Name: Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Lernen Sie eine zeitspezifische CRISPR-Methode zur gezielten Manipulation der Mausplazenta am embryonalen Tag 12,5 mittels Injektion und Elektroporation. Diese Technik ermöglicht die Aufklärung spezifischer Genfunktionen während der mittleren bis späten Schwangerschaft.

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Die Autoren nennen die folgenden Finanzierungsquellen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 und NIH T32GM145441. Die Autoren danken den Labors von Dr. Val Sheffield und Dr. Calvin Carter an der University of Iowa für die Nutzung ihres Operationsraums und ihrer Ausrüstung sowie Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan und Dr. Matthew Weber für ihre Unterstützung bei der Mikroskopie. Die Autoren danken auch Dr. Sara Maurer, Maya Evans und Sreelekha Kundu für ihre Unterstützung bei den Pilotoperationen.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Bundesvorschriften und den Richtlinien der University of Iowa durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Tiere und Haltung
<ol><li>Halten Sie die Tiere in einem 12-stündigen Tageslichtzyklus mit Futter und Wasser ad libitum.</li>
	<li>Verwenden Sie weibliche CD-1-Mäuse im Alter von 8-15 Wochen. Verwenden Sie das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens, um E0.5 zu identifizieren.</li>
	<li>Auf E0.5 werden die trächtigen Mütter einzeln untergebracht.</li>
</ol>2. Kalibrierung der Mikropipette
HINWEIS: Die Kalibrierung der Mikropipette sollte nach Möglichkeit vor der Operation durchgeführt werden.
<ol><li>Vor der Herstellung und Kalibrierung der Mikropipette werden alle Plasmide auf die empfohlene Konzentration (0,1 μg/μl) in DNasefreiem Wasser verdünnt. Mischen Sie das Plasmid mit entsprechend verdünntem Fast Green-Farbstoff (1 μg/μl in PBS) (endgültige Plasmidkonzentration: 0,06 μg/μl).</li>
	<li>Ziehen Sie Mikropipetten mit 10 cm Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 0,86 mm mit einem Mikropipettenzieher.</li>
	<li>Brechen Sie die Spitze einer Mikropipette (2-3 mm) vorsichtig mit einer sterilen Pinzette ab.</li>
	<li>Füllen Sie die Mikropipette in eine Mikrokapillarspitze, die an einem Mikroinjektor befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass der Mikroinjektor an der Mikroinjektionsmaschine angebracht ist und dass genügend Stickstoff vorhanden ist, um die Mikropipette zu kalibrieren.</li>
	<li>Sobald die Mikropipette am Mikroinjektor befestigt ist, beladen Sie sie mit der Fast Green-Farbstofflösung, um die Kalibrierung durchzuführen (1 μg/μl in PBS). Kalibrieren Sie die Mikropipette, um ein Volumen von ca. 3,5 μl zu injizieren. Entleeren ("reinigen") Sie die Mikropipette, um die Beladung der Plasmidlösungen wie folgt vorzubereiten. Anmerkungen: Jede Mikropipette ist etwas anders. Um eine Schädigung der Plazenta während der Injektion zu vermeiden, sollte die Injektionszeit zwischen 0,5-1,5 s eingestellt werden. Der Druck sollte zwischen 1 und 8,5 psi eingestellt werden. Kalibrieren Sie jede Mikropipette separat. Wenn die Mikropipette nicht innerhalb dieser Parameter kalibriert werden kann, sollte sie nicht verwendet werden.</li>
</ol>3. Chirurgie (Abbildung 1A)
Anmerkungen: Reinigen Sie zur Vorbereitung die Oberflächen sowohl des Präparations- als auch des Operationsbereichs mit 70 % Ethanol. Legen Sie eine saugfähige Unterlage in den Vorbereitungsbereich. Legen Sie im Operationsbereich ein Heizkissen ab und legen Sie dann eine saugfähige Unterlage darauf. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge vor der Operation. Die Zeit, in der der Damm unter Narkose steht, sollte unter 1 Stunde liegen.
