Name: In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie die In-vitro-Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Ratten-Dorsalwurzelganglien und Schwann-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Myelin und die Untersuchung von Axon-Schwann-Zell-Interaktionen.

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Wir danken Prof. Dr. Ralf Gold und PD Dr. Gisa Ellrichmann für ihren Rat und ihre Unterstützung.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.
1. Schwann-Zellkultur
<ol><li>Beschichtung für Schwann-Zellkultur<ol><li>Beschichten Sie die Zellkulturschalen unter sterilen Bedingungen. Tragen Sie 2 ml 0,01 % Poly-L-Lysin (PLL) auf je zwei 60-mm-Gewebekulturschalen (TC) auf und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.</li>
		<li>Entfernen Sie die PLL, spülen Sie das TC-Geschirr 2x mit destilliertem Wasser und inkubieren Sie es mit 2 mL 1 μg/cm2 Laminin über Nacht bei 4 °C. Spülen Sie das TC-Geschirr 2x mit Aqua Dest und lassen Sie die Teller an der Luft trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Mediumpräparation für die Schwann-Zellkultur<ol><li>Bereiten Sie 50 ml Schwann-Zellmedium zu, indem Sie unter sterilen Bedingungen 10 % hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum (FCS), 2 μM Forskolin, 10 nM Neuregulin und 50 μg/ml Gentamycin zu Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F-12 (hoher Glukosegehalt) hinzufügen.</li>
		<li>Bereiten Sie 70 ml des L-15-Mediums von Leibovitz mit 50 μg/ml Gentamycin unter sterilen Bedingungen vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des Ischiasnervs HINWEIS: Alle Schritte zur Vorbereitung des Ischiasnervs werden unter einer sauberen Bank durchgeführt.<ol><li>Bereiten Sie eine 100-mm-TC-Schale mit 5 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco ohne Ca 2+ und Mg2+, eine 100-mm-TC-Schale mit 5 ml eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und eine 100-mm-TC-Schale mit 5 ml eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und 50 μg/ml Gentamycin vor.</li>
		<li>Reinigen Sie alle Instrumente durch Autoklavieren. Sprühen Sie die Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol ein.</li>
		<li>Euthanasieren Sie fünf 3 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten durch Inhalation und Enthauptung von CO2 . Besprühen Sie den Oberkörper der Ratte mit 70% Ethanol.</li>
		<li>Öffnen Sie die untere linke Rückengliedmaße mit einer Schere und entfernen Sie vorsichtig den Musculus biceps femoris. Lockern Sie den Ischiasnerv durch sanftes Anheben mit einer gebogenen Pinzette, um sicherzustellen, dass der Nerv nicht gequetscht wird.</li>
		<li>Halten Sie den proximalsten Teil des Nervs mit der gekrümmten Pinzette fest, um den Nerv zu begradigen, und schneiden Sie den Nerv mit einer Schere so hoch wie möglich ab. Schneiden Sie dann den Nerv in der Nähe des Plexus sacralis und der Pfote mit einer Schere ab. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4-1.3.5 für die rechte Seite. Anmerkungen: Achten Sie beim Öffnen der Gliedmaße darauf, keine Blutgefäße zu verletzen.</li>
		<li>Legen Sie den linken und rechten Ischiasnerv mit einer Pinzette in eine 100-mm-TC-Schale mit eiskaltem DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Sanierung des Ischiasnervs<ol><li>Mit einer Pinzette werden alle Nerven in eine 100-mm-TC-Schale mit eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und 50 μg/ml Gentamycin übertragen. Verwenden Sie weiterhin ein Stereomikroskop und entfernen Sie Fett, Muskeln und Blutgefäße mit zwei feinen Zangenpaaren aus den Nerven. Fassen Sie die Nerven mit einer Pinzette und übertragen Sie sie in eine 100-mm-TC-Schüssel mit eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz.</li>
		<li>Identifiziere die proximalen und distalen Enden des Ischiasnervs. Entfernen Sie das Epineurium mit einer feinen Pinzette in proximaler bis distaler Richtung, während Sie das proximale Nervenende mit der zweiten feinen Pinzette halten.</li>
		<li>Übertragen Sie die gereinigten Nerven in eine 100-mm-TC-Schale mit eiskaltem L-15-Medium von Leibovitz und 50 μg/ml Gentamycin. Necken Sie die isolierten Nervenfaszikel, um einzelne Nervenfasern mit zwei Paar feiner Pinzetten zu trennen und zu isolieren.</li>
