Name: In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Erfahren Sie die In-vitro-Migration von Neuralleistenzellen in hyaluronsäurereicher extrazellulärer Matrix. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zelladhäsion, Migration und HA-Abbau für die Entwicklungsbiologie.

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Ich bedanke mich bei Fumitoshi Irie und Yu Yamaguchi für ihre Ermutigung und ihre freundlichen Vorschläge bei der Etablierung dieser Methode. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse für wissenschaftliche Forschungsprogramme der Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 to T.I., #20H03896 to T.I.) unterstützt. Die ursprüngliche Methode zur Beschichtung von HA auf Glassubstraten und in situ HA-Abbauassays auf den Substraten wurde in Yamamoto et al. (2017)8 beschrieben, während die Methode zur Herstellung von HA/Col1-Mischsubstraten in Irie et al. (2021)7 beschrieben wurde.

Alle Verfahren wurden von der Tierethikkommission der Osaka University Graduate School of Dentistry genehmigt.
1. Kultivierung von kranialen Neuralleistenzellen der Maus
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete Neuralleistenzelllinie besteht aus O9-1-Zellen, die ursprünglich von Wnt1-Cre abgeleitet wurden. R26R-GFP-exprimierende Zellen, die aus E8.5-Mausembryonen isoliertwurden 12 (siehe Diskussion). Das hier beschriebene Verfahren zur Kultivierung von O9-1-Zellen folgt einem zuvor etablierten Protokoll13.
<ol><li>Bereiten Sie die mit der Basalmembranmatrix beschichtete Platte vor.<ol><li>Tauen Sie die Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) auf Eis auf. Die Matrix 1:50 in gekühltem 1x PBS verdünnen und auf Eis aufbewahren.</li>
		<li>Eine 10 cm große Kulturplatte mit 10 ml der verdünnten Basalmembran-Matrixlösung bestreichen. Inkubieren Sie die Platte 1 h lang bei Raumtemperatur und saugen Sie die Matrix vor Gebrauch ab.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3x mit 2 ml PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Kultivieren Sie O9-1-Zellen auf der mit der Basalmembranmatrix beschichteten Platte.<ol><li>Erwärmen Sie das gesamte embryonale Stammzellmedium (ES) (siehe Materialtabelle) in einem Wasserbad bei 37 °C.</li>
		<li>Mischen Sie die O9-1-Zellsuspension vorsichtig (siehe Materialtabelle) und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1,1 × 106/ml mit vollständigem ES-Zellmedium ein.</li>
		<li>Geben Sie 8 ml vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium in die matrixbeschichtete 10-cm-Kulturplatte und besiedeln Sie die O9-1-Zellen mit 1,1 x 106 Zellen/Platte. Inkubieren bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 .</li>
		<li>Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches, vollständig auf 37 °C vorgewärmtes ES-Zellmedium. Danach alle 2-3 Tage durch frisches Medium ersetzen. Anmerkungen: Wenn die Zellen zu etwa 80 % konfluent sind (3-4 Tage nach dem Plattieren), können sie mit 0,25 % Trypsin-EDTA dissoziiert und für die spätere Verwendung weiter durchgelassen oder eingefroren werden. Repräsentative Bilder von O9-1-Zellen sind in Abbildung 1 dargestellt.</li>
		<li>Waschen Sie die Kulturplatte vor der Trypsinisierung mit 2 ml 1x PBS. 2 ml vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren. Prüfen Sie, ob sich die Zellen vollständig abgelöst haben. Klopfen Sie bei Bedarf ein paar Mal vorsichtig auf die Seite des Tellers.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium in die Kulturplatte und übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 Minuten.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie dann 2 ml des vorgewärmten vollständigen ES-Zellmediums in das Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen gründlich durch Pipettieren. Säen Sie die Zellen auf einer neuen Kulturplatte mit der gewünschten Zelldichte aus.</li>
