Name: Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Isolation pulmonaler interstitieller Makrophagen und deren adoptiven Transfer nach IL-33-Stimulation im Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die in vivo Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose.

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Die Autoren würdigen das Special Topic of Laboratory Management der Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) und der National Natural Science Foundation of China (81800065).

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für experimentellen Tierschutz der Universität Jiangnan genehmigt (JN Nr. 20211,130m1720615[501]).
HINWEIS: Insgesamt wurden in dieser Studie 10 männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Die drei Versuchsgruppen in der Studie umfassten jeweils drei Empfängermäuse, und eine Wirtsmaus wurde für die IM-Isolierung verwendet.
1. Erschöpfung der Lungenmakrophagen der Maus
<ol><li>Nehmen Sie die Durchstechflasche mit Clodronat-Liposomen (siehe Materialtabelle) 30 Minuten vorher aus dem Kühlschrank, erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur und drehen Sie sie mehrmals um, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten. HINWEIS: Clodronat-Liposomen verkapseln die hydrophilen Dichlormethylenbisphosphonat-Moleküle. Wenn diese Liposomen von den Makrophagen verbraucht werden, wird das Clodronat allmählich durch die Wirkung der Lysosomenphosphatase freigesetzt, und seine Akkumulation löst folglich die Zellapoptose und die Erschöpfung der Makrophagenaus 7.</li>
	<li>Mäuse mit 3% Isofluran anästhesieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie einen Fuß kneifen, um das Bewusstsein zu überprüfen. Tragen Sie Veterinärsalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.</li>
	<li>Aspirieren Sie 60 μl Clodronat-Liposomen mit einer Pipette mit steriler Saugspitze. Verabreichen Sie das Medikament tropfenweise in die Nasenhöhle der anästhesierten Maus, so dass das Medikament beim Einatmen der Maus in die Luftröhre eingeatmet wird. Stellen Sie nach jedem Tropfen sicher, dass die Maus das Medikament vollständig einatmet und gleichmäßig atmet. Verabreichen Sie Liposomen, die PBS allein als Kontrolle enthalten8 (Abbildung 2).</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse zum Aufwärmen auf einen 38 °C Konstanttemperaturtisch, um ihre Genesung zu beschleunigen. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie aufwachen. Nachdem sich die Mäuse gut erholt und eine sternale Liegeposition erreicht haben, übertragen Sie sie in den Käfig.</li>
	<li>Verwenden Sie Mäuse mit erschöpften Alveolarmakrophagen 2 Tage nach der Behandlung mit Clodronat-Liposomen als Empfängermäuse für das Transferexperiment. ANMERKUNG: In dieser Studie wurde die Depletion von Alveolarmakrophagen bestätigt, indem die Expression von Makrophagenmarkern, wie zuvor beschrieben 8,9, nach der Verabreichung von Clodronat-Liposomen durch Inhalation überprüft wurde (siehe ergänzende Abbildung 1).</li>
</ol>2. Isolation und Kultur von IMs
<ol><li>Anästhesieren Sie die Wirtsmaus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (120 mg/kg) und Xylazin (16 mg/kg). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie über den Verlust des Zehenklemmreflexes. Tragen Sie Veterinärsalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern. Desinfizieren Sie dann die Haut der anästhesierten Maus mit 75% Alkohol und Jod. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu durchschneiden und das Herz-Lungen-Gewebe freizulegen</li>
	<li>Aspirieren Sie 10 ml 1x PBS in einer Spritze mit einer 20-G-Nadel und führen Sie die Nadelspitze in den rechten Vorhof der Maus ein (Abbildung 3A). Schneiden Sie die untere Hohlvene der Maus mit einer chirurgischen Schere ab und perfundieren Sie die Maus dann manuell mit PBS bei konstanter Geschwindigkeit (10-20 ml / min), bis das Lungengewebe weiß wird. Das Lungengewebe wird entfernt und in einer Kulturschale in eiskaltes PBS überführt (Abbildung 3B).</li>
	<li>Schneiden Sie das Lungengewebe in Fragmente von ca. 2 mm x 2 mm x 2 mm. Geben Sie dann 15 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 1% Kollagenase A enthält, in das Lungengewebe, um die Makrophagen zu isolieren. Bei 100 U/min 30 min auf einem 37 °C heißen Schütteltisch inkubieren.</li>
	<li>Saugen Sie die Lungengewebesuspension mindestens 20x durch eine 10-ml-Spritze ab, um sie so fein wie möglich zu machen. Filtern Sie diese Suspension durch ein 40-μm-Zellsieb. Das Filtrat wird bei 400 x g 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen.</li>