<ol><li>Betäubung<ol><li>Verabreichen Sie dem trächtigen Muttertier 30 Minuten bis 1 Stunde vor der Operation 5 mg/kg NSAR (Meloxicam) oder ein anderes zugelassenes Analgetikum.</li>
		<li>Legen Sie die trächtige Mutter in eine Induktionskammer, die an einem Isofluran-Verdampfer befestigt ist.</li>
		<li>Stellen Sie den Verdampfer auf 4% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff ein.</li>
		<li>Sobald die Anästhesie durch das Ausbleiben des Ansprechens auf ein Zehenzwicken und eine reduzierte Atemfrequenz bestätigt wurde, entfernen Sie den Damm aus der Induktionskammer in den Präparationsbereich.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung auf die Operation<ol><li>Legen Sie den Damm in Rückenlage mit einem Nasenkegel in den Vorbereitungsbereich.</li>
		<li>Reduzieren Sie den Verdampfer auf 2% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff, während sich der Damm im Nasenkegel befindet.</li>
		<li>Rasieren Sie den Bauch des Muttertiers gründlich und entfernen Sie überschüssiges Fell. Beschichten Sie den rasierten Bauch abwechselnd dreimal mit Povidon-Lösung und 70%igem Ethanol mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze. Tragen Sie die letzte Schicht Povidon-Lösung auf. Um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, tragen Sie künstliches Tränengel auf beide Augen des Muttertiers auf (Abbildung 2A, B).</li>
		<li>Bewegen Sie nach der Präparation den Damm mit dem Nasenkegel in den dafür vorgesehenen Operationsbereich.</li>
	</ol></li>
	<li>Uterus Laparotomie Anmerkungen: Verwenden Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs sterile Handschuhe. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.<ol><li>Legen Sie im Operationsbereich den Damm in Rückenlage und befestigen Sie den Nasenkegel mit Klebeband. Stellen Sie das Heizkissen unter dem saugfähigen Pad auf 45 °C ein.</li>
		<li>Machen Sie mit einer Pinzette und einer Schere einen ca. 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut zu spannen, und machen Sie einen vertikalen Schnitt in die Haut. Machen Sie danach einen weiteren ähnlich großen Schnitt durch das Bauchfell, um die Gebärmutterhörner freizulegen. Zelten Sie das Bauchfell mit einer Pinzette, während Sie den vertikalen Schnitt machen (Abbildung 2C, D). HINWEIS: Wenn das Bauchfell nicht richtig eingeschnitten wird, kann dies zu einem tödlichen Einschnitt des Darms führen.</li>
		<li>Massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft durch den Schnitt, indem Sie auf die Seiten des Bauches drücken. Führen Sie dazu die Gebärmutter vorsichtig und ohne Hilfsmittel und nur mit den Fingern, um versehentliche Verletzungen zu vermeiden. Legen Sie den freiliegenden Uterus auf ein steriles OP-Tuch, das den Bauch des Damms bedeckt, und halten Sie es während der gesamten Operation mit Tropfen steriler Kochsalzlösung feucht, die vor der Anwendung bei Bedarf auf 30 °C erwärmt werden kann (Abbildung 2E, F). ANMERKUNG: Die Uterushörner können wie in Wang et al.27 beschrieben identifiziert werden.</li>
		<li>Sobald die Gebärmutter freigelegt ist, wählen Sie drei Plazentapaare zur Manipulation aus. HINWEIS: Die Plazenta können wie von Elmore et al.24 beschrieben identifiziert werden. Um das Überleben der Embryonen zu maximieren, sollten nicht mehr als 6 Plazenten behandelt werden. Wenn weniger als 12 Embryonen vorhanden sind, sollten nicht mehr als 4 Plazenten injiziert werden. Wählen Sie zwei benachbarte Plazenten aus, so dass eine eine Kontrollinjektion und die andere das experimentelle Plasmid erhält. Die Verwendung von zwei benachbarten Plazenten ermöglicht einen besseren Vergleich von Plazenten an ähnlichen Stellen in der Gebärmutter und ermöglicht auch eine erhöhte Überlebensrate. Die ausgewählten Plazentapaare werden zufällig ausgewählt und in beiden Uterushörnern verteilt (Abbildung 1B).</li>
		<li>Zeichnen Sie die Lage der Plazentamanipulationen und die Organisation der Embryonen in den Uterushörnern auf, damit die Embryonen und Plazenten während der Entnahme identifiziert werden können, da ein Damm sowohl Kontroll- als auch experimentell behandelte Plazenten/Embryonen trägt.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazentainjektion und Elektroporation des Kontrollplasmids Anmerkungen: Um eine aseptische Technik beizubehalten, sterilisieren Sie die Elektroporationspaddel und den Mikroinjektor vor dem Gebrauch mit einem kalten Sterilisationsmittel. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.<ol><li>Laden Sie mit der kalibrierten Mikropipette eine ausreichende Menge des entsprechenden Kontrollplasmids für drei Injektionen. Führen Sie alle Injektionen in einer Tiefe von ~0,5 mm seitlich in die Plazenta zwischen der Dezidua (weiß) und der Verbindungszone (dunkelrot) durch (Abbildung 3A-F).</li>
		<li>Führen Sie Injektionen in die drei Kontrollplazenten durch. Anmerkungen: Führen Sie alle Kontrollplasmidinjektionen vor den experimentellen Injektionen durch, um eine Kreuzkontamination der Plasmide mit der Mikropipette zu vermeiden. Auf diese Weise kann dieselbe Mikropipette verwendet werden, da der Wechsel der Mikropipetten und der Kalibrierzeit die Operationszeit drastisch verlängert und das Überleben des Muttertiers verringert.</li>