		<li>Alternativ können Sie einen gefrorenen Zellbestand herstellen, indem Sie 1 ml Zellgefriermedium mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) anstelle des vollständigen ES-Zellmediums in das Röhrchen geben und die Zellen gründlich resuspendieren. Die Zellsuspension in Kryoröhrchen umfüllen und bei −80 °C lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zubereitung der HA/Col1-beschichteten Schale
HINWEIS: Die ursprüngliche Methode, HA/Col1 auf Glasbodenschalen zu beschichten, wurde von Irie et al.7 vorgeschlagen.
<ol><li>Geben Sie vorsichtig 50 μl unverdünntes Triethoxysilan in eine 3,5 cm große Glasbodenschale (siehe Materialtabelle). 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren und vor Licht schützen. HINWEIS: Die Inkubation mit Triethoxysilan sollte 5 min nicht überschreiten. Dies kann die Beschichtungseffizienz beeinträchtigen und unerwünschte Produkte erzeugen.</li>
	<li>Spülen Sie das Geschirr 3x schnell mit 2 ml destilliertem Wasser. Fügen Sie 50 μl 0,25%iges Glutaraldehyd, 100-fach in PBS verdünnt, pro Schale hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei RT.</li>
	<li>4x schnell mit 2 ml PBS waschen. Anschließend bestreichen Sie die Schalen 1 h lang mit 300 μl Kollagen Typ I in 0,2 N Essigsäure bei RT.</li>
	<li>3x mit 2 ml PBS schnell waschen. 300 μl 200 μg/ml fluoresceinamin-markiertes Natriumhyaluronat-H2 (FAHA-H2) (verdünnt in PBS) in jede Schale geben und über Nacht bei RT inkubieren. Nochmals 3x mit 2 mL PBS waschen. Nachdem Sie das PBS abgesaugt haben, lassen Sie die Platte 5 Minuten lang auf einer sauberen Bank an der Luft trocknen. HINWEIS: FAHA-H2 ist ein Fluoresceinamin-markiertes Natriumhyaluronat mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 1.200 und 1.600 KDa. HA mit einem geeigneten Molekulargewicht können entsprechend dem Forschungsdesign verwendet werden.</li>
</ol>3. Migrationsassay auf der HA/Col1-beschichteten Schale
HINWEIS: Ein Wundverschluss-basierter Assay mit definierten 500 μm zellfreien Lücken in Col1/HA-Substraten wurde unter Verwendung von 2-Well-Kultureinsätzen durchgeführt (siehe Materialtabelle). Die O9-1-Zellen exprimieren Tmem2, das für die Adhäsion und den Abbau von HA im extrazellulären Raum9 benötigt wird (Abbildung 2 und Abbildung 3).
<ol><li>Befestigen Sie nach dem Trocknen der beschichteten Glasbodenschale die 2-Well-Kultureinsätze an den Schalen und füllen Sie die Einsätze von außen mit 1 ml PBS.</li>
	<li>Säen Sie die O9-1-Zellen in 1 x 104 Zellen in 100 μl Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 2 % fötalem Kälberserum (FBS) pro Einsatz in die Vertiefungen. Kultivieren Sie die Zellen 2 Tage lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 .</li>
	<li>Entfernen Sie die Einsätze vorsichtig mit einer Pinzette von der beschichteten Glasbodenschale. Waschen Sie das beschichtete Glasbodengeschirr vorsichtig mit 2 ml 1x PBS, um die Zellen und Zellrückstände zu entfernen. Geben Sie 2 ml frisches DMEM mit 2 % FBS in die Kulturschalen.</li>
	<li>Nehmen Sie jetzt Phasenkontrastbilder als Startzeitpunkt mit einem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop im Monochrommodus mit hochauflösenden Einstellungen auf (Verstärkung bei 6 dB, kein Binning). Für die Bildgebung wurden in dieser Studie Objektive mit 4- bis 20-facher Vergrößerung verwendet (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Nehmen Sie die Phasenkontrastbilder mit den entsprechenden Maßstabsleisten auf und speichern Sie sie im TIFF-Format.</li>
