Name: Ein menschliches Knochenmark-3D-Modell zur Untersuchung der Dynamik und Interaktionen zwischen residenten Zellen in physiologischen oder tumoralen Kontexten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines standardisierten menschlichen Knochenmark-3D-Modells mit vaskulären und mesenchymalen Zellen. Diese Methode ermöglicht bildgebende und molekulare Analysen für biomedizinische Forschung.

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Wir danken P. Battiston-Montagne und A. Jambon von der CRCL-Zytometrie-Plattform sowie N. Gadot und C. Leneve von der Plattform für Forschungspathologie, Abteilung für translationale Forschung und Innovation, Centre Léon Bérard. Die Autoren danken B. Manship für die englische Ausgabe. Diese Arbeit wurde von Inserm und FI-LMC an V. M. S. finanziert, und S. L. K. A. und L. B. wurden durch ein Stipendium der Société Française d'Hématologie unterstützt.

HINWEIS: Um die knochenmarkartige Rückgratstruktur vorzubereiten, beruht dieses Protokoll auf der Kombination von Perlen mit HMEC-1-Endothelzellen und HS27A-Stromazellen auf biphasischen Calciumphosphat (BCP) -Perlen. Die BCP-Perlen dienen als Gerüst, das mit einem bestimmten Medium die 3D-Strukturformung ermöglicht.
1. Perlenaufbereitung und Sterilisation
<ol><li>Wiegen Sie 35-40 mg BCP-Perlen (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) für jeden Einsatz (kleine, zylindrische Kunststoffschale mit einer Polycarbonatmembran an der Unterseite) in einem 1,5-ml-Röhrchen (siehe Materialtabelle). Bohren Sie nach dem Wiegen der Perlen ein kleines Loch mit einer sauberen Nadel durch die Oberseite des 1,5-ml-Röhrchens, um ein Aufspringen des Deckels während des Autoklavenzyklus (121 °C für 60 Minuten) zu vermeiden, und legen Sie die Röhrchen in vertikaler Position in eine geschlossene sterile Box .</li>
</ol>2.3D Einsatzvorbereitung unter einer sterilen Haube
<ol><li>Legen Sie sterile Polycarbonat-Zellkultureinsätze in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Gießen Sie sterile BCP-Perlen aus einem 1,5-ml-Röhrchen in den Einsatz. Waschen Sie die Perlen sorgfältig, indem Sie 350 μL 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den Einsatz tropfen und dann 4,5 ml 1x PBS in die Vertiefung geben. Entfernen und entsorgen Sie das PBS entweder mit Vakuum oder einer 5-ml-Pipette, indem Sie die Spitze in eine Ecke des Vertiefungs legen. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.</li>
	<li>Sobald die Perlen gewaschen sind, verwenden Sie 1x PBS, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), um das System zu blockieren. Geben Sie vorsichtig 350 μL der Blockierlösung in den Einsatz und 4,5 ml in die Vertiefung und legen Sie die gesamte Platte über Nacht in einen Inkubator bei 37 °C, 5% CO2 . HINWEIS: Die Schritte 2.1 und 2.2 helfen, die Ionenfreisetzung aus BCP-Perlen vor der Zellaussaat zu minimieren.</li>
</ol>3. Zelllinienernte und 3D-Wartung
HINWEIS: Nach diesem Inkubationsschritt werden Mikroumweltzellen hinzugefügt, um das 3D-Strukturrückgrat zu bilden. Dieses System basiert auf der Verwendung von HMEC-1, menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen, die mit einem großen T-Antigen aus SV40 verewigt wurden, und HS27A, menschlichen Knochenmarkstromazellen, die mit humanen Papillomaviren verewigt wurden, aufgrund ihrer Fähigkeit, eine feste BM-ähnliche Struktur zu bilden, und ihrer Kompatibilität mit dem Einschluss von Endothelzellen.
<ol><li>Bevor Sie dem System Zellen hinzufügen, bereiten Sie die folgenden Inkubationsmedien vor:<ol><li>Für 50 ml komplettes Osteo Differentiation Medium (ODM) mischen Sie 45 ml modifiziertes Adlermedium (DMEM) von Dulbecco + 5 ml FBS + 0,5 ml Penicillin-Streptomycin + 8 × 10-4 mg/L Dexamethason + 2,16 g/L Beta-Glycerophosphat + 44 mg/L Ascorbinsäure.</li>
		<li>Für 50 ml vollständiges HMEC-1-Medium mischen Sie 45 ml MCDB 131 + 5 ml FBS + 0,5 ml Penicillin-Streptomycin + 1% Glutaminersatz + 1 mg / L Hydrocortison + 10 μg / L EGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie die blockierende Lösung aus dem System. Mischen Sie 1 × 10 6 HMEC-1-Zellen (die das vaskuläre Kompartiment darstellen) und 2 × 106 HS27A-Zellen (die das mesenchymale Stromazellkompartiment darstellen) in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 1.575 × g bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 175 μL HMEC-1-Medium (spezifisches Medium für HMEC-1-Zellwachstum) mit 175 μL ODM (spezifisches Medium für HS27A-Osteodifferenzierung) hinzu.</li>
	<li>Gießen Sie 350 μL dieser Suspension mit insgesamt 3 × 106 Zellen in jeden Einsatz. Dann gießen Sie 4,5 ml des kombinierten Mediums (2,25 ml HMEC-1-Medium + 2,25 ml ODM) ohne Zellen in die Vertiefungen der Platte. Saugen Sie die Mischung vorsichtig ab und dosieren Sie sie mehrmals mit einer 1-ml-Mikropipette, um die Zellen und BCP-Perlen im Einsatz zu homogenisieren. Ordnen Sie die gesamte Mischung zu, um sich am Boden des Einsatzes abzusetzen. HINWEIS: Eine Mischmischung mit einem Totvolumen wird empfohlen, wenn mehrere Einsätze kultiviert werden. Wenn beispielsweise vier Einsätze kultiviert werden, bereiten Sie immer das Volumen vor, das für fünf Einsätze erforderlich ist.</li>
	<li>Sobald die Endothel- und Mesenchymzellen im Inneren des Einsatzes homogenisiert sind, halten Sie die 6-Well-Platte 3 Wochen lang in einem Inkubator bei 37 °C, 5% CO2 . Wechseln Sie das Medium im Inneren des Einsatzes und des Vertiefungs 2x pro Woche, indem Sie das Medium vorsichtig mit einer 1-ml-Mikropipette aus dem Einsatz entfernen und die Spitze an der inneren Einsatzwand platzieren, um eine Störung der Ecke des Einsatzes zu vermeiden. HINWEIS: Der gewonnene Überstand kann bei jedem Schritt bei -80 °C zur späteren Proteinquantifizierung gespeichert werden.</li>