		<li>Führen Sie die Elektroporation der mit Kontrollplasmid injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch.</li>
		<li>Verwenden Sie für die Elektroporation ein Paar 3-mm-Paddel, die an einer Elektroporationsmaschine befestigt sind. Um die Effizienz der CRISPR-Inkorporation und die Lebensfähigkeit von Embryonen zu gewährleisten, verwenden Sie die folgenden Elektroporationseinstellungen: 2 Impulse, 30 V, 30 ms Impuls, 970 ms Impuls aus, unipolar.</li>
		<li>Nach der Injektion, aber unmittelbar vor der Elektroporation, beschichten Sie die Kontaktstellen mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette oder Spritze genau auf die drei Stellen der Gebärmutterwand und der Paddel auf.</li>
		<li>Drücken Sie die Elektroporationspaddel vorsichtig auf die seitlichen Seiten der Plazenta. Platzieren Sie das Anodenpaddel über der Injektionsstelle und der Kathode direkt gegenüber (Abbildung 4A-C).</li>
		<li>Drücken Sie den Impuls an der Elektroporationsmaschine und warten Sie, bis die beiden Impulse abgeschlossen sind, bevor Sie die Elektroporationspaddel entfernen. Anmerkungen: Während des Pulses ist oft eine kleine Menge weißer Schaum zwischen den Paddeln und der Plazenta zu sehen. Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie vor dem weiteren Gebrauch die Spannung der Paddel mit einem Voltmeter. Wenn der Messwert auf dem Voltmeter nicht mit der eingestellten Elektroporationsspannung übereinstimmt, sind die Paddel nicht funktionsfähig.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazentainjektion und Elektroporation des experimentellen Plasmids<ol><li>Befolgen Sie die gleichen Anweisungen wie in Schritt 3.4.1. zu Schritt 3.4.2. Verwendung des experimentellen Plasmids anstelle des Kontrollplasmids.</li>
		<li>Führen Sie die Elektroporation aller drei experimentell injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch. Dies sollte auf die gleiche Weise durchgeführt werden wie bei denen, die mit den Kontrollplasmiden injiziert werden. Befolgen Sie Schritt 3.4.4. zu Schritt 3.4.7.</li>
	</ol></li>
	<li>Abschluss der Operation<ol><li>Sobald die Plazentamanipulation abgeschlossen ist, massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft nur mit den Fingern zurück in die Bauchhöhle (Abbildung 5A).</li>
		<li>Führen Sie zunächst doppelt geknotete Einzelnähte auf der Peritoneumschicht mit beschichteten und geflochtenen auflösbaren Nähten von 45 cm Länge mit einer 13 mm 3/8c-Nadellegierung durch. Abstand zwischen den Nähten 2-3 mm (Abbildung 5B).</li>
		<li>Nachdem Sie die Bauchfellschicht vernäht haben, vernähen Sie die Haut mit auflösbaren Nähten. Verknoten Sie die einzelnen Nähte im Abstand von 2-3 mm dreifach, um sicherzustellen, dass der Damm die Naht nicht lösen kann (Abbildung 5C).</li>
		<li>Sobald die Naht abgeschlossen ist, stellen Sie das Isofluran auf 1 % und den Sauerstoffgehalt auf 3,5 l/min ein und tragen Sie Gewebekleber auf die Nähte auf der Haut auf (Abbildung 5D). Anmerkungen: Gewebekleber ist optional, wird aber empfohlen, um ein erneutes Öffnen des Einschnitts durch Kauen des Damms zu verhindern.</li>
		<li>Wenn der Gewebekleber getrocknet ist, schalten Sie den Verdampfer aus und entfernen Sie den Damm aus dem Operationsbereich. Legen Sie den Damm in einen stützenden Käfig auf den Rücken.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nachsorge und Überwachung
<ol><li>Lassen Sie die trächtige Mutter mindestens 30 Minuten lang in einem sauberen Käfig unter Aufsicht genesen, um sicherzustellen, dass keine unmittelbaren Komplikationen der Operation auftreten. Beobachten Sie, bis es vollständig gehfähig ist und ohne Hilfe auf die Füße springen kann. Einzelne Unterbringung des Damms nach der Operation.</li>
	<li>Verfolgen Sie die institutionelle postoperative Betreuung und Überwachung bis zur Embryonenentnahme. Notieren Sie das Gewicht des Damms und überwachen Sie täglich die Nähte und die Inzisionsstelle.</li>
</ol>5. E14.5 Plazentaentnahme
<ol><li>Bei E14.5 wird der Damm mit einem Ketamin/Xylazin-Cocktail (1 mg/ml Ketamin und 0,1 mg/ml Xylazin) tief betäubt und anschließend zervikal disloziert.</li>
	<li>Machen Sie mit einer Schere einen V-förmigen Schnitt in den Bauch des Damms und entfernen Sie die Gebärmutter. Sofort auf eine 5 cm Petrischale auf Eis stellen. Mit einer Pinzette wird der Embryo und die dazugehörige Plazenta vorsichtig aus der Gebärmutter entfernt. HINWEIS: Zeichnen Sie die Position des Embryos und die entsprechende Plazenta in den Gebärmutterhörnern auf, um festzustellen, welcher Embryo während der Operation direkt manipuliert wurde.</li>
	<li>Notieren Sie die Plazentagewichte. Schneiden Sie die Plazenta mit einer RNAse-freien Pinzette und einem Rasierer entlang der Mittellinie in zwei Hälften. Eine Hälfte in 4%iges PFA bei 4 °C geben. Schneiden Sie die restliche Hälfte wieder in zwei Hälften und lagern Sie die restlichen zwei Viertel bei −80 °C in zwei Röhrchen, eines davon mit RNA-Speicherreagenz. HINWEIS: Embryonen und anderes mütterliches Gewebe können aus der Sammlung bei −80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.</li>