	<li>Kulturieren Sie die Zellen für weitere 48 h bei 37 °C und 5 % CO2. Mit dem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop können Sie Phasenkontrastbilder nach 24 h und 48 h in Kultur aufnehmen.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen nach 48 h mit 1 ml 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Spülen Sie dann das Geschirr 3x für jeweils 5 min mit 1 ml frischem PBS.</li>
	<li>Legen Sie ein Deckglas mit Eindeckmedium (siehe Materialtabelle) zur weiteren morphologischen Betrachtung auf. HINWEIS: Die Gerichte können sofort abgebildet oder bis zu 2 Monate bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Optional: Immunmarkierung der Zellen für Proteine von Interesse. HINWEIS: Ein Protokoll zum Nachweis des fokalen Adhäsionskomplexes (FA) unter Verwendung eines aus der Maus stammenden monoklonalen Anti-Vinkulin-Antikörpers (siehe Materialtabelle) wird hier als Beispiel beschrieben.<ol><li>Die Schalen (ab Schritt 3.6) werden mit 0,5 ml Blockierpuffer (5 % normales Ziegenserum in PBS) für 60 min inkubiert. HINWEIS: Wählen Sie einen geeigneten Blockierungspuffer für den primären Antikörper. Ein typischer Blockierungspuffer wäre 5 % normales Serum von der gleichen Spezies wie der verwendete Sekundärantikörper.</li>
		<li>Bereiten Sie den verdünnten Primärantikörper in Antikörperverdünnungspuffer (1% normales Ziegenserum in PBS) vor. Die Schalen werden mit 0,5 ml verdünntem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert. HINWEIS: Wählen Sie den geeigneten Antikörper-Verdünnungspuffer. Typischerweise wird der Antikörper in einer Verdünnung von 1:50-1:200 verwendet.</li>
		<li>3x für je 5 min mit 2 ml PBS ausspülen. Bereiten Sie den verdünnten, von Ziegen abgeleiteten Anti-Maus-Sekundärantikörper im Antikörper-Verdünnungspuffer (1% normales Ziegenserum in PBS) vor. Inkubieren Sie die Schalen mit 0,5 ml verdünntem Sekundärantikörper für 1-3 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: In der Regel wird der Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:500-1:1.000 verwendet. DAPI kann zur Färbung der Zellkerne verwendet werden.</li>
		<li>Spülen Sie 3x mit 2 ml PBS für jeweils 5 Minuten. Legen Sie das Deckglas mit 50 μl Eindeckmedium auf. HINWEIS: Die Schüsseln können mit dem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-Filter (Anregung: 470/40, Emission: 525/50) und einem TexasRed-Filter (Anregung: 560/40, Emission: 630/75) im Monochrom-Modus mit hochauflösenden Einstellungen (Verstärkung bei 6 dB, kein Binning) abgebildet werden. Für die Bildgebung wurden in dieser Studie Objektive mit 4- bis 20-facher Vergrößerung verwendet. HINWEIS: Der Objektträger kann bis zu 2 Monate bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie die ImageJ 1.51s-Software. Wählen Sie im ImageJ-Fenster in der Menüleiste Datei > Öffnen aus, um die gespeicherte Bilddatei zu öffnen.</li>
	<li>Zeichnen Sie zum Einstellen des Messmaßstabs eine Linie mit dem gleichen Abstand wie die Maßstabsleiste. Gehen Sie zu Analysieren > Maßstab festlegen und geben Sie den bekannten Abstand und die Einheiten der Linie in die entsprechenden Felder des Fensters Maßstab festlegen ein.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine gerade Linie zwischen dem Zellenabstand, und drücken Sie Analysieren > Messen , um die Werte in ein Datenfenster zu übertragen. Messen Sie mindestens fünf verschiedene Positionen in jeder Probe und mitteln Sie die Abstände, um die repräsentativen Probendaten zu erhalten. Führen Sie die statistischen Auswertungen mit einer geeigneten Software durch (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