</ol>4. Hinzufügen von Zellen von Interesse in das System
HINWEIS: Nach 3 Wochen HMEC-1- und HS27A-Kultivierung ermöglichte die Osteodifferenzierung von HS27A-Zellen die Versteifung des Systems. Fügen Sie in diesem Schritt hämatologische Zellen von Interesse hinzu (Anzahl der hinzugefügten Zellen kann von 1 × 104 bis 1 × 106) innerhalb des Einsatzes variieren. Die hinzugefügten Zellen waren TF1-Zellen, die mit BCR-ABL-Onkogen transfiziert wurden, und primäre einkernige CD34+ -Zellen, die entweder von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder gesunden Spendern stammten.
<ol><li>Ändern Sie die Mediumzusammensetzung in diesem Schritt, da die ODM-Verbindung für hämatologische Zellen toxisch ist und es nicht notwendig ist, sie weiter hinzuzufügen, sobald die Systemversteifung abgeschlossen ist. Um beispielsweise die hämatopoetische Aufrechterhaltung zu unterstützen, ersetzen Sie ODM-Medium durch vollständiges RPMI für hämatopoetische Zelllinien (RPMI ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) oder IMDM für primäre hämatopoetische Zellen. Bereiten Sie eine Charge mit 50 % vollständigem HMEC-1-Medium und 50 % vollständigem RPMI/IMDM-Medium für den wöchentlichen Wechsel des 3D-Mediums vor.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die hämatologischen Zellen von Interesse in diesem Kombinationsmedium und fügen Sie es in den Einsatz ein. Wenn ein medikamentöses Behandlungsprotokoll erforderlich ist, warten Sie 24 Stunden nach dem Hinzufügen der interessierenden Zellen vor der Behandlung, um ihnen Zeit zu geben, an der knochenartigen Struktur zu haften.</li>
	<li>Passen Sie den Zeitraum der 3D-Zellkultur den Anforderungen entsprechend an. Aktualisieren Sie das Medium (50 % HMEC-1 vollständiges Medium + 50 % RPMI vollständiges Medium) zweimal pro Woche. HINWEIS: Im Laufe der 3D-Zellkultur können einige adhärente Zellen außerhalb des Einsatzes in den Boden der Vertiefungen austreten, was den Medienverbrauch erhöht. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop die Zelldispersion über den Einsatz hinaus und setzen Sie den Einsatz bei Bedarf in eine neue 6-Well-Platte unter einer sterilen Haube ein.</li>
</ol>5.3D knochenmarkähnliche experimentelle Ergebnisse
HINWEIS: Nach der 3D-Kultivierung können je nach den Zielen des Experiments mehrere Ergebnisse erzielt werden.
<ol><li>Proteinanalytik HINWEIS: Im Laufe des 3D-Experiments können die Proteine, die von den Zellen in der knochenmarkartigen Struktur abgesondert werden, für weitere Analysen gesammelt werden.<ol><li>Wenn das Kulturmedium 2x pro Woche gewechselt wird, lagern Sie den gewonnenen Überstand aus dem Inneren des Einsatzes bei -80 °C, um die Produktion von Proteinen von Interesse innerhalb des Systems zu bewerten.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissoziation von Zellen von der 3D-Struktur (unter einer sterilen Haube, wenn Zellen sortiert werden müssen) HINWEIS: Die im 3D-Knochenmark-ähnlichen System kultivierten Zellen können entnommen, sortiert und weiter analysiert werden.<ol><li>Am Ende des Experiments mischen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 4,5 ml RPMI mit 0,5 ml FBS, ergänzt mit 0,4 mg / ml Kollagenase, und erwärmen Sie die Lösung bei 37 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Stellen Sie den Einsatz kopfüber (weiße Membranseite oben) auf eine sterile 6-Well-Plattenabdeckung, um die Membran richtig auszuschneiden. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die Membran von den Seiten zu schneiden und so eine weiße feste Scheibe zu erhalten. Legen Sie die Scheibe in das warme 15-ml-Röhrchen, das in Schritt 5.2.1 vorbereitet wurde.</li>
		<li>Das Röhrchen in ein aktives Rad in einen 37 °C Inkubator geben und 10 min inkubieren, um die Verdauung (in Kontakt mit Kollagenase) zu ermöglichen. Wenden Sie für alle Membranen die gleiche Inkubationszeit an, um eine verzerrte Analyse zu vermeiden.</li>
		<li>Nach 10 min zentrifugieren Sie das 15-ml-Röhrchen für 5 min bei 1.575 × g bei Raumtemperatur, entsorgen den Überstand und resuspendieren das Pellet in 5 ml warmem 1x PBS. HINWEIS: Da die Polycarbonatmembran in diesem Schritt im Allgemeinen in der überstehenden Fraktion schwimmt, kann sie mit einer sterilen Pipettenspitze verworfen werden. Wenn die Membran noch im Pellet enthalten ist, lassen Sie sie stehen und entfernen Sie sie am Ende des nächsten Schritts.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 300 μL warmem Trypsin, wirbeln Sie das Röhrchen für 10 s und legen Sie es für 1 min in ein 37 °C warmes Wasserbad.</li>
		<li>Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie 1 ml warmes, reines FBS hinzufügen. Mit einer 1-ml-Mikropipette das Medium mechanisch absaugen und dosieren, um die Scheibe vollständig zu dissoziieren. ACHTUNG: Der Aspirations-/Dosierschritt muss sehr schnell sein, da sich sonst die Perlen in der Spitze absetzen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen für 5 min bei 1.575 × g. Resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml 1x PBS, ergänzt mit 10% FBS.</li>