	<li>Lysieren Sie die roten Blutkörperchen im Pellet, indem Sie 3 ml Erythrozyten-Lysepuffer (siehe Materialtabelle) 2-3 Minuten lang auf Eis geben.</li>
	<li>Nach Zentrifugation bei 150 x g für 5 min wird das Zellpellet mit 10 ml DMEM (mit 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) resuspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Die Zellen werden in 10 cm adhärente Zellkulturschalen mit 2 x 107 Zellen/ Schale gesät und 1 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Dadurch können die Lungen-IMs an der Schale5 haften. Nach 1 h aspirieren Sie den Überstand und die schwimmenden Zellen und fügen Sie 10 ml frisches vollständiges Kulturmedium hinzu (DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Inkubieren Sie länger als 8 Stunden oder über Nacht.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Reinheit der erhaltenen IMs mittels Durchflusszytometrie mit Färbung für F4/80- und CD11c-Marker, wie zuvorbeschrieben 5 (siehe ergänzende Abbildung 1).</li>
</ol>3. Adoptive Übertragung von IMs in die Lungenbläschen
<ol><li>Ersetzen Sie das Nährmedium von der Platte, die die isolierten Lungen-IMs enthält (Schritt 2.7), durch ein vollständiges Kulturmedium, das 10 ng/ml IL-33 enthält, um die IMs zu stimulieren. 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren. Verwenden Sie 1x PBS anstelle von IL-33 als Kontrolle.</li>
	<li>Dissoziieren Sie die pulmonalen IMs, indem Sie sie 5 Minuten lang mit 1 ml 0,25% Trypsin behandeln. Dann wird die Verdauung durch Zugabe von 3 ml Frischkulturmedium gelöscht und die Lungenmakrophagen geerntet, indem die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 150 x g und 4 °C zentrifugiert wird. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren Sie die Zellen in PBS auf eine Endkonzentration von 5 x 105 Zellen/50 μl.</li>
	<li>Betäuben Sie die Empfängermäuse mit 3% Isoflurangas. Warten Sie, bis die Maus bewusstlos geworden ist (wie in Schritt 1.2), und befestigen Sie dann die Gliedmaßen der anästhesierten Maus mit medizinischem Klebeband auf einer vertikalen Platte. Ziehen Sie die Zunge der Maus vorsichtig mit einem Wattestäbchen zur Seite.</li>
	<li>Schalten Sie die Intubationslampe ein und leuchten Sie sie auf den Hals der Maus, so dass die Luftröhre zu sehen ist. Überprüfen Sie, ob sich die Luftröhre in der Nähe der Zungenbasis befindet, die Speiseröhre sich in der Nähe des Nackens befindet, die Öffnung der Speiseröhre jedoch während der Operation nicht sichtbar ist.</li>
	<li>Verwenden Sie die Intubationslampe (22 G), um die Maus zu intubieren. Führen Sie die Verweilnadelkanüle mit einem Führungsdraht (0,4 mm Durchmesser) in die Luftröhre. Entfernen Sie den Führungsdraht und schieben Sie die Kanüle in die Luftröhre der Maus, um die Intubation abzuschließen.</li>
	<li>Nachdem beobachtet wurde, dass die Kanüle in die Luftröhre gelangt, injizieren Sie 50 μl der Zellsuspension (mit 5 x 105 IMs) durch die Luftröhre in die Empfängermaus.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse zum Aufwärmen auf ein 38°C warmes Warmwarmkissen, um die Erholung zu beschleunigen. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie aufwachen. Nachdem sie sich gut erholt und eine sternale Liegeposition erreicht haben, bringen Sie sie in den Käfig.</li>
	<li>Nach 24 h wird Bleomycin (BLM) über die Luftröhre (unter Verwendung des Verfahrens in den Schritten 3.3-3.5) in einer Dosis von 1,4 E/kg Körpergewicht verabreicht, um IPF zu induzieren. Verabreichen Sie der Kontrollgruppe eine gleiche Menge Kochsalzlösung.</li>
	<li>Bestimmen Sie nach 21 Tagen den Schweregrad der Lungenfibrose für die verschiedenen Gruppen von Mäusen, die adoptiv mit PBS oder der IL-33-stimulierten IM-Suspension übertragen wurden, indem Sie die Expression von Markern für Fibrose und die Ashcroft-Scores10 bewerten.<ol><li>Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus dem Lungengewebe mit einem RNA-Extraktionsreagenz (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die quantitative Analyse wurde mit einem Mikroplatten-Reader durchgeführt. Wenn das OD260/OD280-Verhältnis 1,8-2,0 beträgt, ist die RNA-Reinheit hoch. Alle Proben wurden bei -80 ° C gelagert.</li>
