1 Minute lang in einem Shaker (200 U/min).</li>
		<li>Die Platten 3 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie das grüne Malachit-Reagenz wie in Schritt 1.7 beschrieben vor. Nach 3 h werden 20 μl Malachitgrün-Reagenz von der Zugabeplatte D in die Vertiefungen der Hauptplatten 1, 2, 3 und 4 überführt (Abbildung 2).</li>
		<li>Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Absorption der Platte bei 620 nm in einem Plattenlesegerät gemessen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

Es bestehen keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hsp90 ist ein wichtiges Ziel für die Entdeckung neuartiger Moleküle gegen Krebsmedikamente. Seit der Etablierung der Arzneibarkeit im Jahr 1994 haben10.18 Moleküle klinische Studien erreicht. Derzeit befinden sich sieben Moleküle in verschiedenen Phasen der klinischen Erprobung, entweder allein oder in Kombination22. Alle diese kleinen Moleküle sind N-terminale ATP-bindende Inhibitoren. Die anderen Mittel zur Hemmung des Chaperons (C-terminale Inhibitoren, Middle-Domain-Inh...

Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist ein molekulares Chaperon, das die Stabilität von Proteinen aufrechterhält, die für die Entstehung und das Fortschreiten von Krebs verantwortlich sind. Darüber hinaus sind auch Proteine, die für die Entwicklung von Resistenzen gegen antineoplastische Wirkstoffe verantwortlich sind, Kunden von Hsp901. Hsp90 wird ubiquitär in allen Krebszelltypen (>90% der zellulären Proteine) überexprimiert, verglichen mit normalen Zellen, in denen es weniger als 2% der gesamten Proteine ausmachen kann. Darüber hinaus befindet sich das Hsp90 von Krebszellen in einem Komplex mit Co-Chaperonen, während es in einer normalen Zelle überwiegend in einem freien, nicht komplexierten Zustand vorliegt 2,3. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass mehrere Hsp90-Inhibitoren in In-vitro- und In-vivo-Studien senolytische Wirkungen besitzen, wobei sie die Lebensdauer von Mäusen signifikant verbessert haben 4,5,6. Alle oben genannten Ergebnisse untermauern die Tatsache, dass Hsp90-Inhibitoren bei mehreren Krebsarten wirksam sein könnten, mit weniger Nebenwirkungen und geringerem Risiko, Resistenzen zu entwickeln. Die Chaperoning-Funktion von Hsp90 wird durch die Bindung von ATP an der N-terminalen Domäne von Hsp90 und die Hydrolyse in ADP und freies Phosphat7 erreicht. Es wurde festgestellt, dass kleine Moleküle, die kompetitiv an die ATP-Bindungstasche von Hsp90 binden, den Chaperoning-Effekt des Proteins erfolgreich unterdrücken. Bis heute ist dies die beste Strategie zur Hemmung von Hsp90, was durch die Tatsache gestützt wird, dass solche Inhibitoren in die klinische Erprobung gelangt sind8. Eines davon, Pimitespib, wurde im Juni 2022 in Japan für die Behandlung von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) zugelassen9. Dies ist der erste Hsp90-Inhibitor, der seit der Einführung der Behandelbarkeit des Chaperons im Jahr 1994 zugelassen wurde10.
Der Malachitgrün-Assay ist ein einfaches, empfindliches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von anorganischem Phosphat, das für die Automatisierung und das Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Verbindungen gegen das gewünschte Zielgeeignet ist 11. Der Assay wurde erfolgreich für das Screening von Hsp90-Inhibitoren in kleinen Laboraufbauten sowie in einem HTS 12,13,14,15,16,17 eingesetzt. Der Assay verwendet eine kolorimetrische Methode, die das freie anorganische Phosphat bestimmt, das aufgrund der ATPase-Aktivität von Hsp90 gebildet wird. Grundlage dieser Quantifizierung ist die Bildung eines Phosphohomolybdat-Komplexes zwischen freiem Phosphat und Molybdän, der anschließend mit Malachitgrün zu einer grünen Farbe reagiert (Abbildung 1). Diese schnelle Farbbildung wird auf einem Spektralphotometer oder auf einem Plattenlesegerät zwischen 600-660 nm18,19 gemessen.
Im vorliegenden Protokoll wird das Verfahren zur Durchführung eines Malachitgrün-Assays mit Hefe Hsp90 und anschließender Identifizierung von Inhibitoren gegen das Chaperon beschrieben. Das Naturstoffmolekül Geldanamycin (GA), mit dem die Arzneibarkeit von Hsp90 erstmals nachgewiesen wurde, wurde als authentischer Inhibitor eingenommen10. HTS ist aufgrund der Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Molekülen für Tests zu einem integralen Bestandteil des aktuellen Wirkstoffforschungsprogramms geworden. Diese Technik hat in den letzten 2 Jahren an Bedeutung gewonnen, da dringend Medikamente zur Behandlung von Covid-19-Infektionen umgewidmet werdenmüssen 20,21. Daher wird ein detaillierter Überblick über die HTS von Molekülen gegen Hefe-Hsp90-Protein unter Anwendung der Malachit-Green-Assay-Methode gegeben.