<ol><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+switches+in+mammalian+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).</li>
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</ol>

Der Autor erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Verschiedene ECM-Komponenten regeln die NCC-Auswanderung/-Migration. Zum Beispiel reguliert HA die NCC-Migration positiv 2,15. Interessanterweise verdeutlichte eine Studie, die auf genetischen Mausmodellen von Tmem2, einer Zelloberflächen-Hyaluronidase, basierte, die Notwendigkeit des HA-Abbaus bei der NCC-Migration9. Kollagene sind auch in der EZM, die das Neuralrohr umgibt, reichlich vorhanden16. Decorin, ein klei...

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine multipotente Zellpopulation, die in sich entwickelnden Embryonen vorhanden ist und während der Neurulation an der Neuralplattengrenze entsteht. Sie tragen zur Bildung einer Vielzahl von Geweben bei, darunter das periphere Nervensystem, das Herz-Kreislauf-System, das kraniofaziale Gewebe und das Skelett1. Nach Induktion und NCC-Spezifizierung an der Neuralplattengrenze wandern NCCs aus dem Neuroepithel in Richtung NCC-abgeleiteter Gewebestellen1.
Hyaluronsäure (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, das als Bestandteil der extrazellulären Matrix (EZM) in einer Vielzahl von Geweben verteilt ist. Die Bedeutung von HA für die Embryonalentwicklung wurde in Modellsystemen durch die Ablation von Genen nachgewiesen, die für den Hyaluronstoffwechsel verantwortlich sind. So wurde beispielsweise festgestellt, dass Mutationen in den Genen der Hyaluronsäuresynthase (Has1 und Has2) in Xenopus zu NCC-Migrationsdefekten und kraniofazialen Fehlbildungenführen 2. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die HA-bindenden Proteoglykane Aggrecan und Versican eine hemmende Wirkung auf die NCC-Migration ausüben3. Bei Mäusen führt die Has2-Ablation zu schweren Defekten in der Bildung von Endokardpolstern, was zu einerLetalität in der Mitte der Schwangerschaft (E9.5-10) führt 4,5,6.
Das Transmembranprotein 2 (Tmem2), eine Hyaluronidase auf der Zelloberfläche, hat kürzlich gezeigt, dass es eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Integrin-vermittelten Krebszelladhäsion und -migration spielt, indem Matrix-assoziierte HA an den Adhäsionsstellen entferntwird 7,8. In jüngerer Zeit zeigten Inubushi et al.9, dass ein Mangel an Tmem2 zu schweren kraniofazialen Defekten führt, die auf Anomalien bei der Auswanderung/Migration und dem Überleben von NCCs zurückzuführen sind. In der vorangegangenen Studie9 wurde die Tmem2-Expression während der NCC-Bildung und -Migration analysiert. Die Expression von Tmem2 wurde an der Stelle der NCC-Delamination und in emigrierenden Sox9-positiven NCCs beobachtet (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigte die Studie anhand von Tmem2-depletierten O9-1-Neuralleistenzellen der Maus, dass die In-vitro-Expression von Tmem2 für die Bildung fokaler Adhäsionen der O9-1-Zellen und für ihre Migration in HA-haltige Substrate unerlässlich ist (Abbildung 2 und Abbildung 3)9.
Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Tmem2 auch für die Adhäsion und Migration von NCCs durch das HA-reiche ECM wichtig ist. Der molekulare Mechanismus der NCC-Adhäsion und -Migration innerhalb der HA-reichen ECM ist jedoch noch unklar. Es ist daher notwendig, ein experimentelles System für In-vitro-Kulturen zu etablieren, um die Adhäsion und Migration von NCCs innerhalb der HA-reichen ECM vollständig zu untersuchen.
Von den zahlreichen Ansätzen, die zur Prüfung der Zellmigration eingesetzt werden, ist der auf Zellwundverschluss basierende Assay eine einfache Methode, die häufig in der Physiologie und Onkologie eingesetzt wird10. Dieser Ansatz ist aufgrund seiner Relevanz für den In-vivo-Phänotyp nützlich und eignet sich effektiv zur Bestimmung der Rolle von Medikamenten und Chemolockstoffen während der Zellmigration11. Es ist möglich, die Migrationsfähigkeit sowohl ganzer Zellmassen als auch einzelner Zellen zu bewerten, indem die Zellspaltabstände über die Zeit gemessen werden11. In diesem Manuskript wird ein modifizierter in vitro Wundverschluss-basierter Assay vorgestellt, um die NCC-Migration in HA-reiches Gewebe, das das Neuralrohr umgibt, zu modellieren. Dieses Verfahren eignet sich auch für die Untersuchung verschiedener EZM-Komponenten (d. h. Kollagene, Fibronektin und Laminin), um die Rolle des EZM-Gerüsts bei der NCC-Migration zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>10cm Zellkulturschale</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nein. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>2-Well-Kultureinsätze</td><td>ibidi</td><td>Cat. Nr. 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-markierte Ziege Anti-Maus</td><td>Invitrogen Cat</td><td>. A21422</td> Aus <td>Ziegen gewonnener Anti-Maus-Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. Nein. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>Gefriermedium</td></tr><tr><td>für Zellen Kollagen Typ I</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nr. 08-115</td><td></td></tr><tr><td>Complete ES Cell Medium</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nein. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Kat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Keyence</td><td>Cat. Nein. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstoffmarkiert HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>Iwaki</td><td>Kat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>Glutaldehyd</td><td>Sigma</td><td>Kat. Nr. G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Kat. Nein. CB-40234</td><td>Der</td></tr><tr><td>monoklonale Anti-Vinculin-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nein. V9264</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmittel</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Fisher</td><td>Kat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 Zellen</td><td>Millipore</td><td>Kat. Nein. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>Kat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>Triethoxysilan</td><td>Sigma</td><td>Kat. Nr. 390143</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Kat. Nein. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro untersuchung der auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären matrix auf die migration von neuralleistenzellen