</ol>6. Analyse der Genexpression der Plazenta
<ol><li>Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C in einem RNA-Speicherreagenz gelagert wird.</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Plazenten für die qPCR, wie in Elser et al. beschrieben, unter Verwendung der Trizol-Methode zur RNA-Isolierung, eines Spektralphotometers für die RNA-Konzentration, eines cDNA-Synthesekits und der qPCR mit SYBR Green Master Mix28. Verwenden Sie anstelle der Turbo-DNAfree-Kit-DNAse, auf die in Elser et al. verwiesen wird, nach der Trizol-RNA-Isolierung ein RNAcleanup-Kit, um sicherzustellen, dass die Proben keine Verunreinigungenenthalten 28. HINWEIS: Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für Trizol und verwenden Sie es in einem chemischen Abzug.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Plasmidinsertion des Kontrollplasmids mit GFP-Primern und des experimentellen Plasmids mit BLAST-Primern (Primer in Ergänzungstabelle 1). Verwenden Sie den CT-Wert, um das Vorhandensein des Plasmids zu bestimmen. HINWEIS: CT-Werte über 35 sind falsch positive Ergebnisse, und nur solche unter 35 sollten als positiver Indikator dafür angesehen werden, dass das Plasmid erfolgreich eingesetzt wurde.</li>
	<li>Die IGF-1-Plazentaexpression, die auf das Housekeeping-Gen 18s normalisiert ist, wird beurteilt (Primer sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt). Verwenden Sie die ddCT-Methode, um die Faltungsänderung zu berechnen, und berechnen Sie dann die normalisierte Faltungsänderung der experimentellen Stichproben auf die mittlere Faltungsänderung der Kontrollstichproben.</li>
</ol>7. Analyse des Plazentaproteinspiegels
<ol><li>Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C gelagert wurde. Das Gewebe wird in einer Pufferlösung aus 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 und 10 mM Proteaseinhibitor indiH2O mit einem End-pH-Wert von7,4 homogenisiert. Verwenden Sie einen Handhomogenisator und einen Stößel, um das Gewebe aufzubrechen. Anmerkungen: Die Probe sollte 10 % des Volumens des Puffers nicht überschreiten.</li>
	<li>Verdünnen Sie die homogenisierten Proben im Puffer im Verhältnis 1:12, so dass sie sich im nachweisbaren Bereich eines Bicinchoninsäure-Assay-Kits (BCA) befinden. Führen Sie den BCA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit einem Plattenlesegerät.</li>
	<li>Nach der Durchführung des BCA-Assays werden alle Proben für den IGF-1-ELISA auf die gleiche Gesamtproteinkonzentration von 2 mg/ml normalisiert, wie dies in Gumusoglu et al.29 der Fall war.</li>
	<li>Führen Sie den IGF-1-ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie die IGF-1-Proteinspiegel mit einem Plattenlesegerät unter Verwendung einer Standardkonzentrationskurve.</li>
</ol>8. Räumliche CRIPSR-Verifikation mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung 
<ol><li>Nachdem die Plazentahälften 1-3 Tage lang in 4%igem PFA bei 4 °C fixiert wurden, werden sie in 20%ige Saccharose bei 4 °C eingeschoben, bevor sie in optimaler Schnitttemperatur (OCT) eingefroren werden.</li>
	<li>Die in OCT eingebetteten Plazentahälften werden in einem −20 °C-Kryostaten seriell in 10-μm-Schnitte geschnitten und auf Objektträger gelegt, um sie zu beschriften. Schneiden Sie die Plazentahälften so, dass alle drei Teilregionen sichtbar sind. Lagern Sie die Objektträger bei −80 °C, bis sie für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden.</li>
	<li>Führen Sie eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung (FISH) gemäß den Protokollen des Herstellers durch. Hybridisieren Sie einen Objektträger mit einer dCas9-3xNLS-VP64-Sonde und einen zweiten "Schwester"-Objektträger der gleichen Plazenta mit einer Prl8a8-Sonde. HINWEIS: Die Sonde dCas9-3xNLS-VP64 detektiert das Vorhandensein des Überexpressionsplasmids. Die Prl8a8-Sonde hebt Spongiotrophoblasten der Junktionszone hervor, wodurch die Subregionen der Plazenta identifiziert werden können. Diese beiden Sonden sind auf separaten "Schwester"-Objektträgern beschriftet, um eine Interferenz der Mehrkanalfluoreszenz mit der grünen Autofluoreszenz in der Plazenta zu vermeiden.</li>
	<li>Beschriften Sie beide Sonden mit dem Detektionsfarbstoff (Opal 620). Nachdem Sie das Protokoll des Herstellers für FISH ausgefüllt haben, tragen Sie DAPI-Eindeckmedium auf und legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack.</li>
	<li>Stellen Sie die Objektträger auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop dar und verarbeiten Sie sie mit einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware. Hier kam die Software CellSens zum Einsatz.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Plazenta ist ein primärer Regulator des fetalen Wachstums, und wie bereits erwähnt, können Veränderungen in der Genexpression oder -funktion der Plazenta die Entwicklung des Fötus erheblich beeinflussen6. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine gezielte in vivo CRISPR-Manipulation der Mausplazenta mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz durchzuführen. Diese Technik ermöglicht eine signifikante Ausbeute an lebensfähigen Embryonen und den entsprec...