<table><tbody><tr><td>1M Magnesiumchlorid-Lösung in Wasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1M Kaliumchlorid-Lösung in Wasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>SPL Life Sciences</td><td>Nicht anwendbar</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-Triphosphat-Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX Labor Automatisierungsarbeitsplatz</td><td>Beckman Coulter</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Verbindungen 3-96</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Histidin-markierte Hefe Hsp90 wurde von Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Vereinigtes Königreich, gewonnen und das Protein wurde im KIST Gangneung Institute of Natural Products exprimiert. Details können aufgrund von Patentverletzungsproblemen nicht offengelegt werden.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin, 99% (HPLC), Pulver</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Malachitgrünes Phosphat Assay&nbsp; Assay-Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT Multiplatten-Lesegerät</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Hydrochlorid-Pufferlösung, pH7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hefe Hsp90</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Nicht zutreffend School</td><td>of Life Sciences, University of Sussex, Vereinigtes Königreich, und Protein wurde in KIST Gangneung Institute of Natural Products exprimiert. Primäre Zugangsnummer: P02829</td></tr></tbody></table>

malachit-green-assay zur entdeckung von hitzeschockprotein-90-inhibitoren

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist aufgrund seiner begleitenden Wirkung auf mehrere onkogene Proteine ein vielversprechendes Ziel gegen Krebs. Die Aktivität von Hsp90 hängt von seiner Fähigkeit ab, Adenosintriphosphat (ATP) zu Adenosindiphosphat (ADP) und freiem Phosphat zu hydrolysieren. Die ATPase-Aktivität von Hsp90 ist mit seiner Chaperoning-Funktion verbunden; ATP bindet an die N-terminale Domäne des Hsp90, und die Unterbrechung seiner Bindung erwies sich als die erfolgreichste Strategie zur Unterdrückung der Hsp90-Funktion. Die ATPase-Aktivität kann durch einen kolorimetrischen Malachit-Grün-Assay gemessen werden, der die Menge an freiem Phosphat bestimmt, das durch ATP-Hydrolyse gebildet wird. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Bestimmung der ATPase-Aktivität der Hefe Hsp90 unter Verwendung des Malachit-Grünphosphat-Assay-Kits beschrieben. Darüber hinaus wird eine detaillierte Anleitung zur Entdeckung von Hsp90-Inhibitoren durch die Einnahme von Geldanamycin als authentischem Inhibitor bereitgestellt. Abschließend wird die Anwendung dieses Assay-Protokolls durch das Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Inhibitormolekülen gegen Hefe Hsp90 diskutiert.