		<li>Führen Sie eine quantitative Fluoreszenz-PCR durch, um die Expression von α-glattem Muskelaktin (SMA) und Fibronektin unter Verwendung spezifischer Primer zu bewerten. HINWEIS: Die für α-SMA verwendeten Primer waren vorwärts 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' und rückwärts 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCAAT-3', und die für Fibronektin verwendeten Primer waren vorwärts 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' und rückwärts 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Immunhistochemie wie unten beschrieben durch.<ol><li>Dehydrieren Sie die linke Lunge, betten Sie sie ein und schneiden Sie sie mit einem Paraffinschneider auf eine Dicke von 4 μm.</li>
		<li>Legen Sie die Gewebeschnitte auf Objektträger und backen Sie die Objektträger in einem Ofen bei 65-70 ° C für 30 min bis 1 h. Entwachen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit einem abnehmenden Alkoholgehalt (d. h. 100 %, 95 %, 90 %, 80 % und 70 % Alkohol).</li>
		<li>Färben Sie die Objektträger 5 Minuten lang in Hämatoxylin-Farbstofflösung (analytisch rein). Waschen Sie dann die Folien mit Leitungswasser. Die Objektträger 3 s in 1% Salzsäurealkohol einweichen, die schwimmende Farbe abwaschen und 5 Minuten in fließendem Wasser einweichen. Die Abschnitte werden blau.</li>
		<li>10 s bis 1 Minute in Eosinlösung eintauchen (Färbezeit entsprechend der Farbe bestimmen), mit Leitungswasser waschen und jeweils 5 Minuten lang 70 %, 80 %, 95 %, 100 % bzw. 100 % Alkohol einfüllen. Dann legen Sie die Objektträger für 3 Minuten in Xylol I- und Xylol II-Lösungen. Beobachten und fotografieren Sie nach dem Trocknen unter dem vertikalen Mikroskop mit neutraler Klebefolie.</li>
		<li>Führen Sie eine Ashcroft-Bewertung in den Abschnitten durch, um den Schweregrad der Lungenfibroseanzuzeigen 10. Führen Sie eine statistische Analyse der Daten mit einem t-Test von zwei unabhängigen Stichproben durch.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li>
<li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897(2021).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li>
<li>Nie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2+regulates+pulmonary+inflammation+and+fibrosis+via+modulating+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+PU.1+promotes+alternative+macrophage+polarization+and+asthmatic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).</li>
<li>Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Advancements+and+innovation+in+the+manufacturing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+critical+for+broadly-reactive+antibody-mediated+protection+against+influenza+A+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 846(2017).</li>
<li>Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+alveolar+macrophages+attenuates+acute+ventilator+induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats.</a> Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).</li>
<li>Hübner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples.</a> Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).</li>
<li>Tacke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+monocytes+acquire+antigens+from+other+cells+in+the+bone+marrow+and+present+them+to+T+cells+after+maturing+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).</li>
<li>Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophages%3A+A+new+therapeutic+pathway+in+fibrosing+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).</li>
<li>Wendisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+triggers+profibrotic+macrophage+responses+and+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis.</a> Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+Friend+or+foe+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Diese Studie bietet eine effektive Methode zum Abbauen, Isolieren, Kultivieren und Übertragen von Makrophagen, die bei der Untersuchung der Mechanismen der Lungenfibrose bei Mäusen helfen kann. Es gibt viele Methoden zur Verarmung von Mausmakrophagen, wie z. B. die Verabreichung von Trachealgefäßen, die Injektion von Schwanzvenen und die Naseninhalation11. Diese Studie optimierte die nasale Inhalationsmethode, die einfach zu bedienen ist und Lungenmakrophagen effektiv abbauen kann<sup class="xref"...