Die Plazenta ist ein wesentliches Organ, das an der Entwicklung des Fötus beteiligt ist. Die Hauptaufgabe der Plazenta besteht darin, wesentliche Faktoren bereitzustellen und den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zum und vom Fötus zu regulieren. Die Plazenta von Säugetieren besteht sowohl aus fötalem als auch aus mütterlichem Gewebe, die die Schnittstelle zwischen Fötus und Mutter bilden, und so wirkt sich die Genetik sowohl der Mutter als auch des Fötus auf die Funktionaus 1. Genetische Anomalien oder eine gestörte Funktion der Plazenta können die Entwicklung des Fötus drastisch verändern. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Genetik und Entwicklung der Plazenta mit der veränderten Entwicklung bestimmter Organsysteme beim Fötus verbunden ist. Insbesondere Anomalien in der Plazenta sind mit Veränderungen des fetalen Gehirns, des Herzens und des Gefäßsystems verbunden 2,3,4,5.
Der Transport von Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderen Molekülen von der Plazenta zum Fötus spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Fötus6. Es hat sich gezeigt, dass die Veränderung der Plazentaproduktion bestimmter Moleküle die Neuroentwicklung verändern kann. Eine mütterliche Entzündung kann die Produktion von Serotonin erhöhen, indem sie die metabolische Genexpression von Tryptophan (TRP) in der Plazenta verändert, was in der Folge zu einer Anhäufung von Serotonin im fetalen Gehirn führt7. Andere Studien haben neben Herzfehlern auch Plazentaanomalien gefunden. Es wird angenommen, dass Anomalien in der Plazenta zu angeborenen Herzfehlern beitragen, dem häufigsten Geburtsfehler beim Menschen8. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat mehrere Gene identifiziert, die sowohl in der Plazenta als auch im Herzen ähnliche zelluläre Signalwege aufweisen. Wenn diese Signalwege gestört sind, können sie zu Defekten in beiden Organen führen9. Die Defekte in der Plazenta können angeborene Herzfehler verschlimmern. Die Rolle der Plazentagenetik und -funktion bei der Entwicklung spezifischer fetaler Organsysteme ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet.
Mäuse haben hämochoriale Plazenten und andere Merkmale menschlicher Plazenten, was sie zu sehr nützlichen Modellen für die Erforschung menschlicher Krankheiten macht1. Trotz der Bedeutung der Plazenta fehlt es derzeit an gezielten in vivo Genmanipulationen. Darüber hinaus stehen derzeit mehr Optionen für Knockouts oder Knockdowns zur Verfügung als für Überexpressions- oder Gain-of-Function-Manipulationen in der Plazenta10. Es gibt mehrere transgene Cre-exprimierende Linien für plazentaspezifische Manipulationen, jede in verschiedenen Trophoblastenlinien zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Dazu gehören Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER und Gcm1-Cre 11,12,13,14. Obwohl diese Cre-Transgene effizient sind, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, einige Gene zu bestimmten Zeitpunkten zu manipulieren. Eine weitere häufig verwendete Methode, um die plazentare Genexpression entweder auszuknocken oder zu überexprimieren, ist die Insertion lentiviraler Vektoren in die Blastozystenkultur, was zu einer trophoblastenspezifischen genetischen Manipulation führt15,16. Diese Technik ermöglicht eine robuste Veränderung der Plazenta-Genexpression in einem frühen Entwicklungsstadium. Die Verwendung von RNA-Interferenz in vivo wurde in der Plazenta nur spärlich genutzt. Die Insertion von shRNA-Plasmiden kann ähnlich wie die in dieser Arbeit beschriebene CRIPSR-Technik durchgeführt werden. Dies wurde bei E13.5 durchgeführt, um die PlGF-Expression in der Plazenta erfolgreich zu verringern, mit Auswirkungen auf das Gehirnsystem der Nachkommen17.
Zusätzlich zu Techniken, die in erster Linie für Knockout oder Knockdown verwendet werden, wird die Induktion einer Überexpression häufig mit Adenoviren oder der Insertion eines exogenen Proteins durchgeführt. Die Techniken, die für die Überexpression verwendet werden, haben unterschiedliche Erfolgsraten und wurden meist später in der Trächtigkeit durchgeführt. Um die Rolle des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) in der Plazentafunktion zu untersuchen, wurde ein adenoviral vermittelter Plazenta-Gentransfer durchgeführt, um die Überexpression des IGF-1-Gens zu induzieren18,19. Dies wurde spät in der Trächtigkeit der Maus auf E18.5 mittels direkter Plazentainjektion durchgeführt. Um zusätzliche Optionen bereitzustellen und mögliche Misserfolge etablierter plazentagenetischer Manipulationen, wie z. B. Cre-Lox-Kombinationsfehler, die mögliche Toxizität von Adenoviren und die Off-Target-Effekte von shRNA, zu umgehen, kann in vivo die direkte CRISPR-Manipulation der Plazenta verwendet werden20,21,22. Dieses Modell wurde entwickelt, um das Fehlen von Überexpressionsmodellen zu beheben und ein Modell mit Flexibilität zu erstellen.