Die Ergebnisse des Assays werden in Bezug auf die Absorption aufgrund der Konzentration der freien Phosphationen interpretiert. Die Absorption durch freies Phosphat aufgrund der ATP-Hydrolyse durch die Hefe Hsp90 bei 620 nm wird als 100%ige ATPase-Aktivität oder nullprozentige Proteinhemmung angesehen. Die Hemmung des Proteins führt zum Aufhören der ATP-Hydrolyse (weniger freies Phosphat). Dies spiegelt sich in einer verringerten Absorption bei 620 nm wider.
Ergebnisse des Malachit-Grü...

Das Malachit-Green-Assay-Protokoll ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Suppressoren (Hsp90) sowie anderer Hemmstoffe gegen ATP-abhängige Enzyme.

Malachit-Green-Assay zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Inhibitoren

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Dieses Protokoll hilft bei der Bestimmung der Aktivität von ATPase-Proteinen, indem es das freie Phosphat misst, das bei der ATP-Hydrolyse durch die Proteine entsteht. Der Malachitgrün-Assay ist ein einfaches, empfindliches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von anorganischem Phosphat. Es eignet sich für die Automatisierung und das Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen gegen ihr Ziel.Diese Technik wird eine wichtige Rolle bei der schnellen Entdeckung von Inhibitoren gegen das Hsp90-Protein spielen, das ein wichtiges Ziel gegen Krebs ist. Pipettieren Sie zunächst 40 Mikroliter eines einmillimolaren Phosphatstandards in 960 Mikroliter Reinstwasser, um eine 40-mikromolare Phosphatlösung zu erhalten. Fügen Sie diese Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu, um eine serielle Verdünnung von Phosphat von 0 auf 40 Mikromolaren zu bilden.Verwenden Sie als Nächstes acht Mikroliter Hefe Hsp90 für eine messbare ATPase-Aktivität. Fügen Sie Malachitgrün-Reagenz zu der Blind- und Positivkontrolle hinzu und überprüfen Sie, ob die optische Dichtedifferenz zwischen der Blind- und der Positivkontrolle nach der Zugabe mindestens 0,5 und kleiner als 1 beträgt. Zur Herstellung von ATP wird ein Milligramm ATP in eine Durchstechflasche mit 453,39 Mikrolitern Reinstwasser überführt, um eine viermillimolare Stammlösung zu erhalten.Bereiten Sie das ATP frisch zu, da es mit der Zeit spontan hydrolysieren kann. Geben Sie vier Mikroliter ATP-Stammlösung in jede Vertiefung, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,2 Millimolaren zu erhalten. Fügen Sie ATP als letzte Komponente der Reaktion mit einer Mehrkanalpipette hinzu, so dass alle Reaktionen gleichzeitig starten.Als nächstes bereiten Sie einen 10-Millimol-Vorrat an Geldanamycin vor, indem Sie ein Milligramm in 178,37 Mikrolitern DMSO auflösen. Unter Verwendung der Stammlösung werden 4-Millimolaren, 0,8 Millimolaren, 0,16 Millimolaren, 0,032 Millimolaren, 0,0064 Millimolaren und 0,00128 Millimolare Lösungen in DMSO durch serielle Verdünnung hergestellt. Geben Sie zwei Mikroliter dieser Stammlösungen in jede Vertiefung, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,1 Millimolaren, 0,02 Millimolaren, 0,04 Millimolaren, 0,0008 Millimolaren, 0,00016 Millimolaren und 0,000032 Millimolaren zu erhalten.Bereiten Sie dann die Bohrungen zusammen mit den Bohrlöchern vor, die den Leer- und Negativcode enthalten. Die Vertiefungen, die Geldanamycin enthalten, dienen als Positivkontrolle. Bereiten Sie die 96-Well-Platten vor und bereiten Sie eine separate Vertiefung für die Verbindungen vor, die eine Absorption bei 620 Nanometern aufweisen, um die Absorption bei dieser Wellenlänge aufzuzeichnen.Für Geldanamycin ist keine separate Vertiefung zu zeigen, da Geldanamycin bei 620 Nanometern für die in diesem Assay verwendete Konzentration keine Absorption aufweist. Richten