		<li>Lassen Sie die Perlen 5 s sedimentieren, bevor Sie den Überstand auffangen und durch ein 35-μm-Zellsieb filtern, das auf einem Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie das gewonnene Filtrat für 5 min bei 1,575 × g. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau, um die Lebensfähigkeit zu bewerten, und fahren Sie mit durchflusszytometrischen Analysen fort. HINWEIS: Die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die nach der Trypanblau-Inkubation gewonnen werden, beträgt ~ 1-2 × 105 Zellen pro verdautem Einsatz.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchflusszytometrische Markierung von gewonnenen Zellen HINWEIS: Die aus der 3D-Knochenmark-ähnlichen Struktur gewonnenen Zellen können durch Durchflusszytometrie markiert und weiter analysiert werden. Verwenden Sie eine Mischung von Antikörpern, um die verschiedenen Kompartimente nach der 3D-Dissoziation zu erkennen. Hier wurden CD45 (färbt die hämatologischen Zellen von Interesse), CD31 (färbt das vaskuläre Kompartiment) und CD73 (färbt das osteoblastische Kompartiment) bei 1 μL in 50 μL PBS + 2% FBS verwendet. Halten Sie alle vorbereiteten Zellen und Antikörper während des gesamten Prozesses auf Eis (4 °C) lichtgeschützt.<ol><li>Resuspendieren Sie die Pellets in der Antikörpermischung und inkubieren Sie für 30-40 min auf Eis vor Licht geschützt.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml PBS + 2% FBS hinzu, um die Zellen zu waschen, und zentrifugieren Sie für 5 min bei 1.575 × g.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das zurückgewonnene Pellet in 200 μL 1x PBS + 10% FBS, ergänzt mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, verdünnt 1:2.000).</li>
		<li>Analysieren Sie die Röhrchen in einem Zytometer mit den folgenden Parametern: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Verwenden Sie ein FSC-H- versus FSC-W-Diagrammdiagramm, um die Singulett-Population zu gate. Verwenden Sie in der Singulettfraktion ein DAPI-A- versus FSC-A-Diagramm, um die lebensfähige Zellpopulation (DAPI-negativ) zu bestimmen. Wenn die DAPI-negative Grundgesamtheit zuvor abgegrenzt wurde, verwenden Sie ein APC-A- versus FSC-A-Diagramm, um die CD45-positive Grundgesamtheit zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixierung der 3D-knochenmarkartigen Struktur HINWEIS: Die Fixierung der 3D-BM-ähnlichen Struktur wird im Allgemeinen für Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz durchgeführt, um Zellen in situ zu visualisieren und für weitere spezifische Färbungen.<ol><li>Um die BM-ähnliche Struktur zu fixieren, übertragen Sie den Einsatz (Schritt 4.3) von der alten Platte auf eine neue 6-Well-Platte, die mit 1x PBS gefüllt ist. Ersetzen Sie dann vorsichtig das Medium im Einsatz mit 1x PBS. HINWEIS: Spülen Sie die geformte Struktur nicht mit PBS; der Druck der Flüssigkeit kann die 3D-Struktur beeinträchtigen.</li>
		<li>Sobald der Einsatz gewaschen ist, legen Sie ihn in eine neue 6-Well-Platte und füllen Sie sowohl die Vertiefung als auch den Einsatz mit frisch geöffnetem Paraformaldehyd (PFA) 4% (verdünnt 16% in 1x PBS).</li>
		<li>Lassen Sie den Fixierungsprozess 4 Stunden bei Raumtemperatur ohne Licht ablaufen.</li>
		<li>Am Ende des Fixiervorgangs den Einsatz einmal mit 1x PBS waschen und bei 4 °C lichtgeschützt lagern.</li>
		<li>Schneiden Sie die Membran an der Unterseite des Einsatzes wie in Schritt 5.2.2 beschrieben ab, um die feste Festplatte zu erhalten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Scheibe 4x für 48 h in EDTA (0,5 M, pH 8), um die Struktur zu entkalken.</li>
		<li>Die Struktur in Paraffin einbetten und 4 μm dicke Abschnitte schneiden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit Anti-CD45-, Anti-CD73- und Ki67-Antikörpern mit einem automatisierten Immunfärber. Visualisieren Sie die Färbung mit einer Anti-Kaninchen- oder -Maus-Meerrettichperoxidase (HRP) und mit 3,3'-Diaminobenzidin als chromogenes Substrat und Gegenfärbung mit Gill-Hämatoxylin.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Eine der aktuellen Herausforderungen für Studien zu physiologischen und damit verbundenen pathologischen Fragen des Menschen ist der Mangel an Modellen, die die komplexen Funktionen menschlicher Organe genau nachahmen. Im Falle von menschlichen BM-3D-Modellen verwenden viele Modelle Hydrogele und reproduzieren den BM teilweise, was die Leistungsfähigkeit der 3D-Kulturbedingungen im Vergleich zu klassischen 2D-Kulturen veranschaulicht, um beispielsweise eine bessere osteoblastische Differenzierung zu gewährleisten27,28. Trotz guter Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit ahmen diese Systeme jedoch nicht die menschliche BM 3D-Struktur und -Architektur nach, was weitere Analysen erheblich beeinflussen kann. Technologische Fortschritte haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die einheimische humane osteoblastische Nischenumgebung mit einem perfusionsbasierten Bioreaktorsystem besser zu reproduzieren, um einige HSC-Eigenschaften beizubehalten29. Die Entwicklung mikrofluidischer Bauelemente hat zu neuen Ansätzen zur Reproduktion einer relevanten knochenmarkartigen Struktur geführt, bisher jedoch nur begrenzte Eigenschaften des Knochenmarks erreicht und daher eingeschränkte Anwendungen 30,31,32,33.
Fortschritte in den Materialwissenschaften haben zur Entwicklung einer breiten Palette natürlicher oder synthetischer Biomaterialien beigetragen, die zur Entwicklung relevanter 3D-Knochenkultursysteme verwendet werden können. Solche Systeme sind jedoch manchmal schwierig in biologischen Standardlaboratorien ohne interne Kenntnisse in Biophysik zu entwickeln. Darüber hinaus erreichen diese Systeme in den meisten Fällen eine begrenzte Fähigkeit, die 3D-Struktur des menschlichen Knochens, einschließlich der BM-Mikroumgebung, nachzuahmen, und haben große Mengen an Zytokinen und Wachstumsfaktoren verwendet, wodurch ein künstlich reiches Kulturmedium geschaffenwurde 34.