		<li>Übertragen Sie die Nervenfasern mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein 50-ml-Röhrchen und nehmen Sie so wenig Medium wie möglich auf. Geben Sie 50 ml des L-15-Mediums von Leibovitz mit 50 μg/ml Gentamycin zu den Nervenfasern und schwenken Sie einige Male in das 50-ml-Röhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Enzymatische Verdauung des Ischiasnervs Anmerkungen: Die nächsten Schritte (Schritte 1.5-1.8, 2.1 und 2.2) werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.<ol><li>Bereiten Sie die enzymatische Verdauungslösung vor, die 0,25 % Dispase II, 0,05 % Kollagenase Typ I und 50 μg/ml Gentamycin in 10 ml DMEM (hoher Glukosegehalt) enthält.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 188 x g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand mit einer serologischen 25-ml-Pipette und übertragen Sie das Pellet mit dem restlichen L-15-Medium von Leibovitz mit einer 1.000-ml-Pipette in eine 60-mm-TC-Schale.</li>
		<li>Spülen Sie das 50-ml-Röhrchen mit 10 ml der enzymatischen Verdauungslösung aus und geben Sie es in die Schale mit den Nervenfasern. Verteilen Sie das Gewebe vorsichtig mit der Spitze einer Pipette in der Schale, um die zugängliche Oberfläche für die Verdauung zu maximieren.</li>
		<li>Bei 37 °C und 5 % CO 2 für 18 h inkubieren und den Aufschluss durch Zugabe von 10 ml 40 % FCS in Hanks' ausgewogener Salzlösung ohne Ca2 und Mg2+ (HBSS) stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zelltrennung<ol><li>Die verdauten Nerven werden mit einer serologischen Pipette in ein 50-ml-Röhrchen übertragen und bei 188 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml DMEM, das 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin enthält. Resuspendieren Sie das Pellet anschließend 20 Mal mit einer 10-ml-, 5-ml-, 2-ml-, 1-ml- und 200-μl-Pipettenspitze.</li>
		<li>Die Zellsuspension wird durch ein 100 μm Zellsieb gefiltert und bei 188 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 4 ml DMEM, das 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin enthält.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml der Zellsuspension in jede der beiden PLL- und lamininbeschichteten 60-mm-TC-Schalen und inkubieren Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2. Lassen Sie die Platten 2 Tage unberührt im Inkubator, um die Zellen vor mechanischer Belastung zu schützen und die Adhärenz zu unterstützen.</li>
	</ol></li>
	<li>Differenzierung von Schwann-Zellen<ol><li>Entfernen Sie nach 2 Tagen das Medium und spülen Sie die Platten 2x vorsichtig mit DMEM (hoher Glukosespiegel), 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin aus. Fügen Sie anschließend 2 ml Schwann-Zellmedium hinzu. Tauschen Sie das Schwann-Zellmedium jeden 2. Tag aus und beobachten Sie das Erscheinungsbild und die Konfluenz der Zellen mit einem Mikroskop. HINWEIS: Schwann-Zellen und DRG-Explantate müssen rechtzeitig und koordiniert für die Kokultur vorbereitet werden. Stellen Sie sicher, dass eine Ratte mit Embryonen bei E 13,5 für die DRG-Präparation zur Verfügung steht, wenn die Schwann-Zellen nahe einer Konfluenz von 80 % liegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zelltrypsinisierung und magnetische Trennung HINWEIS: Beispielhafte Bilder der verschiedenen Schwann-Zellkulturstadien finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.<ol><li>Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben (6-12 Tage Kultur), waschen Sie die Platten vorsichtig 2x mit 3 mL DPBS und inkubieren Sie sie mit 2 mL 0,05% Trypsin/EDTA (vorgewärmt auf 37 °C) für 3 min. Wenn sich die Zellen vom Plattenboden lösen, inaktivieren Sie die Verdauung durch Zugabe von 2 ml DMEM mit 10 % FCS und 50 μg/ml Gentamycin. Anmerkungen: Halten Sie sich an eine Trypsinisierungszeit von ausschließlich 3 Minuten und fahren Sie danach schnell fort.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml magnetischem Zellseparationspuffer, der DPBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 nM EDTA enthält. Kombinieren Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und zählen Sie die Zellen in einer Färbekammer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 188 x g für 10 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 90 μl magnetischem Zellseparationspuffer pro 1 x 107 Zellen . Fügen Sie 10 μl Thy-1-Mikrokügelchen pro 1 x 107 Zellen hinzu . Die Lösung wird einige Male resuspendiert und 15 Minuten im Dunkeln bei 8 °C inkubiert.</li>
		<li>2 ml des magnetischen Zelltrennpuffers in die Zellsuspension geben und bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Magnetzellen-Trennpuffer.</li>
