In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten, verschiedene Aspekte der Myelinisierung des peripheren Nervensystems in vitro zu untersuchen. Es ermöglicht die Myelinquantifizierung und die Untersuchung von Axon-Schwann-Zell-Interaktionen. Die Co-Kultur entwickelt ab dem 14. Tag eine robuste Myelinisierung.

Die DRG-Explantatkulturen bieten den Vorteil einer intakten Strukturarchitektur im Vergleich zu dissoziierten neuronalen Kulturen. Diese Methode steht zur Verfügung, um tropotische Verbindungen bei entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen des peripheren Nervensystems zu untersuchen. Sterilisieren Sie zunächst den Arbeitsbereich im Oberkörper der eingeschläferten Ratte mit 70%igem Ethanol.

Öffne das untere linke Glied der Ratte mit einer Schere und entferne vorsichtig den weiblichen Muskel des Bizeps. Lockern Sie den Ischiasnerv durch sanftes Anheben mit einer gebogenen Pinzette, um sicherzustellen, dass der Nerv nicht gequetscht wird. Übertragen Sie die abgeschnittenen Nerven mit einer Pinzette in eine Gewebekulturschale mit eiskaltem Leibovitz's L-15-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin.

Entfernen Sie dann mit einem Stereomikroskop Fett, Muskeln und Blutgefäße mit zwei feinen Zangenpaaren aus den Nerven. Identifizieren Sie die proximalen und distalen Enden des Ischiasnervs und entfernen Sie das Epineurium mit einer feinen Pinzette in proximaler bis distaler Richtung, während Sie das proximale Nervenende mit dem zweiten Paar feiner Pinzetten halten. Nachdem die gereinigten Nerven mit eiskaltem Leibovitz's L-15-Medium mit Gentamycin in eine andere Gewebekulturschale überführt wurden, werden die isolierten Nervenfaszikel mit zwei Paar feiner Pinzetten gereizt, um einzelne Nervenfasern zu trennen und zu isolieren.

Übertragen Sie die Nervenfasern mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette in ein 50-Milliliter-Röhrchen und nehmen Sie so wenig Medium wie möglich auf. Geben Sie dann 50 Milliliter des L15-Mediums von Leibovitz mit Gentamycin einige Male in die Nervenfasern. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den Nervenfasern bei 188 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Pellet mit dem restlichen L-15-Medium von Leibovitz in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale überführt. Spülen Sie das 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern der enzymatischen Verdauungslösung aus und geben Sie es in die Nervenfaserschale. Verteilen Sie die Nervenfasern vorsichtig mit der Spitze einer Pipette in der Schale.

Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid 18 Stunden inkubieren. Und stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie 10 Milliliter mit 40% FCS in HBSS hinzufügen. Die verdauten Nerven werden in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, um sie 10 Minuten lang bei 188 g bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren.

Nach der Entsorgung des Überstands wird das Pellet in 10 Millilitern DMEM, das 10 % FCS und 50 Mikrogramm Gentamycin enthält, erneut suspendiert. Als nächstes filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 188 G bei vier Grad Celsius wird das Pellet mit vier Millilitern DMEM, das FCS und Gentamycin enthält, erneut suspendiert.

Geben Sie je zwei Milliliter der Zellsuspension in die beiden Polylysin- und Laminin-beschichteten 60-Millimeter-Gewebekulturschalen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und lassen Sie die Platten zwei Tage lang unberührt im Inkubator. Zentrifugieren Sie die Schwann-Zellsuspension bei 188 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und suspendieren Sie das Zellpellet in 90 Mikrolitern magnetischem Zelltrennungspuffer pro einer mal 10 bis zur siebten Zellen.

Geben Sie dann 10 Mikroliter ti1-Mikrokügelchen pro einmal 10 zu den siebten Zellen. Inkubieren Sie die resuspendierte Lösung 15 Minuten lang im Dunkeln bei acht Grad Celsius. Als nächstes geben Sie zwei Milliliter in den magnetischen Zelltrennungspuffer zur Zellsuspension.

Nach dem Zentrifugieren bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird das Pellet in 500 Mikrolitern Magnetzellen-Trennpuffer resuspendiert. Setzen Sie die magnetische Zelltrennsäule in den Zellseparator ein und befeuchten Sie die Säule mit einem Milliliter des magnetischen Zelltrennpuffers. Bringen Sie dann die Zellen darauf an, um den Durchfluss für die Zentrifugation zu sammeln.

Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter einer euthanasierten trächtigen Ratte und legen Sie sie in eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit eiskaltem HBSS. Halten Sie die Gebärmutter mit einer gebogenen Pinzette fest und öffnen Sie die Gebärmutterwand mit einer feinen Pinzette. Nehmen Sie eine Fruchtblase heraus und öffnen Sie sie vorsichtig, indem Sie mit einer feinen Pinzette ein Loch einklemmen.

Entnehmen Sie schnell alle Embryonen aus der Gebärmutter und geben Sie sie in eine mit HBSS gefüllte Schale. Legen Sie vorsichtig einen Embryotorso in eine 35-Millimeter-Schale, die mit HBSS gefüllt ist. Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop den dorsalen Teil des Rumpfes, um den Embryo in zwei Hälften zu teilen.

Drehen Sie eine Hälfte zur Seite und identifizieren Sie den Strang der dorsalen Wurzelganglien (DRG), der sich in der Linie am dorsalen Teil des Embryos befindet. Schneiden Sie den DRG als ganzen Strang mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere aus. Nachdem Sie das DRG in eine frische Schale gegeben haben, die mit zwei Millilitern HBSS gefüllt ist, trennen Sie ein einzelnes DRG mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere vom restlichen Gewebe.

Nehmen Sie eine 4-Well-Platte mit 190 Mikrolitern DRG-Nährmedium in jede Vertiefung und übertragen Sie vorsichtig ein einzelnes DRG mit einer feinen Pinzette und einem Spatel in die Mitte jeder Vertiefung. Anschließend werden die DRG-Explantatkulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator gegeben. Geben Sie am nächsten Tag vorsichtig 50 Mikroliter des DRG-Nährmediums in jede Vertiefung und beobachten Sie die DRG-Explantat-Adhärenz und das Axonwachstum täglich mit einem Mikroskop.

Für die Co-Kultivierung am dritten Tag der DRG-Explantatkultur wird das DRG-Nährmedium vorsichtig durch 250 Mikroliter des Co-Kultivierungsmediums ersetzt, das 30.000 Schwann-Zellen pro Well enthält. Um eine immunzytochemische Färbung durchzuführen, fixieren Sie die Zellen auf den Deckgläsern, indem Sie die DPBS-gewaschenen Zellen 10 Minuten lang in 4%Paraformaldehyd inkubieren. Fotografieren Sie die immunzytochemisch gefärbten Proben an acht definierten Regionen rund um das DRG-Explantat in der Mitte mit einem inversen Mikroskop.

Das Erscheinungsbild von Schwannzellen mit einer länglichen und spindelförmigen Morphologie und den dünnen DRG-Axonen in einer Kokultur ist hier dargestellt. Die Myelinisierung in der Co-Kultur wurde an verschiedenen Tagen durch Färbung der DRG-Explantate und Schwann-Zellen auf Myelin-Basisprotein (MBP), Beta-Drei-Tubulin und DAPI untersucht. Das axonale Netzwerk in der Co-Kultur war dicht und veränderte sich im zeitlichen Verlauf der Beobachtung nicht sichtbar.

Erste Anzeichen einer Myelinisierung waren an den Tagen 10 und 12 der Co-Kultur sichtbar. Ab Tag 14 war das MVP-Signal ausgeprägter und myelinumhüllte Axone wurden detektiert. Die Myelinisierung nahm mit der Zeit der Co-Kultur bis zum 20. Tag zu.

Die Myelinisierung wurde als Verhältnis der MVP- und Beta-Drei-Tubulin-positiven Areale quantifiziert. An den Tagen 18 und 20 wurde ein signifikanter Anstieg der Myelinisierung im Vergleich zu Tag 10 beobachtet. DRG-Explantatkulturen sind zerbrechlich und müssen vorsichtig gehandhabt werden.

Zum Beispiel bei der Entnahme aus dem Inkubator oder beim Mediumwechsel und der Fixierung. Eine Genexpressionsanalyse von Co-Kulturproben kann gebildet werden, um Myelin genauer zu untersuchen. Hier konnten wir die Myelinmarker PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 an Tag 22 nachweisen.