Die Entscheidung, eine osteoblastische Differenzierung anstelle einer adipozytären Differenzierung zu induzieren, beruhte auf der Tatsache, dass Präosteoblasten und Osteoblasten als Teil der endostealen Nischebeschrieben wurden 35. Dies identifizierte osteoblastische Zellen als gewünschte Bestandteile von Knochen und Knochenmark. Unter den zellulären Bestandteilen des Knochenmarks nehmen Endothel- und Stromazellen einen großen Teil der Mikroumgebung ein. Darüber hinaus produzieren diese beiden Zelltypen strukturelle nicht-zelluläre Komponenten der extrazellulären Matrix und Zytokine, die an der Regulation der Homöostase und Differenzierung beteiligt sind, die hier zur Erzeugung einer verkalkten Struktur angefordert werden. Dies rechtfertigt daher die Verwendung von Endothel- und Stromazellen und unsere Wahl der Zelllinien, um einen einfachen Zugang zu ermöglichen und die Reproduzierbarkeit zwischen Laboren zu erhöhen. Da die Kultur der HMEC-1-Linie im Laufe der Zeit stabiler war, wurde diese Zelllinie für die Entwicklung des 3D-Systems beibehalten. Für Stromazellen verglichen wir in 2D-Kultur die Osteoblasten-Differenzierungskapazität der Stromazelllinien, die aus normalem Knochenmark stammen: HS5 und HS27A. Wir fanden heraus, dass die HS5-Linie nicht so stark differenzierte wie die HS27A-Linie im 3D-System, das mit beiden Zelllinien erzeugt wurde. In dieser Hinsicht haben Versuche, HS27A-Zellen durch die HS5-Linie zu ersetzen, zur Herstellung einer weniger steifen Struktur geführt, was darauf hindeutet, dass HS27A besser geeignet ist.
Sowohl HS27A- als auch HMEC-1-Zelllinien wurden in verschiedenen Medienkombinationen kultiviert, wobei man die beste starre Struktur und Ausrichtung von HMEC-1 entlang von Osteoblastenstrukturen hervorruft, so dass die Produktion der extrazellulären Matrix eine relative Steifigkeit in die Grundstruktur bringt. Die Analyse des Fortschritts der Differenzierung bei D14 zeigte, dass die Differenzierung bei D21 (Messung von BSP, spätosteoblastischem Marker) weiter fortgeschritten war, mit einem Verhältnis von 1:2 für HMEC-1:HS27A und mit besseren Ergebnissen, wenn 2 × 106 HS27A eingeführt wurden. Endothelzellen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Homöostase und Differenzierung (u.a. durch die Zufuhr von Zytokinen). Die Tatsache, dass HMEC-1-Zellen in diesem System erhalten bleiben, deutet darauf hin, dass sie zumindest diese Rolle erfüllen können, und dies trägt zur Legitimität unseres Modells bei. Für die HMEC-1-Endothellinie war es wichtig, sie früh genug einzuführen, damit sie richtig in die Struktur integriert werden kann und in der Hoffnung, dass diese Zellen Ausrichtungen oder sogar Röhrchen innerhalb der Struktur bilden können. Kokulturtests von HS27A und HMEC-1 wurden durchgeführt, indem letztere in verschiedenen Stadien eingeführt wurden: D0, D7, D14; Es wurden keine nennenswerten Unterschiede beobachtet, weder in der Differenzierung der Stromazellen noch in der Aufrechterhaltung oder Positionierung der Endothelzellen. Daher wurden diese Zellen zu Beginn des Prozesses eingeführt. Hämatopoetische Zellen wurden zu einer Zeit eingeführt, als die osteoblastische Differenzierung weit genug fortgeschritten war, um Zell-Zell-Interaktionen zu begünstigen. Diese Wahl wurde auch durch die Tatsache bedingt, dass diese osteoblastische Differenzierung durch die Verwendung eines Mediums bedingt ist, das nach unseren Tests die Aufrechterhaltung der hämatopoetischen Zellen nicht vollständig unterstützt. Hämatologische Zellen können entweder Zelllinien oder primäre BM CD45 hämatopoetische Zellen sein.
Aus diesem 3D-Modell könnten wir uns vorstellen, jeden Zelltyp durch normale oder pathologische Primärzellen zu ersetzen oder sogar andere Zelltypen hinzuzufügen, um biomimetische Eigenschaften wie Immunzellen, Adipozyten oder Fibroblasten zu verstärken26. Tatsächlich wurde die HS27A-Zelllinie durch primäre BM-MSCs mit geringem Passaging ersetzt. In ähnlicher Weise wurden hämatologische Zelllinien durch primäre BM-hämatopoetische Zellen ersetzt. Der Ersatz von HMEC-1-Zellen durch primäre Endothelzellen wurde jedoch noch nicht getestet. Derzeit könnte dieses Modell in Bezug auf die Darstellung des Gefäßsystems noch verbessert werden, da Endothelzellen zwar vorhanden sind und korrekt mit anderen Zellen aus der Mikroumgebung (z. B. hämatopoetischen Zellen) interagieren, aber keine strukturierten Gefäße bilden, wodurch eine Flussperfusion zur Nachahmung funktioneller Blutgefäße ausgeschlossen wird. Insgesamt könnte dies die Komplexität und Repräsentativität des aktuellen minimalen 3D-Modells schrittweise erhöhen. Die Hinzufügung anderer Zelltypen kann Studien erleichtern, die andere Fragen untersuchen, wie die Bedeutung einer lokalen BM-Entzündung oder der Resistenz gegen Immuntherapie.
Dieses 3D-System benötigt jedoch 3 Wochen, bevor Zellen von Interesse, hämatologische Zellen oder Epithelkrebszellen, wenn der Metastasierungsprozess ausgewertet wird, hinzugefügt werden können. Sterile Bedingungen müssen aufrechterhalten werden, da ein zweimal wöchentlicher Medienwechsel manchmal zu einer mittleren Kontamination führen kann. Da einige Zellen durch die Poren des Einsatzes wandern und sich in den Brunnen verteilen können, was zu einem erhöhten Medienverbrauch führt, wird eine regelmäßige Überwachung empfohlen.
Wir haben hier ein 3D-Gerüst beschrieben, das eine osteoblastische Differenzierung ermöglicht, und eine relevante, in vitro , 3D, humane BM-ähnliche Mikroumgebung entwickelt. Dieses System ermöglicht die In-situ-Analyse und die ultimative Entnahme lebender Zellen. Dieses System bietet ein neues und hochflexibles, reproduzierbares und benutzerfreundliches Werkzeug mit einer breiten Palette von Anwendungen zur Untersuchung von Interaktionen und Mechanismen innerhalb der menschlichen BM-Mikroumgebung.