		<li>Befeuchten Sie die magnetische Zelltrennsäule mit 1 ml des magnetischen Zelltrennpuffers. Setzen Sie die Magnetzellentrennsäule in den Magnetzellenseparator ein. Legen Sie die Zellen auf die magnetische Zelltrennsäule. Sammeln Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie ihn 10 min lang bei 300 x g bei 4 °C. HINWEIS: Fibroblasten werden positiv selektiert und verbleiben in der Säule, während Schwann-Zellen die Säule passieren. Fibroblasten können mit einem Stempel entnommen werden (z.B. als Negativkontrolle für Schwann-Zell-Färbeprotokolle).</li>
		<li>Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 1 ml des Kokulturmediums resuspendiert (siehe Schritt 3.1.1). Zählen Sie die Zellen nach der Färbung mit Trypanblau und einer Färbekammer.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DRG-Explantatkultur
<ol><li>DRG-Nährbodenaufbereitung<ol><li>Bereiten Sie das DRG-Nährmedium vor, indem Sie dem neurobasalen Medium 2 % B27, 2 % Pferdeserum, 1 % L-Glutamin, 0,5 % Penicillin/Streptomycin und 10 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) hinzufügen. Lagern Sie das Nährmedium bei 4 °C. HINWEIS: Das Nährmedium kann 2 Tage lang verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Beschichtung für DRG-Explantate<ol><li>Die Deckgläser in 70%igem Ethanol 1 h inkubieren und mit einer gebogenen Pinzette in die Vertiefungen von 4-Well-Schalen geben. Nach dem Trocknen des Ethanols werden 300 μl 0,2 mg/ml Poly-D-Lysin (PDL) pro Well aufgetragen und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.</li>
		<li>Waschen Sie die Deckgläser 3x nacheinander für je 5 min mit DPBS. Nehmen Sie das DPBS ab, tragen Sie 300 μl 1 μg/ml Laminin auf die Deckgläser auf und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2.</li>
		<li>Ersetzen Sie das DPBS nach drei Waschschritten mit DPBS für 5 min durch 190 μl DRG-Nährmedium. Legen Sie die 4-Well-Platten bei 37 °C und 5 % CO 2 in den Inkubator.</li>
	</ol></li>
	<li>DRG-Vorbereitung HINWEIS: Ernten Sie das DRG von embryonalen Ratten unter einer sauberen Bank.<ol><li>Reinigen Sie vor der Zubereitung alle Instrumente mit 70% Ethanol. Füllen Sie 10 (zwei pro Embryo) 35-mm-TC-Schalen mit 2 ml eiskaltem HBSS pro Schale und zwei 100-mm-TC-Schalen mit 5 ml eiskaltem HBSS pro Schale.</li>
		<li>Euthanasieren Sie die trächtigen Ratten (erwachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten, E13.5) durch CO2 - Inhalation und Enthauptung.</li>
		<li>Besprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol und öffnen Sie den ventralen Rumpf der Ratte. Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter und legen Sie sie in eine 100 mm TC-Schale mit eiskaltem HBSS.</li>
		<li>Halten Sie die Gebärmutter mit einer gebogenen Pinzette fest und öffnen Sie die Gebärmutterwand mit einer feinen Pinzette. Entfernen Sie eine Fruchtblase und öffnen Sie sie vorsichtig, indem Sie mit einer feinen Pinzette ein Loch einklemmen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Embryo aus dem umgebenden Gewebe, durchtrennen Sie die Nabelschnur und enthaupten Sie den Embryo mit einer feinen Pinzette. Legen Sie den Torso mit einer gebogenen Pinzette und einem Spatel in eine 100-mm-TC-Schale, die mit HBSS gefüllt ist.</li>
		<li>Entfernen Sie schnell alle Embryonen aus der Gebärmutter und übertragen Sie sie in eine 100-mm-TC-Schale, die mit HBSS gefüllt ist. Wenn mehr als fünf Embryonen vorhanden sind, ist eine zusätzliche 35-mm-TC-Schale mit 2 ml HBSS gemäß Schritt 2.3.1 vorzubereiten.</li>
		<li>Legen Sie einen Embryotorso vorsichtig mit einem Spatel und einer gebogenen Pinzette in eine 35-mm-TC-Schale, die mit HBSS gefüllt ist. Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop den dorsalen Teil des Rumpfes, um den Embryo mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere in zwei Hälften zu teilen. Drehen Sie eine Hälfte zur Seite und identifizieren Sie den DRG-Strang, der sich in einer Linie im dorsalen Teil des Embryos befindet.</li>
		<li>Schneiden Sie den DRG als ganzen Strang mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere aus. Legen Sie das DRG in eine frische 35-mm-TC-Schale, die mit 2 ml HBSS gefüllt ist, und trennen Sie ein einzelnes DRG mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere vom restlichen Gewebe.</li>
	</ol></li>
	<li>DRG-Zellkultur<ol><li>Bringen Sie 4-Well-Platten mit 190 μl DRG-Nährmedium aus dem Inkubator auf die Reinbank, wo das DRG aufbereitet werden soll. Übertragen Sie ein einzelnes DRG vorsichtig mit einer feinen Pinzette und einem Spatel in eine Vertiefung einer 4-Well-Kulturplatte. Platzieren Sie das DRG in der Mitte jeder Vertiefung, da eine zentrale Position für die Befestigung des DRG wichtig ist.</li>
