Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Die Kristallisation durch Dialyse ist eine wenig genutzte Methode. Dieses Protokoll stellt hierfür einen Novo-Ansatz dar, der das Spektrum der derzeit verfügbaren Kristallisationsstrategien für die strukturierte Bestimmung erweitern wird. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einen hohen Durchsatz hat, einfach einzurichten ist, ohne dass eine spezielle Ausrüstung erforderlich ist, und eine einfache Überwachung des Kristallwachstums ermöglicht.

Die Person, die diese Technik durchführt, muss mit dem Pipettieren mit geringem Volumen und der Verwendung von Mehrkanalpipetten vertraut sein. Die Tropfen müssen so ausreichend wie möglich pipettiert werden, um eine teilweise Austrocknung zu verhindern. Um das Mikrodialyse-Experiment einzurichten, legen Sie eine handelsübliche 96-Well-Mikrodialyseplatte in die Proteinseite nach oben und entfernen Sie das Klebeabdeckband, indem Sie den 200-Mikron-Druckabstandshalter abziehen.

Beachten Sie nach dem Abziehen des selbstklebenden Abdeckbandes die Position der Vertiefung A1. Laden Sie anschließend mit einer Mehrkanalpipette maximal 3,2 Mikroliter einer ordnungsgemäß vorbereiteten Proteinprobe in jede Vertiefung. Positionieren Sie die 200-Mikron-UV-Deckfolie mit der Folie nach oben richtig über der 96-Well-Platte. Um den Druckkleber zu aktivieren und zu versiegeln, drücken Sie dann die UV-Deckfolie mit einem Siegelpaddel nach unten und überprüfen Sie deren Unversehrtheit.

Drehen Sie nun die Platte um, um sie auf die Ausrichtung mit der Pufferseite nach oben zu bringen, und notieren Sie sich die gespiegelte Position der markierten Vertiefung A1. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette maximal 350 Mikroliter der Dialyselösung in jede Vertiefung der Platte und verschließen Sie die Vertiefungen sorgfältig mit der Reservoirabdeckfolie. Legen Sie dann die Platte mit der Pufferseite nach oben in einen geeigneten temperaturgesteuerten Inkubator bei 20 Grad Celsius, um das Kristallwachstum zu ermöglichen. Um die Kristallbildung unter dem Mikroskop zu untersuchen, entfernen Sie die schützende Abdeckfolie von der 200-μm-UV-Abdeckfolie und legen Sie die Platte mit der Proteinseite nach oben unter das Okular.

Um ein Kristallisationsexperiment im großen Maßstab durchzuführen, nehmen Sie die Bedingungen an, unter denen das Mikrokristallwachstum in der Mikrodialyseplatte stattgefunden hat, und replizieren Sie die gleichen Bedingungen in großen Behältern. Wählen Sie die Behältergröße in Abhängigkeit vom Volumen der Dialyselösung. Pipettieren Sie ein maximales Volumen von 500 Mikrolitern Proteinprobe in das Dialysatorröhrchen, bevor Sie das Röhrchen mit der roten Plastikkappe verschließen.

Legen Sie das versiegelte 500-Mikroliter-Dialysatorröhrchen in das schwimmende Gestell in dem mit Dialyselösung gefüllten Behälter. Stellen Sie den Behälter anschließend ungestört in einen geeigneten temperaturgesteuerten Inkubator bei 20 Grad Celsius, um ein Kristallwachstum zu erzielen. Um die Bildung von Kristallen zu überprüfen, pipettieren Sie ein bis zwei Mikroliter der Lösung aus dem Dialysator auf einen Glasdeckobjektträger.

Decken Sie die Lösung auf dem Objektträger mit einem anderen Objektträger aus Glas ab und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop. Bilder, die mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung aufgenommen wurden, zeigten die erfolgreiche Mikrokristallbildung von vier Proteinen unter Verwendung der Mikrodialyseplatten mit 10-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff-Membranen. Es wurde festgestellt, dass Lysozym Kristalle bildet, wenn es gegen 0,1 molaren Natriumacetat bei pH 4 dialysiert wird, das geeignete Additive enthält.

Domatin bildete Kristalle, wenn es gegen 0,1 molaren Bis-Tris-Propan bei pH 6,6 dialysiert wurde und geeignete Additive enthielt. Optimierte Dialysebedingungen führten zur Bildung von Mikrokristallen durch die Membranproteine, namentlich das E.coli-Multidrug-Efflux-Pumpprotein AcrB und den E.coli-Laktosetransporter LacY. Die großflächige Kristallisation in den Dialysatorröhrchen unter Verwendung der optimierten Dialysebedingungen aus den Mikrodialyseexperimenten führte zur Bildung von Tausenden von Mikrokristallen für jedes der Proteine.

Zur Kristallisation von Fomitin wurden 250 Mikroliter Protein gegen 50 Milliliter der Dialyselösung dialysiert. Für AcrB wurden 250 Mikroliter des Proteins gegen 25 Mikroliter Dialyselösung dialysiert. Die LacY-Kristallisation wurde ebenfalls im gleichen Verhältnis aufgebaut, mit 100 Mikrolitern Protein auf 10 Milliliter Dialyselösung.

Beim Umdrehen der Platte auf die Pufferseite nach oben ist die Position von A1 zu beachten, damit Lösungen aus dem Kristallisationssieb entsprechend dosiert werden können. Die so gewonnenen Kristalle können für nachgelagerte Anwendungen wie serielle Kristallographie und Mikro-ED verwendet werden.