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

Neuralleistenzellen (NCCs) sind stark wandernde Zellen, die aus der dorsalen Region des Neuralrohrs stammen. Die Auswanderung von NCCs aus dem Neuralrohr ist ein essentieller Prozess für die NCC-Produktion und deren anschließende Migration in Richtung Zielstellen. Die Migrationsroute der NCCs, einschließlich des umgebenden Neuralrohrgewebes, umfasst eine mit Hyaluronsäure (HA) reiche extrazelluläre Matrix. Um die NCC-Migration aus dem Neuralrohr in dieses HA-reiche umgebende Gewebe zu modellieren, wurde in dieser Arbeit ein Mischsubstrat-Migrationsassay bestehend aus HA (mittleres Molekulargewicht: 1.200-1.400 kDa) und Kollagen Typ I (Col1) etabliert. Dieser Migrationsassay zeigt, dass Zellen der NCC-Zelllinie, O9-1, auf dem gemischten Substrat stark migrieren und dass die HA-Beschichtung an der Stelle der fokalen Adhäsionen im Laufe der Migration abgebaut wird. Dieses In-vitro-Modell kann nützlich sein, um die mechanistischen Grundlagen der NCC-Migration weiter zu erforschen. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Evaluierung verschiedener Substrate als Gerüste zur Untersuchung der NCC-Migration.

Ein Migrationsassay wurde an gemischten Substraten aus Col1 und hochmolekularem HA (mittleres Molekulargewicht: 1.200-1.400 kDa) unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass O9-1-Zellen am Rand der Lücke leicht in die HA-reiche Lücke migrieren (Abbildung 4). Die Immunfärbung eines FA-Markers, Vinculin14, bestätigte, dass die O9-1-Zellen fokale Adhäsionen (FAs) an den Orten des HA-Abbaus bildeten (Abb...

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Migrationsexperiment, das für die funktionelle Analyse der Moleküle geeignet ist, die an der in vivo Migration von Neuralleistenzellen in die hyaluronsäurereiche extrazelluläre Matrix beteiligt sind.