Knochenmark (BM) befindet sich sowohl in den zentralen Hohlräumen von axialen und langen Knochen als auch in trabekulären flachen Knochen und enthält eine Vielzahl von unterschiedlichen zellulären und nicht-zellulären Komponenten. Auf struktureller Ebene besteht es aus hämatopoetischen Gewebeinseln (auch "Hämatons" genannt)1,2 und Fettzellen, die von Gefäßhöhlen umgeben sind, die im trabekulären Knochen eingestreutsind 3. In langen und flachen Knochen sind die Blutversorgung des Knochens und des Knochenmarks durch ein endosteales Netzwerk von Gefäßen miteinander verbunden4. Versteckt in diesem festen Schutznetzwerk beherbergt der BM sehr unreife Zellen, die in ein schwammiges Stroma eingetaucht sind, und bildet den Ort für die Differenzierung von residenten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)5. In der Tat, abgesehen von der Erneuerung von Knochengewebe durch die Produktion von Osteoblasten, liegt eine der wichtigsten bekannten Funktionen des BM in der HämatopoeseEntwicklung 6.
Das BM-hämatopoetische Gewebe umfasst eine Vielzahl von Zelltypen, nämlich HSZ, Vorläufer und differenziertere Blutzellen wie Lymphozyten, Neutrophile, Erythrozyten, Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten7. Hämatopoetische Zellen sind nicht zufällig im BM-Raum angeordnet, sondern zeigen eine bestimmte Organisation innerhalb der hämatopoetischen Nischen, die viele Zelltypen unterschiedlicher Herkunft umfassen (Osteoblasten, Osteoklasten, MSCs, Adipozyten, sinusförmige Endothel- und perivaskuläre Stromazellen, Immunzellen, Nervenzellen und verschiedene reife hämatopoetische Zellen), die eine komplexe Struktur bilden, um eine normale Hämatopoese zu gewährleisten8 . Die biologischen Funktionen der hämatopoetischen Nische umfassen die Regulation des HSC-Überlebens, der Adhäsion, der Ruhe, des Homings und der Differenzierung durch verschiedene Mechanismen (Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, Produktion löslicher Faktoren, Hypoxie) als Reaktion auf multiple physiologische oder nicht-physiologische Belastungen 3,6. Obwohl diese hämatopoetischen Nischen zunächst als homogene Einheiten wahrgenommen wurden, haben technologische Fortschritte wie Einzelzell- und Bildgebungsanalysen nach und nach ihre Komplexität, Dynamik und adaptiven Eigenschaften offenbart 9,10,11.
Die entscheidende Notwendigkeit, den Einsatz von Tieren zur Entschlüsselung menschlicher physiologischer und pathologischer Prozesse zu ersetzen und zu reduzieren, führt zu neuen Chancen und Herausforderungen11,12. Unter den neu beschriebenen In-vitro-Werkzeugen wurden dreidimensionale (3D) Modelle vorgeschlagen, die das menschliche BM in vivo besser nachahmen als klassische zweidimensionale (2D) Kulturen 13,14,15,16,17. Die 3D-Modellierung scheint daher ein vielversprechender Ansatz zu sein, um Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen zu beobachten, die näher an denen in vivo liegen. Mit einer Vielzahl dieser Modelle haben einige Teams das Überleben und die Verbreitung von HSCs18,19 nachgewiesen. Es stehen mehrere 3D-Modelle zur Verfügung, wobei der gebräuchlichste Ansatz die Verwendung von Gerüst-basierten 3D-Biomaterialien wie Hydrogelen, Kolloiden oder Kollagenen ist, die mit MSCs assoziiert sind, die ihre osteoblastischen Liniendifferenzierungskapazitäten20,21,22 nutzen. Dennoch wurde keine globale Übereinstimmung erzielt, alle Anforderungen für Studien an menschlichen Zellen benutzerfreundlich und standardisiert zu erfüllen23, zumal diese aktuellen 3D-Systeme hauptsächlich auf primären Stromazellen beruhen und daher unter eingeschränktem Zugang zu Primärproben, Gewebeverfügbarkeit und Heterogenität leiden.
Zusätzlich sollte das Endothelzellkompartiment eingeführt werden, da diese Zellen einen Hauptbestandteil der Zell-Zell-Interaktionen darstellen und am Schicksal der Stammzellen und der Entwicklung der BM-Erkrankung beteiligt sind, sowohl bei Leukämie24 als auch bei Metastasen25. Wir berichteten zuvor, dass die Zugabe pathologischer Elemente in einem standardisierten menschlichen 3D-Knochenmarkmodell Merkmale rekapituliert, die in Patientenproben beobachtet wurden, wie z. B. extrazelluläre Matrix (ECM) -Veränderungen26. Um die Dynamik und Interaktionen zwischen der menschlichen BM-Mikroumgebung und den residenten Zellen besser zu verstehen, stellen wir ein detailliertes Protokoll für ein benutzerfreundliches und standardisiertes System zur Verfügung, um eine minimale, gut organisierte, BM-ähnliche Struktur aufzubauen. Dieses System besteht aus drei menschlichen Knochenmarkzelltypen - Endothelzellen und Stromazellen, die die Mikroumgebung darstellen, und HSZ. Durch die Verwendung spezifischer Perlen als Gerüst und osteoblastisches Differenzierungsmedium wird die erhaltene 3D-Struktur die menschliche medulläre Nische nachahmen, was eine praktische Untersuchung des menschlichen Knochenmarks ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>3,3-Diaminobenzidin (DAB) Flüssigsubstrat System</td><td>MERCK SIGMA</td><td>D7304</td><td>IHC-Färbung</td></tr><tr><td>5 mL Pipette</td><td>SARSTEDT</td><td>861253001</td><td>Mediumwechsel</td></tr><tr><td>Anti Maus HRP</td><td>Thermofisher</td><td>62-6520</td><td>IHC Sekundärfärbung</td></tr><tr><td>Anti Kaninchen HRP</td><td>Thermofisher</td><td>31460</td><td>IHC Sekundärfärbung</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure 250 &mu; M</td><td>MERCK SIGMA</td><td>A92902</td><td>ODM Medium</td></tr><tr><td>BCP</td><td>CaP Biomaterials LLC-US</td><td></td><td>3D</td></tr><tr><td>Beads Beta Glycerophosphate 10 mM</td><td>MERCK SIGMA</td><td>G9422</td><td>ODM medium</td></tr><tr><td>CD31-BV711</td><td>BD</td><td>744078</td><td>3D endotheliale Zellpopulationsmarkierung</td></tr><tr><td>CD34-APC</td><td>BD</td><td>555824</td><td>3D unreife hämatologische Zellpopulationsmarkierung</td></tr><tr><td>CD38-PE-Cy5</td><td>BD</td><td>555461</td><td>3D-Vorläufer hämatologische Zellpopulationsmarkierung</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-110-637</td><td>IHC-Färbung hämatologischer Zellen</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD</td><td>555485</td><td>3D-Hämatologie Zellpopulationsmarkierung</td></tr><tr><td>CD45-BV500</td><td>BD</td><td>560777</td><td>3D-Hämatologie Zellpopulationsmarkierung</td></tr><tr><td>CD73</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-120-066</td><td>IHC-Färbung des Stromakompartiments</td></tr><tr><td>CD73-BV605</td><td>BD</td><td>563199</td><td>3D osteoblastische Zellpopulationsmarkierung</td></tr><tr><td>Zellstämme Sieb für FACS-Geräte mit 5-ml-Röhrchen</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td>Sieb und Röhrchen zur Entnahme der Zellen und zur Beseitigung von Kügelchen</td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>MERCK SIGMA</td><td>C2674-1G</td><td>3D enzymatische Dissoziation</td></tr><tr><td>Zytometrie Filtrationsröhrchen</td><td>Thermofisher</td><td>10585801</td><td>Filtration von 3D-Zellen</td></tr><tr><td>Zytometrieröhrchen</td><td>Thermofisher</td><td>10100151</td><td>Markierung von 3D-entnommenen Zellen</td></tr><tr><td>DAPI (Lösung 12)</td><td>Chemometec</td><td>910-3012</td><td>3D-zurückgewonnene lebensfähige Zellen Markierung</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Thermofisher</td><td>A13449</td><td>ODM Medium</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat 500 mL</td><td>Thermofisher</td><td>31966021</td><td>ODM Medium</td></tr><tr><td>EGF</td><td>MERCK SIGMA</td><td>E9644-0,2MG&nbsp;</td><td>HMED-1 mittel</td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL Röhrchen</td><td>SARSTEDT</td><td>72696</td><td>Für Kügelchen Autoklav und Überstand</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>Für 3D Dissoziation</td></tr><tr><td>FBS</td><td>DUTSCHER</td><td>S1900-500</td><td>Zur Ergänzung des Kultivierungsmediums und zur Beendigung der Trypsinwirkung</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>A1286001</td><td>Glutaminersatz für HMED-1 Medium</td></tr><tr><td>Hämatoxylinlösung, Gill Nr. 1</td><td>MERCK SIGMA</td><td>GHS132-1L</td><td>IHC-Färbung</td></tr><tr><td>HMEC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>3D-Endothelzellpopulation&nbsp;</td></tr><tr><td>HS27A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td>3D osteoblastische Zellpopulation&nbsp;</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>MERCK SIGMA</td><td>H0135-1MG</td><td>HMED-1 Medium</td></tr><tr><td>Einsatz: Nunc Polycarbonat-Zellkultureinsätze in Multi-Well-Platten</td><td>THERMO SCIENTIFIC NUNC</td><td></td> 140627 <td>Zur Gewinnung von Zellen und zur Bildung einer 3D Knochenähnliche Struktur</td></tr><tr><td>KI-67 IHC</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-14520</td><td>IHC-Färbung von proliferativen Zellen</td></tr><tr><td>MCDB 131 Medium, kein Glutamin</td><td>Thermofisher</td><td>10372019</td><td>HMED-1</td></tr><tr><td>mittlere Mikropipette (1.000 & Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 4924000088</td><td>Mediumwechsel</td></tr><tr><td>PBS D 1x</td><td>Thermofisher</td><td>14190169</td><td>Zellen/ Einsatzwaschmittel</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Zur Ergänzung des Kulturmediums&nbsp;</td></tr><tr><td>PFA (Formaldehyd 16%)</td><td>EUROMEDEX</td><td>EM-15710</td><td>3D Fixierung (Verdünnung mit PBS 1X)</td></tr><tr><td>RMPI 1640 Medium, Glutamax Supplement</td><td>Thermofisher</td><td>61870044</td><td>Cuture</td></tr><tr><td>Medium Skalpell</td><td>&nbsp; FISHER SCIENTIFIC 11768353</td><td></td><td>Schneiden von 3D-Membranen</td></tr><tr><td>FALCON</td><td>353046</td><td>3D-Kultur</td>mit<td>sechs Vertiefungen</td></tr><tr><td>TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x)</td><td>Thermofisher</td><td>25300096</td><td>enzymatische 3D-Dissoziation</td></tr></tbody></table>