Sie Assay-Vertiefungen ein, indem Sie jeder Vertiefung Reinstwasser hinzufügen. Fügen Sie dann die erforderliche Menge Assay-Puffer und eine zusammengesetzte Lösung wie Geldanamycin-Lösung hinzu.Hsp90 in die entsprechenden Vertiefungen geben und die Teller zwei Minuten lang auf einem Tellerschüttler bei Raumtemperatur schütteln. Fügen Sie vier Mikroliter ATP-Lösung mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und schütteln Sie sie zwei Minuten lang auf einem Tellerschüttler bei Raumtemperatur bei 200 U/min.Die Platte bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 20 Mikroliter Malachitgrün-Reagenz in der gleichen Reihenfolge wie ATP mit einer Mehrkanalpipette zugeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Schluss messen Sie die Absorption der Platte bei 620 Nanometern in einem Plattenlesegerät.Zusätzlich zu Platte A werden 90 Mikroliter Assay-Puffer in jede Vertiefung gegeben. Zusätzlich zu Platte B 90 Mikroliter Puffer mit Hsp90 in jede Vertiefung geben. Fügen Sie zusätzlich zu Platte C 90 Mikroliter ATP hinzu, und zusätzlich zu Platte D fügen Sie 90 Mikroliter Malachitgrünes Reagenz in jede Vertiefung hinzu.Verwenden Sie ein automatisiertes Mehrkanal-Dosiersystem, um 40 Mikroliter Lösung aus jeder Vertiefung der Zugabeplatte A auf die Hauptplatten eins und zwei und die Platte B auf die Hauptplatte drei und vier zu übertragen. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Lösung aus jeder Vertiefung der Verbundplatte auf die Hauptplatten eins, die Hauptplatten zwei, die Hauptplatten drei und die Hauptplatten vier. Schütteln Sie die Teller eine Minute lang in einem Shaker mit 200 U/min.Übertragen Sie 20 Mikroliter der Lösung aus jeder Vertiefung der Zugabeplatten C auf die Hauptplatten eins, zwei, drei und vier. Schütteln Sie die Teller eine Minute lang in einem Shaker mit 200 U/min. Inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und übertragen Sie dann 20 Mikroliter Malachitgrün-Reagenz von der Additionsplatte D in die Vertiefungen der Hauptplatten eins, zwei, drei und vier.Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Absorption der Platte bei 620 Nanometern in einem Plattenlesegerät gemessen. Die Struktur von Malachitgrün und die Reaktionen von Malachitgrün-Reagenz A mit freiem Phosphat und die anschließende Reaktion mit Reagenz B sind hier dargestellt. In dieser Abbildung ist ein Standarddiagramm für die Standardphosphatkonzentration dargestellt.Hier stellt die x-Achse die freie Phosphat- oder Pi-Konzentration im Mikromolaren dar, und die Absorption bei 620 Nanometern ist auf der y-Achse dargestellt. Die Fehlerbalken stellen die Abweichung zwischen den beiden Stichprobennummern dar. Die prozentuale ATPase-Aktivität wird verwendet, um die dosisabhängige Hemmung des Proteins durch Geldanamycin zu messen.Es wurde beobachtet, dass Geldanamycin das Protein dosisabhängig mit einem IC50-Wert von 0,85-Mikromolaren hemmt. Dabei ist jeder Punkt ein Mittelwert aus zwei Bestimmungen. Die Farbentwicklung in der Hauptplatte eins nach Zugabe des Malachitgrünmittels ist in diesem Bild dargestellt.Die rosa Farbe im A11-Brunnen ist auf die zusammengesetzte Farbe zurückzuführen. In ähnlicher Weise ist hier die Farbentwicklung in Hauptplatte zwei dargestellt. Die rosa Farbe im A11-Brunnen ist auf die farbige Beschaffenheit der Verbindung zurückzuführen.Die Farbentwicklung nach Zugabe des Malachitgrün-Reagenzes in Hauptplatte drei und in Hauptplatte vier ist hier dargestellt. Die Zugabe von ATP und Malachitgrün-Reagenz im gleichen Zeitintervall zu jeder Vertiefung ist eine wichtige Sache, die bei der Durchführung dieses Verfahrens zu beachten ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.