		<li>Arbeiten Sie von nun an unter sterilen Bedingungen. Stellen Sie die Explantatkulturen bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator. Geben Sie am nächsten Tag vorsichtig 50 μl des DRG-Nährmediums mit einer 100-ml-Pipette in jede Vertiefung.</li>
		<li>Beobachten Sie die Adhärenz und das Axonwachstum des DRG-Explantops täglich mit einem Mikroskop und verwerfen Sie DRG-Explantate, die sich am Tag 3 der Kultur vom Deckglas gelöst haben oder nicht aus Axonen herausgewachsen sind. HINWEIS: DRG-Explantate sind in den ersten Tagen der Kultur sehr zerbrechlich und müssen mit Vorsicht behandelt werden, insbesondere beim Ein- und Ausfahren der Platten in den Inkubator, wenn das Medium gewechselt wird, oder sogar beim Schließen der Inkubatortür. Das exakte Volumen von 190 μl Medium pro Well ist entscheidend, um die DRG-Explantate am ersten Tag der Kultivierung an Ort und Stelle zu halten. Lose DRG-Explantaten können bei der täglichen Kontrolle leicht identifiziert werden, da sie im Medium schwimmen, anstatt am Deckglas zu haften.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kokultur
<ol><li>Transfer von Schwann-Zellen in die DRG-Explantatkultur<ol><li>Bereiten Sie das Kokulturmedium vor, indem Sie dem DRG-Nährboden 0,1%ige Ascorbinsäure hinzufügen.</li>
		<li>Ersetzen Sie an Tag 3 der DRG-Explantatkultur das DRG-Nährmedium vorsichtig durch 250 μl des Cokulturmediums mit 30.000 Schwann-Zellen (ab Schritt 1.8) pro Well.</li>
		<li>Bewahren Sie die Kokultur der DRG-Explantate und Schwann-Zellen bis zu 22 Tage auf. Ersetzen Sie jeden zweiten Tag vorsichtig 250 μl des Kokulturmediums und beobachten Sie das Aussehen der Zellen mit einem Mikroskop. HINWEIS: Ein Beispiel für DRG-Axone und Schwann-Zellen in der Kokultur in den ersten Tagen der Kultur finden Sie in Abbildung 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunzytochemische Färbung HINWEIS: Behandeln Sie die Kokulturproben während des Färbevorgangs äußerst vorsichtig, da sie leicht beschädigt werden können.<ol><li>Um die Zellen auf den Deckgläsern zu fixieren, entfernen Sie das Medium langsam, waschen Sie es 3x sorgfältig mit DPBS und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in 4%igem Paraformaldehyd (PFA). Ersetzen Sie das PFA durch DPBS und lagern Sie die fixierten Zellen bis zu 1 Woche bei 4 °C. VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit 4 % PFA die empfohlene persönliche Schutzausrüstung.</li>
		<li>Waschen Sie die Deckgläser 3x mit DPBS für 5 Minuten und blockieren Sie sie dann 1 Stunde lang mit Blockierlösung (10 % Ziegenserum, 10 % Rinderserumalbumin [BSA], 0,1 % Gelatine und 0,05 % Triton X-100) in DPBS. Die primären Antikörper βIII-Tubulin (1:7.500) und das basische Myelinprotein (MBP) (1:750) werden in der Blockierungslösung verdünnt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS für 5 min. Verwenden Sie fluoreszenzfarbstoffkonjugierte Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:1.000 in Blockierungslösung und inkubieren Sie sie 2 h lang bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 3x mit DPBS für 5 min und montieren Sie die Zellen auf mikroskopisch kleine Objektträger mit Fluoreszenzeinbettmedium, einschließlich 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Lagern Sie die Objektträger bis zur mikroskopischen Dokumentation im Dunkeln bei 4 °C. VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Fluoreszenz-Eindeckmedium die empfohlene persönliche Schutzausrüstung.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse<ol><li>Fotografieren Sie mit einem inversen Mikroskop acht definierte Bereiche rund um den DRG-Explantat in der Mitte.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um die Bereiche von βIII-Tubulin-positiven Axonen und Myelinisierung zu quantifizieren, die mit MBP gefärbt wurden.</li>
		<li>Berechnen Sie den prozentualen Anteil der Myelinisierung als Verhältnis der myelinisierten Axone und der nicht-myelinisierten Axone.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293(2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

In dieser Arbeit stellen wir ein schnelles und einfaches Protokoll für die Generierung von in vitro Myelinisierung vor, indem zwei separate Zelltypkulturen, Schwann-Zellen und dorsale Wurzelganglien-Explantate, zusammengeführt werden.
Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Kultivierung von DRG-Explantaten, insbesondere in den ersten Tagen der Kultur. DRG sind sehr fragil, bevor ein starkes axonales Netzwerk aufgebaut ist, und müssen sehr vorsichtig gehandhabt werden, z. B. bei ...

Im peripheren Nervensystem (PNS) wird die schnelle Informationstransduktion durch myelinumhüllte Axone vermittelt. Die Myelinisierung von Axonen ist essentiell, um eine schnelle Ausbreitung elektrischer Impulse zu ermöglichen, da die Leitungsgeschwindigkeit der Nervenfasern mit dem Axondurchmesser und der Myelindicke korreliert1. Die sensorische Signalübertragung von der Peripherie zum Zentralnervensystem (ZNS) beruht auf der Aktivierung sensorischer Neuronen erster Ordnung, die sich in Vergrößerungen der dorsalen Wurzel befinden, die als dorsale Wurzelganglien (DRG) bezeichnet werden. Für die Bildung und Aufrechterhaltung von Myelin ist eine kontinuierliche Kommunikation zwischen Axonen und Schwann-Zellen, den myelinisierenden Gliazellen im PNS, unerlässlich2.
Viele Erkrankungen des PNS stören die Informationsweiterleitung entweder durch primäre axonale oder demyelinisierende Schäden, was zu Hypästhesien oder Dysästhesien führt. Sensorische Neuronen erster Ordnung haben die Fähigkeit, sich nach einer neuronalen Schädigung durch eine komplexe Interaktion zwischen dem Neuron und den umgebenden Schwann-Zellen bis zu einem gewissen Grad zu regenerieren3. In diesem Fall können Schwann-Zellen eine zelluläre Reprogrammierung durchlaufen, um sowohl axonale als auch myelinale Trümmer zu beseitigen und die axonale Regeneration zu fördern, was zu einer Remyelinisierung führt4. Es ist wichtig, die Mechanismen der Myelinisierung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen, um mögliche Behandlungsoptionen für demyelinisierende Störungen des PNS zu finden. Myelin kann auch durch ein akutes Neurotrauma geschädigt werden, und Ansätze zur Förderung der Myelinisierung zur Förderung der funktionellen Erholung nach peripheren Nervenverletzungen werden untersucht5.
Unser Wissen über die periphere Myelinisierung hat weitgehend von myelinisierenden Kokulturen von Schwann-Zellen und sensorischen Neuronen profitiert. Seit der Anwendung der ersten Ansätze 6,7,8 wurde die Myelinisierung unter Verwendung verschiedener Kokultursysteme intensiv untersucht9,10,11. Hier stellen wir ein schnelles und einfaches Protokoll für eine robuste in vitro Myelinisierung von Axonen der dorsalen Wurzelganglien zur Verfügung. Das Protokoll für die Schwann-Zellpräparation basiert auf dem Protokoll von Andersen et al.12, das zuvor in Pitarokoili et al.13 veröffentlicht wurde. Wir verwenden Schwann-Zellen von juvenilen Ratten und embryonale DRG-Explantatkulturen für die Kokultur, bei der die Myelinisierung etwa am 14. Tag stattfindet. Ziel der Methode ist es, ein System zur Verfügung zu stellen, mit dem die Bildung von Myelin als Folge der direkten Axon-Schwann-Zell-Interaktion untersucht und Modulatoren der PNS-Myelinisierung untersucht werden können. Im Vergleich zu dissoziierten neuronalen Zellkulturen sind DRG-Explantate anatomisch besser erhalten und bilden lange axonale Fortsätze. Die Quantifizierung des myelinisierten Axonbereichs liefert einen ausreichenden Messwert für die Myelinisierung in der Kokultur. Die Methode ist ein wertvolles Werkzeug, um therapeutische Verbindungen auf ihre potenzielle Wirkung auf die PNS-Myelinisierung zu untersuchen, und kann auch zusätzlich zu In-vivo-Studien in Tiermodellen eingesetzt werden14.