ein menschliches knochenmark-3d-modell zur untersuchung der dynamik und interaktionen zwischen residenten zellen in physiologischen oder tumoralen kontexten

A Human Bone Marrow 3D Model to Investigate the Dynamics and Interactions Between Resident Cells in Physiological or Tumoral Contexts

Die Marknische ist ein komplexes Ökosystem, das für die Aufrechterhaltung der Homöostase für residente Zellen unerlässlich ist. Tatsächlich ist das Knochenmark, das eine komplexe extrazelluläre Matrix und verschiedene Zelltypen wie mesenchymale Stammzellen, Osteoblasten und Endothelzellen umfasst, durch direkte Zell-Zell-Interaktionen sowie die Zytokinproduktion stark an der Regulation hämatopoetischer Stammzellen beteiligt. Um diese In-vivo-Struktur genau nachzuahmen und Experimente durchzuführen, die die Reaktionen des menschlichen Knochenmarks widerspiegeln, wurden mehrere 3D-Modelle erstellt, die auf Biomaterialien basieren und sich hauptsächlich auf primäre Stromazellen stützen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, um ein minimales und standardisiertes System zu erhalten, das einfach einzurichten ist und Merkmale einer knochenmarkartigen Struktur aufweist, die verschiedene Zellpopulationen einschließlich Endothelzellen kombiniert und die Heterogenität von in vivo Knochenmarkgewebe widerspiegelt. Diese 3D-Knochenmark-ähnliche Struktur, die aus Calciumphosphat-basierten Partikeln und menschlichen Zelllinien zusammengesetzt ist und für die Mikroumgebung des Knochenmarks repräsentativ ist, ermöglicht die Überwachung einer Vielzahl biologischer Prozesse durch Kombination oder Ersatz verschiedener primärer Zellpopulationen innerhalb des Systems. Die endgültigen 3D-Strukturen können dann entweder für die Bildanalyse nach Fixierung, Paraffineinbettung und histologischer / immunhistochemischer Färbung zur Zelllokalisierung innerhalb des Systems geerntet oder dissoziiert werden, um jede zelluläre Komponente für die molekulare oder funktionelle Charakterisierung zu sammeln.