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine diffuse pulmonale entzündliche Erkrankung, die durch viele Faktoren verursacht wird1. In der Zytokin-Mikroumgebung der Th1- und Th2-Immunantwort können Makrophagen in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) und alternativ aktivierte Makrophagen (M2) polarisiert werden. Lipopolysaccharide (LPS) oder das Zytokin IFN-γ induzieren M1-Makrophagen, um proinflammatorische Zytokine, einschließlich iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α und IL-12, zu polarisieren und zu produzieren. Im Gegensatz dazu treiben die Typ-II-Zytokine IL-4 und IL-13 die Polarisation von M2-Makrophagen an, die verschiedene wachstumsfördernde Faktoren wie TGF-β und PDGF produzieren können, die die Lungenfibrosefördern 2. Der pathologische Prozess der IPF wird von der Aktivierung und Infiltration von Makrophagen begleitet. IPF vermittelt die Reparatur von Verletzungen, Entzündungen und Fibrose durch die Freisetzung von Zytokinen3. Da nur begrenzte Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen, ist die Erforschung der molekularpathologischen Mechanismen der IPF von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Strategien zur Prävention und Behandlung von IPF. Frühere Studien unserer Gruppe und anderer Forscher 4,5 haben die erhöhte Freisetzung von IL-33 bei IPF-Patienten und in Mausmodellen mit Bleomycin (BLM)-induziertem IPF bestätigt. IL-33 wird während der Fibrose von den Epithel- und Endothelzellen freigesetzt und ist an der Aktivierung von Makrophagen beteiligt, was zu einer abnormalen Proliferation von Fibroblasten, einer Leukozyteninfiltration und schließlich zum Verlust der Lungenfunktion führt5. Das aktuelle Protokoll beschreibt den adoptiven Transfer von IL-33-stimulierten interstitiellen Makrophagen (IMs) in die Alveolen als Mittel zur Untersuchung der IPF-Entwicklung in Mausmodellen. Hier wurden IMs aus dem Lungengewebe von Wirtsmäusen isoliert, in vitro kultiviert, 24 h lang mit IL-33 stimuliert und dann adoptiv durch Trachealinjektion in die Alveolen der Empfängermäuse übertragen. Es wurde festgestellt, dass die direkte Entnahme von stimulierten Mausmakrophagen und deren adoptiver Transfer in die Empfängeralveolen den Grad der Lungenfibrose verschlimmert und den Einfluss stimulierender Faktoren auf die Fibrose im Vergleich zu den vorherigen Studien deutlicher veranschaulichenkann 6. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik kann es Forschern ermöglichen, die Funktion von Makrophagen, die durch potenzielle Zytokine stimuliert werden, bei der Entwicklung von IPF zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; DMEM</td><td>Life technologies Biotechnology,USA</td><td>1508012</td><td></td></tr><tr><td>Arterielle Verweilnadel</td><td>B Braun Melsingen AG,Deutschland</td><td>21G15G8393</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Accuri&nbsp; C6 Plus</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleomycin</td><td>Biotang, USA</td><td>Ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Kohlendioxid-Inkubator</td><td>Thermo Forma, USA</td><td>Thermo Forma370</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>R& D Systems, USA</td><td>1124F</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>F& T & D Systems, USA</td><td>N418</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Thermo Forma, USA</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Clodronat-Liposomen&nbsp;</td><td>Clodronat-Liposomen, Niederlande</td><td>CI-150-150</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>R& D Systems, USA</td><td>521204</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer</td><td>Becton, Dickinson and Company, USA</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life technologies, USA</td><td>1047571</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin Eosin&nbsp;</td><td>Nanjing Jiancheng Technology, China</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 PCR-Nachweissystem</td><td>Roche, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Mausfaktor IL-33</td><td>Peprotech, USA</td><td>210-33</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Mikroskop</td><td>Nikon Corporation, Japan</td><td>941185</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin, Streptomycin</td><td>Life Technologies, USA</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat Puffer (PBS)</td><td>Guangdong Huankai Mikrobielle Technologie, China</td><td>1535882 RBC-Lysepuffer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beyotime Biotechnology Company, China</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Isolator</td><td>Vazyme Unternehmen, China</td><td>R401-01-AA</td><td>Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz</td></tr><tr><td>RWD Inhalationsanästhesiemaschine</td><td>Shenzhen Rayward Life Technology, China</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>Halbautomatisches Paraffin Allesschneider</td><td>Leica, Deutschland</td><td>LeicaRM2245</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara, Japan</td><td>410800</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25%</td><td>Life Technologies, USA</td><td>1627172</td><td></td></tr></tbody></table>