<table><tbody><tr><td>Anti-MBP, Kaninchen</td><td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td><td>ABIN446360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&szlig; III-Tubulin, Maus&nbsp;</td><td>Biolegend, San Diego, USA</td><td>657402</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>A4403-100MG</td><td></td></tr><tr><td>B27-Ergänzung</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Biosphären-Filterspitze, 100 & micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>70760212</tr><tr><td>Biosphären-Filterspitze, 1250 & micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>701186210</tr><tr><td>Biosphere Filterspitze, 20 & Mikro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>701114210</tr><tr><td>Biosphären-Filterspitze, 300 & micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>70765210</tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland&nbsp;</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb, 100 & Mikro; M</td><td>BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator Heracell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Deckgläser 12 mm</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland&nbsp;</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene feine Zange</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>11370-42</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount-G(R)</td><td>Biozol, Eching, Deutschland</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>4942078001</tr><tr><td>Destilliertes Wasser (Wasseraufbereitungssystem)&nbsp;</td><td>Millipore, Molsheim, Frankreich</td><td>ZLXS5010Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>31331093</tr><tr><td>DPBS (kein Ca2+ und kein Mg2+)</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>VWR, Radnor, USA&nbsp;</td><td></td><td></td>1009862500</tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>F7524</td><td>FCS muss auf Schwann-Zellkultur getestet werden</td></tr><tr><td>Feine Pinzette (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>5710064</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (kein Ca2+ und kein Mg2+)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>14170138</tr><tr><td>HERAcell Inkubator</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Heraguard ECO 1.2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>51029882</tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Pan-Biotech, Aidenbach, Deutschland</td><td>P30-0712</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>HIH, Bethesda, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&akut; s L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>11415064</tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>25030024</tr><tr><td>MACS Multistand&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130042303</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Motic, Wetzlar, Deutschland</td><td>Motic BA 400</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Axio Beobachter 7</td><td>Zeiss, Oberkochen, Deutschland&nbsp;</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR, Radnor, USA&nbsp;</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130091632</td><td></td></tr><tr><td>MS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Zählkammer&nbsp;</td><td>Assistentin, Erlangen, Deutschland</td><td>40441 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin</td><td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>NGF</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>N1408</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Biozol, Eching, Deutschland</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon & Delta; Multischalen, 4 well</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Acros Organics, New Jersey, Vereinigte Staaten von Amerika</td><td></td><td></td>10342243</tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td>4430000018&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Reaktionsgefäße, 15&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>62554502</tr><tr><td>Reaktionsgefäße, 50&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>62547254</tr><tr><td>Reaktionsgefäße, 1,5 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>72690001</tr><tr><td>Sicherheitswerkbank S2020 1.8</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>51026640</tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>14083-08</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 10 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>861254025</tr><tr><td>Serologische Pipette, 25 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>861685001</tr><tr><td>Serologische Pipette, 5 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>861253001</tr><tr><td>Spatula</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Discovery.V8</td><td>Zeiss, Oberkochen, Deutschland&nbsp;</td><td>495015-0012-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>TC Schüssel 100, Zelle +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>833902300</tr><tr><td>TC Schüssel 35, Zelle +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>833900300</tr><tr><td>TC Schüssel 60, Zelle +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>833901300</tr><tr><td>Thy-1 Mikrokügelchen (MACS Kit)</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-094-523</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung 0,4%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>Trypsin (2,5%), ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland&nbsp;</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Typ I Kollagenase</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland&nbsp;</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad Typ 1008</td><td>GFL, Burgwedel, Deutschland&nbsp;</td><td>Nr. 4285</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro myelinisierung peripherer axone in einer kokultur von dorsalwurzelganglienexplantaten der ratte und schwann-zellen