Mit diesem Protokoll ist es möglich, eine minimale, in vitro , 3D, humane BM-ähnliche Mikroumgebung zu rekapitulieren, aus der lebensfähige Zellen aus drei verschiedenen Zellkompartimenten gewonnen werden können (Abbildung 1). Tatsächlich können nach der gewünschten Exposition 3D-BM-ähnliche Strukturen dissoziiert und die MSCs, Endothelzellen und hämatopoetischen Zellen mittels Durchflusszytometrie bewertet/charakterisiert werden (Abbildung 2A). Bisher deuten die Ergebnisse darauf hin, dass es möglich ist, hämatologische Zellen für mindestens 6 Wochen innerhalb des 3D-Modells zu erhalten, bevor lebensfähige Zellen gewonnen werden (Abbildung 2B). Zukünftige Untersuchungen sind jedoch erforderlich, um die Grenze dieses 3D-Modells abzuschätzen. Darüber hinaus ist es bei Bedarf möglich, die HS27A-Zelllinie durch primäres normales Knochenmark (NBM) MSC oder akute myeloische Leukämie (AML) MSC in diesem 3D-BM-ähnlichen Modell zu ersetzen (Abbildung 2C) oder die hämatopoetische Zelllinie durch primäre HSZ zu ersetzen (Abbildung 2D). Darüber hinaus können bei der Analyse der Wechselwirkungen zwischen Zellkompartimenten oder der Lokalisierung spezifischer Marker von Interesse 3D-BM-ähnliche Strukturen fixiert und mit Paraffineinbettung und Immunchemie weiterverarbeitet werden. Beispielsweise wurde die Analyse von CD45 (hämatologisch) oder CD73 (MSC) Gehalten mit diesen 3D-Modellen durchgeführt (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Ersteinrichtung des menschlichen 3D-BM-ähnlichen Systems. Nach 3 Wochen Kokultur kann festes BM-ähnliches Gewebe gesammelt oder mit hämatopoetischen Zellen (wie im Beispiel) oder anderen Zelltypen ausgesät werden. Bei Bedarf kann nach der Anhaftung der Zellen zweimal pro Woche eine Behandlung hinzugefügt und mittlere Veränderungen durchgeführt werden. Am Ende des Experiments können BM-ähnliche Strukturen entweder fixiert und für Lokalisierungsstudien weiterverarbeitet oder dissoziiert werden, um den Zellinhalt zu bewerten. Abkürzungen: BCP = biphasisches Calciumphosphat; BM = Knochenmark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig02.jpg"> Abbildung 2: Gewinnung lebensfähiger Zellen aus verschiedenen Kompartimenten nach Kultur im BM-ähnlichen 3D-Modell. (A) Typisches Muster der Zellerholung aus einer dissoziierten BM-ähnlichen Struktur mit 9,84% lebensfähiger Zellen (DAPI-). Repräsentative Diagramme von hämatopoetischen (66,6% CD45+), MSC/Osteoblastenzellen (88,6% CD73+-Zellen innerhalb der CD45-Population) und Endothelzellen (22,1% CD31+-Zellen innerhalb der CD45-Population), die nach 3D-Dissoziation erholt wurden. (B) Das 3D-System ermöglicht die Erhaltung lebensfähiger hämatopoetischer Zellen (CD45+) bis zu 6 Wochen nach der Kultur. (C) 3D-Systeme aus primären MSCs aus NBM oder AML neben HMEC-1 (in diesem Beispiel mit Kusabira-Orange gefärbt) können HSCs (3,88% CD45+ DAPI-Zellen) in situ (D) aufrechterhalten. Abkürzungen: BM = Knochenmark; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; MSC = mesenchymale Stammzelle; NBM = normales Knochenmark; AML = akute myeloische Leukämie; HSZ = hämatopoetische Stammzellen; FSC = Vorwärtsstreuung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig03.jpg"> Abbildung 3: Visualisierung von Zellinteraktionen und Proliferation innerhalb des BM-ähnlichen 3D-Modells. Die Systeme wurden nach 3 Wochen 3D-Kokultur mit HS27A und HMEC-1 und der Zugabe von hämatopoetischen Zellen nach 1 Woche gesammelt. Eine typische immunhistochemische Färbung (braun visualisiert) durch IHC wurde unter Verwendung einer Anti-Kaninchen- oder -Maus-Meerrettichperoxidase visualisiert und mit 3,3′-Diaminobenzidin als chromogenes Substrat visualisiert und mit Gill-Hämatoxylin gegengefärbt und zeigt das Vorhandensein von entweder hämatopoetischen Zellen mit CD45 (linkes Bild), Stromazellen mit CD73 (mittleres Bild) oder Proliferation aller Zellen mit KI67 (rechtes Bild). Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: BM = Knochenmark; IHC = Immunhistochemie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Hier beschreiben wir ein einfach zu implementierendes, standardisiertes, mikrophysiologisches System, das die Komplexität der in vivo-Struktur des menschlichen Knochenmarks widerspiegelt und ein relevantes Modell zur feinen Untersuchung eines breiten Spektrums normaler und pathologischer Ereignisse bietet.

Ein menschliches Knochenmark-3D-Modell zur Untersuchung der Dynamik und Interaktionen zwischen residenten Zellen in physiologischen oder tumoralen Kontexten

The medullary niche is a complex ecosystem that is essential to maintain homeostasis for resident cells. Indeed, the bone marrow, which includes a complex ...