adoptiver transfer von il-33-stimulierten makrophagen in bleomycin-induzierte mausmodelle, um ihre wirkung auf die idiopathische lungenfibrose in vivo zu untersuchen

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

Die Entzündungsreaktion, die durch eine frühe Lungenschädigung verursacht wird, ist eine der wichtigsten Ursachen für die Entwicklung einer idiopathischen Lungenfibrose (IPF), die mit der Aktivierung von Entzündungszellen wie Makrophagen und Neutrophilen sowie der Freisetzung von Entzündungsfaktoren wie TNF-α, IL-1β und IL-6 einhergeht. Es ist bekannt, dass eine frühe Entzündung, die durch aktivierte pulmonale interstitielle Makrophagen (IMs) als Reaktion auf die IL-33-Stimulation verursacht wird, eine wichtige Rolle im pathologischen Prozess der IPF spielt. Dieses Protokoll beschreibt den adoptiven Transfer von IMs, die durch IL-33 stimuliert werden, in die Lunge von Mäusen, um die IPF-Entwicklung zu untersuchen. Es beinhaltet die Isolierung und Kultivierung von primären IMs aus der Lunge der Wirtsmaus, gefolgt von der adoptiven Übertragung von stimulierten IMs in die Alveolen von Bleomycin-induzierten IPF-Empfängermäusen (die zuvor durch die Behandlung mit Clodronat-Liposomen an Alveolarmakrophagen erschöpft waren) und die pathologische Bewertung dieser Mäuse. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass der adoptive Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen die Lungenfibrose bei Mäusen verschlimmert, was darauf hindeutet, dass die Etablierung des Makrophagen-Adoptivtransfer-Experiments ein gutes technisches Mittel zur Untersuchung der IPF-Pathologie ist.

Das hier verwendete Protokoll ist im Flussdiagramm in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Inhalation von Clodronat-Liposomen durch die Nase (Abbildung 2) wurde verwendet, um die Lungenmakrophagen von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zu erschöpfen, und dies führte zu einem guten Empfänger-Mausmodell. Pulmonale IMs wurden von einer anderen unbehandelten (Wirts-)Maus isoliert (Abbildung 3A, B) und in vitro kultiviert....

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von pulmonalen interstitiellen Makrophagen (IMs) und deren adoptiven Transfer nach IL-33-Stimulation der Lungenbläschen in einem Mausmodell, was die In-vivo-Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) erleichtern kann.

Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

Das Protokoll beschreibt die Isolierung von pulmonalem IMS und den adoptiven Transfer nach IL-33-Bestimmung in einem Mausmodell, was die In-vivo-Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose erleichtern kann. Die Technik ermöglicht es den Forschern, die Funktion von Makrophagen zu untersuchen, die von traditionellen Zytokinen bei der Entwicklung von IPF simuliert wird. Nehmen Sie zunächst die Durchstechflasche mit Clodronat-Liposomen aus dem Kühlschrank.Lassen Sie es 30 Minuten bei Raumtemperatur erwärmen und drehen Sie es mehrmals um, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten. Aspirieren Sie 60 Mikroliter Clodronat-Liposomen mit einer Pipette mit steriler Saugspitze. Verabreichen Sie die Kontrolle und das Medikament tropfenweise in die Nasenhöhle der anästhesierten Maus.Stellen Sie nach jedem Tropfen sicher, dass die Maus das Medikament vollständig einatmet und gleichmäßig atmet. Nach der Erschöpfung der Alveolarmakrophagen in der Empfängermaus beginnen Sie mit der Desinfektion der Haut der anästhesierten Wirtsmaus mit 75% Alkohol und Jod. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu durchschneiden und das Herz-Lungen-Gewebe freizulegen.Saugen Sie 10 Milliliter PBS in einer Spritze ab, die mit einer 20-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und führen Sie die Nadelspitze in den rechten Vorhof der Maus ein. Dann schneidet man die untere Hohlvene der Maus mit einer chirurgischen Schere ab und durchblutet die Maus manuell mit PBS bei einer konstanten Geschwindigkeit von 10 bis 20 Millilitern pro Minute, bis das Lungengewebe weiß wird. Entfernen Sie außerdem das Lungengewebe und übertragen Sie es in eine Kulturschale in eiskaltes PBS.Schneiden Sie das Lungengewebe in Fragmente und fügen Sie 15 Milliliter DMEM-Medium hinzu, das 1% Kollagenase A enthält, um die Makrophagen zu isolieren, und inkubieren Sie es dann 30 Minuten lang bei 100 U / min auf einem 37 Grad Celsius heißen Schütteltisch. Aspirieren Sie die Lungengewebesuspension etwa 20 Mal durch eine 10-Milliliter-Spritze, um sie fein zu machen. Filtern Sie die Suspension durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb.Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 400 G für 10 Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, lysieren Sie das rote Blut mit drei Millilitern Zelllysepuffer auf Eis für zwei bis drei Minuten. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 150 G und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern DMEM.Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Säen Sie die Zellen in eine 10-Zentimeter-Zellkulturschale und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die interstitiellen Makrophagen der Lunge an die Schalen zu haften. Saugen Sie nach einer Stunde den Überstand und die schwebenden Zellen ab.Fügen Sie 10 Milliliter des frischen, vollständigen Nährmediums hinzu und inkubieren Sie es über acht Stunden oder über Nacht. Um die isolierten interstitiellen Makrophagen zu stimulieren, ersetzen Sie das verbrauchte Kulturmedium durch ein vollständiges Medium Interleukine 33. Bereiten Sie auch eine Kontrollplatte vor, indem Sie PBS anstelle von Interleukinen 33 hinzufügen.Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um die pulmonalen interstitiellen Makrophagen zu dissoziieren, behandeln Sie sie fünf Minuten lang mit einem Milliliter 0,25% Trypsin. Fügen Sie dann drei Milliliter frisches Kulturmedium hinzu, um die Verdauung zu stillen, und zentrifugieren Sie die Zellsuspension, um die Lungenmakrophagen zu ernten.Nach dem Zählen der Zellen werden die Zellen in PBS auf eine Endkonzentration von fünf mal 10 bis zu den fünften Zellen pro 50 Mikroliter resuspendiert. Um mit der Übertragung von interstitiellen Makrophagen zu beginnen, fixieren Sie die Gliedmaßen der anästhesierten Empfängermaus mit medizinischem Klebeband auf einer