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Der Prozess der Myelinisierung ist essentiell, um eine schnelle und ausreichende Signalübertragung im Nervensystem zu ermöglichen. Im peripheren Nervensystem interagieren Neuronen und Schwann-Zellen in einem komplexen Zusammenspiel, um die Myelinisierung von Axonen zu steuern. Störungen dieses Zusammenspiels und der Abbau der Myelinscheide sind Kennzeichen entzündlicher Neuropathien und treten sekundär bei neurodegenerativen Erkrankungen auf. In dieser Arbeit stellen wir ein Kokulturmodell von Explantaten aus dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen vor, das eine robuste Myelinisierung peripherer Axone entwickelt, um den Prozess der Myelinisierung im peripheren Nervensystem zu untersuchen, Axon-Schwann-Zell-Interaktionen zu untersuchen und die potenziellen Auswirkungen von Therapeutika auf jeden Zelltyp separat zu bewerten. Methodisch wurden dorsale Wurzelganglien embryonaler Ratten (E13.5) geerntet, von ihrem umgebenden Gewebe dissoziiert und 3 Tage lang als ganze Explantate kultiviert. Schwann-Zellen wurden aus 3 Wochen alten erwachsenen Ratten isoliert und Ischiasnerven enzymatisch verdaut. Die resultierenden Schwann-Zellen wurden durch magnetisch aktivierte Zellsortierung gereinigt und unter Neuregulin- und Forskolin-angereicherten Bedingungen kultiviert. Nach 3-tägiger dorsaler Wurzelganglien-Explantatkultur wurden 30.000 Schwann-Zellen in einem ascorbinsäurehaltigen Medium zu einem dorsalen Wurzelganglien-Explantat hinzugefügt. Die ersten Anzeichen einer Myelinisierung wurden am 10. Tag der Kokultur durch gestreute Signale für das basische Myelinprotein in der immunzytochemischen Färbung nachgewiesen. Ab dem 14. Tag bildeten sich Myelinscheiden, die sich entlang der Axone ausbreiteten. Die Myelinisierung kann durch die Färbung des basischen Myelinproteins als Verhältnis der Myelinisierungsfläche und der Axonfläche quantifiziert werden, um die Unterschiede in der axonalen Dichte zu berücksichtigen. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten, verschiedene Aspekte der peripheren Myelinisierung in vitro zu untersuchen, was für das Verständnis der Pathologie und der möglichen Behandlungsmöglichkeiten der Demyelinisierung und Neurodegeneration bei entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen des peripheren Nervensystems von entscheidender Bedeutung ist.

Die Myelinisierung in der Kokultur wurde an den Tagen 10, 12, 14, 16, 18 und 20 beurteilt. Die DRG-Explantaten und Schwann-Zellen wurden auf MBP, βIII-Tubulin und DAPI gefärbt. Das axonale Netzwerk in der Kokultur war dicht und veränderte sich im zeitlichen Verlauf der Beobachtung nicht sichtbar. Die ersten Anzeichen von Myelin in Form von kleinen Fragmenten waren an Tag 10 nachweisbar und nahmen an Tag 12 zu (Abbildung 2). Die MBP-positiven Bereiche nahmen im Laufe der Zeit bis zum 20. Tag ...

Im Kokultursystem von dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen kann die Myelinisierung des peripheren Nervensystems untersucht werden. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten zur Beobachtung und Quantifizierung der peripheren Myelinisierung und zur Untersuchung der Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Myelinscheide.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten, verschiedene Aspekte der Myelinisierung des peripheren Nervensystems in vitro zu untersuchen. Es ermöglicht die Myelinquantifizierung und die Untersuchung von Axon-Schwann-Zell-Interaktionen. Die Co-Kultur entwickelt ab dem 14. Tag eine robuste Myelinisierung.Die DRG-Explantatkulturen bieten den Vorteil einer intakten Strukturarchitektur im Vergleich zu dissoziierten neuronalen Kulturen. Diese Methode steht zur Verfügung, um tropotische Verbindungen bei entzündlichen und neurodegenerativen Erkrankungen des peripheren Nervensystems zu untersuchen. Sterilisieren Sie zunächst den Arbeitsbereich im Oberkörper der eingeschläferten Ratte mit 70%igem Ethanol.