Intrazelluläre Rückfaltung Assay

Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert...

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

In diesem Video demonstrieren wir den amplifizierten lumineszierenden homogenen Proximity-Assay – einen Bead-basierten Proximity-Assay. Es verwendet homogen große Akzeptor- und Donorkügelchen, die mit zwei Proteinen immobilisiert sind, die dazu neigen, zu interagieren, um potenzielle kleine Moleküle zu screenen, die Proteininteraktionen hemmen.

Amplifizierter lumineszierender homogener Proximity-Assay: Ein bead-basierter Proximity-Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen

Eines der schwierigsten Stressbedingungen, die Organismen im Laufe ihres Lebens zu begegnen bedeutet die Anhäufung von Oxidantien. Bei oxidativem Stress Zellen auf Molekulare Chaperone angewiesen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zu untersuchen, die Redox-regulierte Anti-Aggregation Tätigkeit, als auch strukturelle Veränderungen, die EZB der Chaperon-Funktion mit HDX-MS zu überwachen.

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.

Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren

SAMHD1 ist eine Desoxynukleosidtriphosphat-Triphosphohydrolase, die eine entscheidende Rolle bei der menschlichen Gesundheit und Krankheit spielt. Hier stellen wir einen vielseitigen enzymgekoppelten SAMHD1-Aktivitätsassay vor, der in einem 384-Well-Mikrotiterplattenformat eingesetzt wird und die Evaluierung von kleinen Molekülen und Nukleotidanaloga als SAMHD1-Substrate, Aktivatoren und Inhibitoren ermöglicht.

Ein Hochdurchsatz-Assay mit enzymgekoppelter Aktivität zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit der dNTPase SAMHD1

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung von Glutathion-verknüpften Spenderperlen mit GST-verschmolzenen TPR-Motiv-Co-Chaperonen und Akzeptorperlen in Verbindung mit einem Hsp90-abgeleiteten Peptid vor. Wir haben diese Technik verwendet, um kleine Moleküle zu screenen, um Hsp90-FKBP51- oder Hsp90-FKBP52-Interaktionen zu stören, und potente und selektive Hsp90-FKBP51-Interaktionshemmer identifiziert.

Untersuchungen von Chaperon-Cochaperon-Interaktionen mit homogenem Bead-based Assay

Dieses Protokoll zeigt die Chaperon-Aktivität des Hitzeschockproteins 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-Zellen dienen als Modell für den Assay, da sie ein natives, funktionell beeinträchtigtes Hsp70 beherbergen, was sie anfällig für Hitzestress macht. Die heterologe Einführung von funktionellem Hsp70 rettet die Wachstumsschwäche der Zellen.

Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70

Dieses Protokoll führt eine fluorometrische Screening-Methodik ein, die zur Identifizierung von Inhibitoren der Proteinsynthese von Naturprodukten oder kleinen Molekülen optimiert ist. Seine Praktikabilität eignet es sowohl für die Grundausbildung in Arzneimittelforschungstechniken als auch für die Anwendung in Kampagnen der Arzneimittelchemie.

Ein fluoreszenzbasiertes Protokoll zur vorläufigen Screening von Proteinsyntheseinhibitoren aus natürlichen Quellen

Lernen Sie den Malachit-Grün-Assay zur Entdeckung von Hsp90-Inhibitoren in der Krebsforschung kennen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Screening-Analyse von ATPase-Aktivitäten.

Malachit-Green-Assay zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Inhibitoren

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