Diese Technik basiert auf der Arbeit von Lecuyer et al., in der shRNA- und CRISPR-Plasmide direkt in vivo auf die Plazenta der Maus gerichtet wurden, um die PlGF-Expression zu verändern 17. Diese Technik kann verwendet werden, um die Plazenta-Genexpression durch CRISPR-Manipulation zu mehreren Zeitpunkten direkt zu verändern. für diese Arbeit wurde E12.5 ausgewählt. Die Plazenta ist zu diesem Zeitpunkt gereift und groß genug, um sie zu manipulieren, was die Insertion eines spezifischen CRISPR-Plasmids auf E12.5 ermöglicht, was einen erheblichen Einfluss auf die fetale Entwicklung von der mittleren bis zur späten Schwangerschaft haben kann23,24. Im Gegensatz zu transgenen Ansätzen, aber ähnlich wie bei viralen Induktionen oder RNA-Interferenzen, ermöglicht diese Technik eine Überexpression oder einen Knockout zu bestimmten Zeitpunkten mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz, wodurch eine mögliche Beeinträchtigung der Plazentation oder embryonale Letalität durch frühere Veränderungen vermieden wird. Da nur wenige Plazenten das Versuchs- oder Kontrollplasmid innerhalb eines Wurfes erhalten, erlaubt der Ansatz zwei Arten von internen Kontrollen. Bei diesen Kontrollen handelt es sich um solche, die mit dem entsprechenden Kontrollplasmid injiziert und elektroporiert werden, und solche, die keine direkte Manipulation erhalten. Diese Technik wurde optimiert, um eine Überexpression des IGF-1-Gens in der Mausplazenta über ein synergistisches Aktivierungsmediator (SAM) CRISPR-Plasmid zu erzeugen. Die Wahl fiel auf das IGF-1-Gen, da es sich bei IGF-1 um ein essentielles Wachstumshormon handelt, das dem Fötus zugeführt wird und vor der Geburt hauptsächlich in der Plazenta produziert wird25,26. Diese neue, auf die Plazenta ausgerichtete CRISPR-Technik wird eine direkte Manipulation ermöglichen, um den Zusammenhang zwischen Plazentafunktion und fetaler Entwicklung zu definieren.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Röhrchen</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformeldhyd (PFA) in PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61899. </td><td></td>AP</tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Cornings</td><td>3598</td><td>Für BCA-Kit</td></tr><tr><td>Absorbent Underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Activation Control Plasmid</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-437275</td><td>Dnasefreies Wasser zur Verdünnung bereitgestellt</td></tr><tr><td>AMV Reverse Transkriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0277L</td><td>Verwendung für die cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>Anästhetikum Gasverdampfer</td><td>Vetamac</td><td>VAD-601TT</td><td>VAD-kompakter Verdampfer</td></tr><tr><td>Künstliches Tränengel</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Proteinquantifizierung</td></tr><tr><td>Biovortexer</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>198050000</td><td>Handheld-Gewebehomogenisator</td></tr><tr><td>CellSens Software</td><td>Olympus</td><td>V4.1.1</td><td>Bildverarbeitung für FISH-Bilder.</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>Plattenzentrifuge</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67241-AP</td><td>RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Applikatoren mit Wattespitze</td><td>ProAdvantage</td><td>77100</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 Control Plasmid</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-418922</td><td>Dnasefreies Wasser zur Verdünnung</td></tr><tr><td>bereitgestellt CryoStat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Leica</td><td>M125 C</td><td>Wird für die Bildgebung nach der Nekroskopie</td></tr><tr><td>verwendet Auflösbare Nähte</td><td>Med Vet International</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>Gibco</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190144</td><td>(-) Calcium; (-) Magnesium</td></tr><tr><td>ECM 830 Elektro-Elektroporator (Elektroporationsgerät)</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td>Nur Generator</td></tr><tr><td>Elektrorasierer</td><td>Wahl</td><td>CL9990</td><td>Kent Scientific</td></tr><tr><td>Elektroporationspaddel/Pinzetten</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td>Paddel mit 3 mm Durchmesser; Drähte enthalten</td></tr><tr><td>Einbettkassette: 250 PK</td><td>Grainger</td><td>21RK94</td><td>Plazenta-Einbettkassetten</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>268280010</td><td></td></tr><tr><td>F-Air Kanister</td><td>Penn Veterinary Supply Inc</td><td>BIC80120</td><td>Überschüssiger Isofluranfilter</td></tr><tr><td>Fast Green Dye FCF</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Auflösen auf 1 &mu; g/ml und Filter; Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Photometer (Plattenleser) auf FilterbasisFisher</td> <td>Scientific</td><td>14377576</td><td>Kann für BCA- und ELISA-Pinzetten</td></tr><tr><td></td><td>verwendet werden VWR</td><td>82027-386</td><td>Feine Spitzen, gerade, gezackt</td></tr><tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Glas Kapillaren - Borosilikatglas (Mikropipette)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-10</td><td>Außendurchmesser: 1,5 mm, Innendurchmesser: 0,86 mm, 10 cm Länge</td></tr><tr><td>Halt Protease- und Phosphotase-Inhibitor-Cocktail (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861281</td><td>Proteinhomogenisierungspuffer</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Thermotech</td><td>S766D</td><td>Digitales feuchtes Heizkissen</td></tr><tr>für<td>Hämostaten</td><td>VWR</td><td>10806-188</td><td>Vollständig umrandeter Kiefer;</td></tr><tr><td>gebogenes Heißwasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>20253</td><td>Isotemp 