Diese Technik ermöglicht die Entwicklung eines standardisierten Systems, das einfach aus menschlichen Zelllinien oder primären Zellpopulationen aufgebaut werden kann und Merkmale einer gut organisierten, knochenmarkartigen Struktur bietet. Dieses Modell ermöglicht die Zellernte nach der Fixierung, um die In-situ-Zelllokalisierung innerhalb des Systems durch Bildgebung oder 3D-Strukturdissoziation zu charakterisieren, um jede zelluläre Komponente für molekulare oder funktionelle Studien zu sammeln. Kevin Geistlich, ein Hilfsingenieur aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.Wiegen Sie 35 bis 40 Milligramm BCP-Perlen in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen für jeden Einsatz. Das heißt, eine kleine zylindrische Kunststoffschale mit einer Polycarbonatmembran am Boden. Bohren Sie ein kleines Loch mit einer sauberen Nadel durch die Oberseite des 1,5-Milliliter-Röhrchens, um zu vermeiden, dass der Deckel während des Autoklavenzyklus aufspringt, und legen Sie die Röhrchen in vertikaler Position in eine geschlossene, sterile Box.Legen Sie sterile Polycarbonat-Zellkultureinsätze in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte. Gießen Sie sterile BCP-Perlen aus einem 1,5-Milliliter-Röhrchen in den Einsatz. Waschen Sie die Perlen sorgfältig, indem Sie 350 Mikroliter 1X PBS in den Einsatz tropfen und dann 4,5 Milliliter 1X PBS in den Brunnen geben.Entsorgen Sie das PBS mit einem Vakuum oder einer Fünf-Milliliter-Pipette, indem Sie die Spitze in eine Ecke des Vertiefungs legen. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal. Verwenden Sie dann 1X PBS ergänzt mit 10% FBS, um das System zu blockieren.Geben Sie vorsichtig 350 Mikroliter der Blockierlösung in den Einsatz und 4,5 Milliliter in den Brunnen und legen Sie die gesamte Platte über Nacht in einen Inkubator. Entfernen Sie die blockierende Lösung aus dem System. Mischen Sie 1 mal 10 zu den 6 HMEC-1-Zellen und 2 mal 10 zu den 6 HS27A-Zellen, die die vaskulären bzw. mesenchymalen Stromazellkompartimente darstellen, in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie für fünf Minuten bei 1 575 G bei Raumtemperatur.Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 175 Mikroliter HMEC-1-Medium hinzu, ergänzt mit 175 Mikrolitern ODM, das die mesenchymale Stromazelldifferenzierung in Osteoblasten fördert. Gießen Sie 350 Mikroliter der Zellsuspension mit 3 mal 10 zu den insgesamt 6 Zellen in jedem Einsatz. Dann gießen Sie 4,5 Milliliter des kombinierten Mediums ohne Zellen in die Vertiefungen der Platte.Saugen Sie die Mischung vorsichtig ab und dosieren Sie sie mehrmals mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette, um die Zellen und BCP-Perlen im Einsatz zu homogenisieren. Lassen Sie die gesamte Mischung am Boden des Einsatzes absetzen. Sobald die Endothel- und Mesenchymzellen im Inneren des Einsatzes homogenisiert sind, bewahren Sie die Sechs-Well-Platte drei Wochen lang im Inkubator auf.Wechseln Sie das Medium im Inneren des Einsatzes zweimal pro Woche im Vertiefung, indem Sie das Medium vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette entfernen und die Spitze an der inneren Einlegewand platzieren, um eine Störung der Ecke des Einsatzes zu vermeiden. Resuspendieren Sie die interessierenden hämatologischen Zellen im HMEC-1- und RPMI-Kombinationsmedium und fügen Sie die Zellsuspension zum Einsatz hinzu. Andere interessante Zelltypen mit dedizierten Medien können in diesem Schritt hinzugefügt werden.Wenn ein medikamentöses Behandlungsprotokoll erforderlich ist, warten Sie 24 Stunden nach dem Hinzufügen der interessierenden Zellen, bevor Sie sie behandeln, damit sie Zeit haben, an der knochenähnlichen Struktur zu haften. Aktualisieren Sie das Medium zweimal pro Woche mit 50 % HMEC-1 vollständigem Medium und 50 % RPMI vollständigem Medium. Nachdem Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche gewechselt haben, lagern Sie den gewonnenen Überstand aus dem Inneren des Einsatzes bei minus 80 Grad Celsius, um die Proteinproduktion im System zu bewerten.Um die Zellen von der 3D-Struktur zu trennen, mischen Sie 4,5 Milliliter RPMI mit 0,5 Milliliter FBS, ergänzt mit 0,4 Milligramm pro Milliliter Kollagenase in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Dann erwärmen Sie die Lösung bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Stellen Sie den Einsatz kopfüber auf eine sterile Abdeckung mit sechs Vertiefungen, um die Membran richtig auszuschneiden.Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die Membran von den Seiten zu schneiden und so eine weiße feste Scheibe zu erhalten. Legen Sie die Scheibe in das warme 15-Milliliter-Röhrchen, das die zuvor vorbereitete Lösungsmischung enthält. Legen Sie das Röhrchen in ein aktives Rad in einem 37-Grad-Inkubator und inkubieren Sie für 10 Minuten, um die Verdauung zu ermöglichen.Wenden Sie für alle Membranen die gleiche Inkubationszeit an, um eine verzerrte Analyse zu vermeiden. Nach der Inkubation das 15-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten lang bei 1,575 g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter warmem 1X PBS.Resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern warmem Trypsin und mischen Sie es gut durch Pipettieren für 10 Sekunden und legen Sie es für eine Minute in ein Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie einen Milliliter warmes, reines FBS hinzufügen. Mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette saugen und dosieren Sie das Medium, um die Scheibe vollständig zu dissoziieren.Zentrifugieren Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei 1, 575 G und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter 1X PBS, ergänzt mit 10% FBS. Lassen Sie die Perlen fünf Sekunden lang sedimentieren, bevor Sie den Überstand sammeln und durch ein 35-Mikron-Zellsieb filtern, das auf einem Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie das gewonnene Filtrat fünf Minuten lang bei 1, 575 G und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau, um die Lebensfähigkeit zu beurteilen.Resuspendieren Sie die Pellets in der Antikörpermischung und inkubieren Sie für 30 bis 40 Minuten auf Eis vor Licht geschützt. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu, ergänzt mit 2% FBS, um die Zellen zu waschen und für fünf Minuten bei 1, 575 zu zentrifugieren G.To die Durchflusszytometrie-Analyse zu starten, resuspendieren Sie das gewonnene Pellet in 200 Mikroliter 1X PBS mit 10% FBS, ergänzt mit DAPI in einer 1 bis 2000 Lösung. Analysieren Sie die Röhrchen in einem Zytometer anhand der im Textmanuskript beschriebenen Parameter.Verwenden Sie ein FSC-H- versus FSC-W-Diagrammdiagramm, um die Singulett-Population zu gate. Verwenden Sie in der Singulettfraktion ein DAPI-A- versus FSC-A-Diagramm, um die lebensfähige Zellpopulation zu bestimmen. Wenn die DAPI-negative Grundgesamtheit zuvor abgegrenzt wurde, verwenden Sie ein APCA-A- versus FSC-A-Diagramm, um die CD45-positive Population zu bestimmen.Um die BM-ähnliche Struktur zu fixieren, übertragen Sie den Einsatz von der alten Platte auf eine neue Sechs-Well-Platte, die mit 1X PBS gefüllt ist. Ersetzen Sie dann vorsichtig das Medium im Einsatz mit 1X PBS. Sobald der Einsatz gewaschen ist, legen Sie ihn in eine neue Sechs-Well-Platte und füllen Sie sowohl die Vertiefung als auch den Einsatz mit frisch geöffnetem Paraformaldehyd.Lassen Sie den Fixierungsprozess vier Stunden lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt ablaufen. Als nächstes waschen Sie den Einsatz einmal mit 1X PBS und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius Lichtschutz. Nach der gewünschten Exposition deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass es möglich war, hämatologische Zellen für mindestens sechs Wochen innerhalb des 3D-Modells zu erhalten, bevor lebensfähige Zellen gewonnen wurden.Es war möglich, die HS27A-Zelllinie durch primäres normales Knochenmark-MSC oder akute myeloische Leukämie MSC in diesem 3D-BM-ähnlichen Modell zu ersetzen oder die hämatopoetische Zelllinie durch primäre HSZ zu ersetzen. Paraffin-Embedding und Immunchemie ermöglichten erfolgreich die Analyse von CD45- und CD73-Gehalten anhand der 3D-Modelle. Dieses 3D-System erfordert drei Wochen knochenmarkartige Strukturen und zusätzliche Zeit mit interessanten Zellen.Und sterile Bedingungen müssen aufrechterhalten werden, da wir manchmal mittlere Verunreinigungen mit den zweimal wöchentlichen Medienwechseln sehen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.

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Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Eine Strategie zur quantitativen Analyse histologischer Daten im Knochenmark wird vorgestellt. Die konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen in Gewebeschnitten führt zu 2-dimensionalen Bildern, die automatisch analysiert werden. Co-Lokalisationsanalysen verschiedener Zelltypen werden mit Daten aus simulierten Bildern verglichen, um quantitative Informationen über zelluläre Interaktionen zu erhalten.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

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Einfache Etablierung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarksnische unter Verwendung von vorgegossenen Poly(ethylenglykol) (PEG)-Hydrogelen in einer bildgebenden Mikrotiterplatte

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Ein menschliches Knochenmark-3D-Modell zur Untersuchung der Dynamik und Interaktionen zwischen residenten Zellen in physiologischen oder tumoralen Kontexten (Video) | JoVE Journal

Ein menschliches Knochenmark-3D-Modell zur Untersuchung der Dynamik und Interaktionen zwischen residenten Zellen in physiologischen oder tumoralen Kontexten

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