In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

Hyaluronsäure ist eine der am häufigsten vorkommenden extrazellulären Matrizen im Tiermodell. Die Bedeutung von Hyaluronsäure für die Embryonalentwicklung wurde nachgewiesen. Dieses In-vitro-Modell ist nützlich, um zu untersuchen, wie Neuralleistenzellen in der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix haften und wandern.Mit unserer Technik können wir die Migration und die HA-Abbaufähigkeit sowohl der Großbevölkerung als auch einzelner Zellen im Laufe der Zeit bewerten. Darüber hinaus kann diese Technik für das Wirkstoffscreening verwendet werden, um Verbindungen zu finden, die den HA-Abbau beschleunigen oder verhindern. Verdünnen Sie zunächst die Basalmembranmatrix mit gekühltem PBS im Verhältnis 1:50 und bewahren Sie sie auf Eis auf.Bestreichen Sie eine 10 Zentimeter große Kulturplatte mit 10 Millilitern der verdünnten Matrixlösung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Teller dreimal mit zwei Millilitern PBS. Um die O9-1-Zellen auf der matrixbeschichteten Platine zu kultivieren, wird das gesamte embryonale Stamm- oder ES-Zellmedium in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius erwärmt.Mischen Sie die O9-1-Zellsuspension vorsichtig und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Stellen Sie dann die Zellkonzentration mit dem kompletten ES-Zellmedium auf 1,1 Millionen Zellen pro Milliliter ein. Geben Sie acht Milliliter vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium in die matrixbeschichtete 10-Zentimeter-Kulturplatte und säen Sie die O9-1-Zellen mit 1,1 Millionen Zellen pro Platte.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches, auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes ES-Zellen-Komplettmedium. Danach alle zwei bis drei Tage durch frisches Medium ersetzen.Waschen Sie die Kulturplatte mit zwei Millilitern PBS und fügen Sie dann zwei Milliliter vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA hinzu. Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes komplettes ES-Zellmedium auf die Kulturplatte und übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 g für fünf Minuten und verwerfen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes ES-Komplettzellmedium in das Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren gründlich. Anschließend werden die Zellen auf einer neuen Kulturplatte mit der gewünschten Zelldichte ausgesät.50 Mikroliter unverdünntes Triethoxysilan vorsichtig in eine 3,5 Zentimeter große Glasbodenschale geben und fünf Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Waschen Sie die Schüssel dreimal mit zwei Millilitern destilliertem Wasser und fügen Sie 50 Mikroliter 0,25%iges Glutaraldehyd, 100-fach verdünnt in PBS, pro Schüssel hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann viermal mit zwei Millilitern PBS waschen und das Geschirr eine Stunde lang mit 300 Mikrolitern Kollagen Typ eins zu 0,2 normaler Essigsäure bei Raumtemperatur bestreichen.Auch hier dreimal mit zwei Millilitern PBS waschen. 300 Mikroliter von 200 Mikrogramm pro Milliliter Fluoresceinamin, markiert als Natriumhyaluronat H2, in jede Schale geben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Dreimal mit zwei Millilitern PBS waschen.Befestigen Sie nach dem Trocknen der beschichteten Glasbodenschale die beiden Wellkultureinsätze an den Schalen und füllen Sie die Einsätze außen mit einem Milliliter PBS. Säen Sie die O9-1-Zellen mit 10.000 Zellen in 100 Mikrolitern DMEM, die 2 % fötales Kälberserum oder FBS pro Einsatz enthalten, in die Vertiefungen. Kultivieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, nehmen Sie Phasenkontrastbilder als Startzeitpunkt mit einem All-in-One-Fluoreszenzmikroskop auf.Entfernen Sie die Einsätze vorsichtig mit einer Pinzette von den beschichteten Glasbodenschalen und waschen Sie die beschichteten Glasbodenschalen vorsichtig mit zwei Millilitern PBS, um die Zellen und Zellrückstände zu entfernen. Geben Sie zwei Milliliter frisches DMEM mit 2 % FBS in die kultivierten