205</td></tr><tr><td>Igf-1 SAM Plasmid (m1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-421056-ACT</td><td>Dnasefreies Wasser zur Verdünnung bereitgestellt</td></tr><tr><td>Induktionskammer</td><td>Vetamac</td><td>941443</td><td>Keine spezifische Litergröße erforderlich</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Pharma Limited</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Isoproponal/2-Proponal</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td>RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Ketamin HCl 100mg/ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-114-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2/Magneisum Chlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td>1M. Protein-Homogenisierungspuffer</td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Optische 384-Well-Reaktionsplatte mit Barcode</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Barcode-Platten nicht erforderlich</td></tr><tr><td>Mikrokapillarspitze</td><td>Eppendorf</td><td>5196082001</td><td>Befestigung am BTX Microinjector</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0766</td><td>Pipettenhalter aus Edelstahl, 130 mm Länge, für 1 bis 1,5 mm Pipetten</td></tr><tr><td>Microject 1000A (Injektionsmaschine)</td><td>BTX Harvard Apparatur</td><td>45-0751</td><td>MicroJect 1000A Plus System</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher Modell P-97</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td> Flammender<td>/Brauner Mikropipettenabzieher</td></tr><tr><td>Mikroplattenmischer (Plattenschüttler)</td><td>scilogex</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Maus/Ratte IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit</td><td>R & D Systems</td><td>MG100</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln</td><td>BD - Becton, Dickson, and Company</td><td>305106</td><td>30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Stickstofftank</td><td>Linde</td><td>7727-37-9</td><td>Jedes innere Gas</td></tr><tr><td>Nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament (NSAID)</td><td>Norbrook Laboratories Limited</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>Analesgisch wie Meloxicam</td></tr><tr><td>Nasenkonus</td><td>Vetamac</td><td>921609</td><td>9-14 mm</td></tr><tr><td>Opal 620 Detektionsfarbstoff</td><td>Akoya Biosciences</td><td>SKU FP1495001KT</td><td>Verwendet für FISH</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstofftank</td><td>Linde</td><td>7782 - 44 - 7</td><td>Medizinischer Sauerstoff</td></tr><tr><td>Stößel</td><td>USA Scientific Inc</td><td>14155390</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung, 5%</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>Stromversorgung SYBR&Handel; Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4367659</td><td>Verwendung für qPCR</td></tr><tr><td>Random Hexamer (Random Primers)</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td>Verwendung für die cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Grainger</td><td>26X080</td><td></td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit & Konzentrator</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope kit v.2.5</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>323100</td><td>Enthält alle Reagenzien, die für die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung erforderlich sind. Sonden sind separat erhältlich.</td></tr><tr><td>RNAscope&Handel; Sonde - MM-PRL8A8-C2</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>&nbsp; 528641-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope & Handel Sonde - Vector-dCas9-3xNLS-VP64</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>527421</td><td></td></tr><tr><td>Roto-Therm Mini</td><td>Benchmark</td><td>R2020</td><td>Trockenofen für In-situ-Hybridisierung</td></tr><tr><td>Schere</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>Präparierschere, scharfe Spitze, 4&sup1;/?</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (Kochsalzlösung)</td><td>Hospra</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>steril,&nbsp; 0,9%</td></tr><tr><td>Natriumcitrat, Trinatriumsalz, Dihydrat, [Zitronensäure, Trinatriumdihydrat]</td><td>Research Product International</td><td>03-04-6132</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid 1N-Konzentrat, Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS277</td><td>Proteinhomogenisierungspuffer</td></tr><tr><td>Dampfgarer</td><td>Bella</td><td>B00DPX8UBA</td><td></td></tr><tr><td>Steriles OP-Abdecktuch</td><td>Busse</td><td>696</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Deckglas 24x60</td><td>Leica</td><td>3800160</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>BD - Becton, Dickson and Company</td><td>309659</td><td>BD Luer Slip Tip Spritze steril, Einmalgebrauch, 1 mL</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&Handel; Invitrogen&Handel; Nanodrop&Handel; Ein Spektralphotometer mit WiFi und Qubit&trade; 4 Fluorometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-400-525</td><td>Diese Konfiguration wird mit dem Qubit 4 Fluorometer geliefert. Qubit-Quantifizierung nicht erforderlich.</td></tr><tr><td>Gewebekleber</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>VetBond</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td>1M. Protein-Homogenisierungspuffer</td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018 RNA-Isolierung</td><td></td></tr><tr><td>TSA Buffer Pack</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>322810</td><td>Wird zur Verdünnung des Nachweisfarbstoffs Opal 620</td></tr><tr><td>verwendet Universal F-Circuit</td><td>Vetamac</td><td>40200</td><td>Wird an Vaporizer und Vaporizer-Zubehör befestigt</td></tr><tr><td>Aufrechte Verbindung Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX61VS</td><td>Wird für die FISH-Bildgebung verwendet</td></tr><tr><td>Vectorshield mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Deckglas Eindeckglas Eindeckmedium</td></tr><tr><td>ViiA&trade; 7 Real-Time PCR System mit 384-Well Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4453536</td><td>Dies ist für die Detektion von SYBR 384-Well-Blöcken. TaqMan und/oder kleinere Blöcke erhältlich</td></tr><tr><td>Wet n Wild Nagellack Wild Shine, Clear Nail Protector, Nagelfarbe</td><td>Amazon</td><td>C450B</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 20mg/ml</td><td>Anased</td><td>343730_RX</td><td></td></tr></tbody></table>