vertikalen Platte und ziehen Sie die Zunge der Maus mit einem Wattestäbchen vorsichtig zur Seite. Nachdem Sie die Intubationslampe eingeschaltet haben, leuchten Sie sie auf den Hals der Maus, um die Luftröhre zu sehen, die sich in der Nähe der Zungenbasis befinden sollte.Führen Sie die Verweilnadelkanüle mit der 22-Gauge-Intubationslampe und dem Führungsdraht mit einem Durchmesser von 0,4 Millimetern in die Luftröhre ein. Um die Intubation zu beenden, entfernen Sie den Führungsdraht und schieben Sie die Kanüle in die Luftröhre der Maus. Injizieren Sie nun 50 Mikroliter der Zellsuspension durch die Luftröhre in die Empfängermaus, wenn die Kanüle in die Luftröhre eindringt.Verabreichen Sie Bleomycin nach 24 Stunden über die Luftröhre, um eine idiopathische Lungenfibrose zu induzieren. Verabreichen Sie der Kontrollgruppe auch eine gleiche Menge Kochsalzlösung. Bestimmen Sie nach 21 Tagen den Schweregrad der Lungenfibrose, indem Sie die Expression von Markern für Fibrose und die Ashcroft-Scores bewerten.Die HE-Färbung zeigte, dass der adoptive Transfer von Interleukin-33-stimulierten Makrophagen den Grad der Zerstörung des Lungengewebes und die erhöhte Fibroblastenaggregation bei den Bleomycin-stimulierten Mäusen im Vergleich zur Kontrolle verschlimmerte. Der Anstieg des Ashcroft-Scores veranschaulicht auch den Grad der Lungenfibrose. Die Expressionsniveaus von mRNA von alpha SMA und Fibronektin in Lungengeweben der Empfängermaus, die adoptativ übertragene Interleukine 33-stimulierte interstitielle Makrophagen enthielten und mit Bleomycin behandelt wurden, waren höher als bei den BLM-behandelten Wildtyp-Mäusen.500 Mikroliter Luft sollten sofort mit einer Ein-Millimeter-Spritze in die Lunge eingeführt werden, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension in der Kanüle vollständig in das Lungengewebe eindringen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Eine multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Bewertung der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose bei Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur orthotopen Engraftment der Lungenkrebszellen in murinen Lungen deutlich zu verbessern, indem Vorklimatisierung die Atemwege mit Verletzungen. Dieser Ansatz kann auch angewendet werden, um die Stromale Interaktionen innerhalb der Lunge Mikroumgebung, metastasierendem Verbreitung, Lunge Krebs Komorbiditäten zu untersuchen und um effizienter Patient erzeugen Xenotransplantate abgeleitet.

Die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung erhöht die Effizienz der Orthotopen Lung Cancer Cell Engraftment

Hier stellen wir eine wirksame Methode zur Untersuchung der antifibrotischen Aktivität intravenös infundierter menschlicher mesenchymaler Stromalzellen vor, die nach der Induktion einer Lungenverletzung durch eine endotracheale Injektion von Bleomycin in C57BL aus der gesamten Nabelschnur gewonnen wurden. /6 Mäuse. Dieses Protokoll kann leicht auf die präklinische Prüfung anderer Therapeutika ausgedehnt werden.

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Bildgestützte In-vivo-Verfolgung von transplantierten distalen Lungenepithel-Vorläuferzellen für Lungenfibrose mittels Magnetpulver-Bildgebung

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Verfeinertes Mausmodell der idiopathischen Lungenfibrose

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Eine verfeinerte, aerosolbasierte intratracheale Bleomycin-Verabreichungsmethode für reproduzierbare und minimalinvasive Mausmodelle der Lungenfibrose

Eine experimentelle Lungenmetastasen und CTL Immuntherapie Mausmodell für die Analyse von...

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

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Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen (Video) | JoVE Journal

Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen

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