Gerichte. Kultivieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und nehmen Sie nach 24 Stunden und 48 Stunden in Kultur Phasenkontrastbilder auf.Spülen Sie das Geschirr mit PBS und fixieren Sie die Zellen nach 48 Stunden mit einem Milliliter 4%Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie dann das Geschirr dreimal für jeweils fünf Minuten mit einem Milliliter frischem PBS. Zum Schluss legen Sie ein Deckglas zur weiteren morphologischen Beobachtung auf das Eindeckmedium.Querschnitte des Neuralrohrs von Tmem2-Flag-Embryonen bei E9.0 sind in dieser Abbildung dargestellt. Die Schnitte auf Schädel- und Rumpfebene des Neuralrohrs waren doppelt markiert für das Tmem2-Flag-Protein und Hyaluronsäure. Die Expression von Tmem2 wurde in der Neuralplatte und im Grenzbereich des Neuralrohrs beobachtet, während diese Stellen keine Hyaluronsäurefärbung aufwiesen.Die Doppelmarkierung der Neuralleistenzellen für Tmem2 flag und Sox9 ist hier dargestellt. Querschnitte des Neuralrohrs E9.0 wurden für Tmem2 flag und Sox9 gefärbt. Die repräsentativen Bilder von Tmem2-depletierten und Kontroll-O9-1-Zellen, die auf einer normalen Kulturschale kultiviert wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt.Die Expression von Tmem2 in diesen Zellen wurde mittels qPCR mit GAPDH als interne Kontrolle zur Normalisierung evaluiert. Tmem2-depletierte und Kontroll-O9-1-Zellen wurden 48 Stunden lang auf Glasdeckgläsern kultiviert, die mit fluoresceinierter Hyaluronsäure beschichtet waren. Die Hyaluronsäure-abbauende Aktivität zeigt sich in dunklen Bereichen im fluoreszierenden Hintergrund.Der Grad des Hyaluronsäureabbaus wurde auch quantitativ zwischen Tmem2-depletierten und Kontroll-O9-1-Zellen verglichen. Der Abbau von substratgebundener Hyaluronsäure an den fokalen Adhäsionen in O9-1-Zellen ist in dieser Abbildung dargestellt. O9-1-Zellen, die auf gemischten Substraten aus Col1/HA kultiviert wurden, wurden mit einem Anti-Vinkulin-Antikörper immunmarkiert.Die dunklen Flecken oder Streifen stellen die Abbauaktivität von Hyaluronsäure im FAHA H2-Substrat dar. Die Stellen des Hyaluronsäureabbaus und der fokalen Adhäsionen wurden auf den gemischten Substraten kolokalisiert. Die Coval-Beschichtung der Glasbodenschalen mit HA ist ein kritischer Schritt im Protokoll, da eine unzureichende Beschichtung dazu führen kann, dass die HA während der Adhäsion und Migration leicht durch mechanische Kraft entfernt werden können.Um eine ordnungsgemäße Beschichtung zu gewährleisten, verwenden wir Glutaraldehyd, chemisch immobilisiertes Kollagen vom Typ eins, das über eine scharfe Kopplung an den Aldehyd an das Glas angeschlossen wird. Es ist möglich, extrazelluläres Matrixsubstrat neben Kollagen vom Typ eins zu verwenden, aber sie müssen Scharfschaltungsgruppen haben und es kann aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften Einschränkungen geben, sie auf Glasbodenschalen zu beschichten. Es kann also notwendig sein, Versuch und Irrtum zu finden, um den besten Ansatz zu finden.Dieses Laborexperiment kann hilfreich sein, um zu untersuchen, wie bestimmte Moleküle während der Bewegung von Neuralleistenzellen in die HA oder HA-Umgebung um das Neuralrohr herum funktionieren. Es könnte auch ein nützlicher Weg sein, um Medikamente zu testen, die diesen Migrationsprozess entweder beschleunigen oder verhindern könnten. Es ist interessant zu wissen, warum Tmem2 sowohl die Funktionen der Adhäsion über HA als auch des Abbaus von HA hat und warum HA an der vollständigen Kohäsionsstelle abgebaut werden muss.Da HA die häufigste Substanz in der extrazellulären Matrix ist, ist es in der Biologie und Medizin sehr wichtig, die Antwort auf diese Frage herauszufinden. Dieses experimentelle Protokoll ist wertvoll, weil es auf verschiedene Zelltypen angewendet werden kann, darunter Hautfibroblasten, Epithelzellen und Krebszellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen (Video) | JoVE Journal

In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen

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