maus-in-vivo-plazenta-gezielte crispr-manipulation

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Die Plazenta ist ein essentielles Organ, das die Entwicklung von Säugetieren im Mutterleib reguliert und aufrechterhält. Die Plazenta ist verantwortlich für den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zwischen Mutter und Fötus sowie für die Produktion und Abgabe von Wachstumsfaktoren und Hormonen. Plazentare genetische Manipulationen bei Mäusen sind entscheidend für das Verständnis der spezifischen Rolle der Plazenta in der pränatalen Entwicklung. Plazenta-spezifische Cre-exprimierende transgene Mäuse haben eine unterschiedliche Wirksamkeit, und andere Methoden zur Manipulation von Plazenta-Genen können nützliche Alternativen sein. Diese Arbeit beschreibt eine Technik zur direkten Veränderung der plazentaren Genexpression mittels CRISPR-Genmanipulation, mit der die Expression von Zielgenen modifiziert werden kann. Bei einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz werden trächtige Muttertiere am Embryonaltag 12,5 (E12,5) einer Laparotomie unterzogen und ein CRISPR-Plasmid wird durch eine Glasmikropipette in die einzelnen Plazenten eingebracht. Das Plasmid wird sofort nach jeder Injektion elektroporiert. Nach der Wiederherstellung des Muttertiers können sich die Plazenta und die Embryonen bis zur Beurteilung zu einem späteren Zeitpunkt weiterentwickeln. Die Beurteilung der Plazenta und der Nachkommen nach der Anwendung dieser Technik kann die Rolle der zeitspezifischen Plazentafunktion in der Entwicklung bestimmen. Diese Art der Manipulation ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie sich die Genetik und Funktion der Plazenta auf das Wachstum und die Entwicklung des Fötus in verschiedenen Krankheitskontexten auswirkt.

Allgemeine Behandlungsergebnisse (Abbildung 6) In der Studie gab es drei manipulierte Gruppen. Dazu gehörten Plazenten, die mit einem allgemeinen CRISPR-Cas9-Kontrollplasmid (Cas9-Kontrolle), einem CRISPR-Plasmid zur Aktivierungskontrolle (Act Control) oder einem IGF-1-SAM-Aktivierungsplasmid (Igf1-OE) injiziert wurden. Die Cas9-Kontrolle ist besser für Knockout-Plasmide geeignet, und die Aktivierungskontrolle ist besser für Überexpressions-/Akti...

In dieser Arbeit beschreiben wir eine zeitspezifische Methode, um kritische Entwicklungswege in der Plazenta der Maus in vivo effektiv zu manipulieren. Dies geschieht durch die Injektion und Elektroporation von CRISPR-Plasmiden in die Plazenta trächtiger Muttertiere am Embryonaltag 12.5.

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Dieses Protokoll ist bedeutsam, da es eine zeitspezifische, gezielte Manipulation der Mausplazenten mittels CRISPR ermöglicht. Dies wird es den Forschern ermöglichen, bestimmte Genfunktionen während der mittleren bis späten Schwangerschaft aufzuklären. Genetische Manipulationen, die zu einer Überexpression in der Plazenta der Maus führen, sind sehr selten.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Reihe von Genexpressionsänderungen innerhalb der Plazenta ermöglicht. Lassen Sie sich nicht entmutigen, wenn vorläufige Bedingungen mit dieser Technik nicht erfolgreich sind. Da diese Technik eine Herausforderung ist, erfordert sie einige Zeit zum Üben, um sie zu beherrschen.Platzieren Sie zunächst den betäubten Damm in Rückenlage mit einem Nasenkegel zur Aufrechterhaltung der Anästhesie im Präparationsbereich. Rasieren Sie den Bauch des Damms gründlich. Um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, tragen Sie künstliches Tränengel auf beide Augen des Damms auf.Verwenden Sie dann sterile Applikatoren mit Wattespitze, um die Operationsstelle mit mindestens drei abwechselnden Runden einer Povidon-Jod-Lösung zu desinfizieren, gefolgt von 70%igem Ethanol mit einer letzten S

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des...

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Amnionhöhle der Maus bei E7.5 mit Lentivirus injiziert wird, was zu einer gleichmäßigen Transduktion der gesamten Neuralplatte führt, mit minimalen nachteiligen Auswirkungen auf das Überleben oder die Embryonalentwicklung.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Die Effizienz der I-GONAD-Methode (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) ist vergleichbar mit der herkömmlichen Mikroinjektion, bei der Zygotenentnahme von Spenderinnen und die Übertragung auf pseudoschwangere Frauen erforderlich ist. Dieses Protokoll demonstriert seine Wirksamkeit durch die Einführung von CRISPR/Cas9-induzierten Mutationen in den ROSA26-Locus auf Chromosom 6.

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

Lernen Sie eine zeitspezifische CRISPR-Methode zur gezielten Manipulation der Mausplazenta am embryonalen Tag 12,5 mittels Injektion und Elektroporation. Diese Technik ermöglicht die Aufklärung spezifischer Genfunktionen während der mittleren bis späten Schwangerschaft.

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

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