Öffne das untere linke Glied der Ratte mit einer Schere und entferne vorsichtig den weiblichen Muskel des Bizeps. Lockern Sie den Ischiasnerv durch sanftes Anheben mit einer gebogenen Pinzette, um sicherzustellen, dass der Nerv nicht gequetscht wird. Übertragen Sie die abgeschnittenen Nerven mit einer Pinzette in eine Gewebekulturschale mit eiskaltem Leibovitz's L-15-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin.Entfernen Sie dann mit einem Stereomikroskop Fett, Muskeln und Blutgefäße mit zwei feinen Zangenpaaren aus den Nerven. Identifizieren Sie die proximalen und distalen Enden des Ischiasnervs und entfernen Sie das Epineurium mit einer feinen Pinzette in proximaler bis distaler Richtung, während Sie das proximale Nervenende mit dem zweiten Paar feiner Pinzetten halten. Nachdem die gereinigten Nerven mit eiskaltem Leibovitz's L-15-Medium mit Gentamycin in eine andere Gewebekulturschale überführt wurden, werden die isolierten Nervenfaszikel mit zwei Paar feiner Pinzetten gereizt, um einzelne Nervenfasern zu trennen und zu isolieren.Übertragen Sie die Nervenfasern mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette in ein 50-Milliliter-Röhrchen und nehmen Sie so wenig Medium wie möglich auf. Geben Sie dann 50 Milliliter des L15-Mediums von Leibovitz mit Gentamycin einige Male in die Nervenfasern. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den Nervenfasern bei 188 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Pellet mit dem restlichen L-15-Medium von Leibovitz in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale überführt. Spülen Sie das 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern der enzymatischen Verdauungslösung aus und geben Sie es in die Nervenfaserschale. Verteilen Sie die Nervenfasern vorsichtig mit der Spitze einer Pipette in der Schale.Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid 18 Stunden inkubieren. Und stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie 10 Milliliter mit 40% FCS in HBSS hinzufügen. Die verdauten Nerven werden in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, um sie 10 Minuten lang bei 188 g bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren.Nach der Entsorgung des Überstands wird das Pellet in 10 Millilitern DMEM, das 10 % FCS und 50 Mikrogramm Gentamycin enthält, erneut suspendiert. Als nächstes filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 188 G bei vier Grad Celsius wird das Pellet mit vier Millilitern DMEM, das FCS und Gentamycin enthält, erneut suspendiert.Geben Sie je zwei Milliliter der Zellsuspension in die beiden Polylysin- und Laminin-beschichteten 60-Millimeter-Gewebekulturschalen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und lassen Sie die Platten zwei Tage lang unberührt im Inkubator. Zentrifugieren Sie die Schwann-Zellsuspension bei 188 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und suspendieren Sie das Zellpellet in 90 Mikrolitern magnetischem Zelltrennungspuffer pro einer mal 10 bis zur siebten Zellen.Geben Sie dann 10 Mikroliter ti1-Mikrokügelchen pro einmal 10 zu den siebten Zellen. Inkubieren Sie die resuspendierte Lösung 15 Minuten lang im Dunkeln bei acht Grad Celsius. Als nächstes geben Sie zwei Milliliter in den magnetischen Zelltrennungspuffer zur Zellsuspension.Nach dem Zentrifugieren bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird das Pellet in 500 Mikrolitern Magnetzellen-Trennpuffer resuspendiert. Setzen Sie die magnetische Zelltrennsäule in den Zellseparator ein und befeuchten Sie die Säule mit einem Milliliter des magnetischen Zelltrennpuffers. Bringen Sie dann die Zellen darauf an, um den Durchfluss für die Zentrifugation zu sammeln.Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter einer euthanasierten trächtigen Ratte und legen Sie sie in eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit eiskaltem HBSS. Halten Sie die Gebärmutter mit einer gebogenen Pinzette fest und öffnen Sie die Gebärmutterwand mit einer feinen Pinzette. Nehmen Sie eine Fruchtblase heraus und öffnen Sie sie vorsichtig, indem Sie mit einer feinen Pinzette ein Loch einklemmen.Entnehmen Sie schnell alle Embryonen aus der Gebärmutter und geben Sie sie in eine mit HBSS gefüllte Schale. Legen Sie vorsichtig einen Embryotorso in eine 35-Millimeter-Schale, die mit HBSS gefüllt ist. Öffnen Sie unter einem Stereomikroskop den dorsalen Teil des Rumpfes, um den Embryo in zwei Hälften zu teilen.Drehen Sie eine Hälfte zur Seite und identifizieren Sie den Strang der dorsalen Wurzelganglien (DRG), der sich in der Linie am dorsalen Teil des Embryos befindet. Schneiden Sie den DRG als ganzen Strang mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere aus. Nachdem Sie das DRG in eine frische Schale gegeben haben, die mit zwei Millilitern HBSS gefüllt ist, trennen Sie ein einzelnes DRG mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere vom restlichen Gewebe.Nehmen Sie eine 4-Well-Platte mit 190 Mikrolitern DRG-Nährmedium in jede Vertiefung und übertragen Sie vorsichtig ein einzelnes DRG mit einer feinen Pinzette und einem Spatel in die Mitte jeder Vertiefung. Anschließend werden die DRG-Explantatkulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator gegeben. Geben Sie am nächsten Tag vorsichtig 50 Mikroliter des DRG-Nährmediums in jede Vertiefung und beobachten Sie die DRG-Explantat-Adhärenz und das Axonwachstum täglich mit einem Mikroskop.Für die Co-Kultivierung am dritten Tag der DRG-Explantatkultur wird das DRG-Nährmedium vorsichtig durch 250 Mikroliter des Co-Kultivierungsmediums ersetzt, das 30.000 Schwann-Zellen pro Well enthält. Um eine immunzytochemische Färbung durchzuführen, fixieren Sie die Zellen auf den Deckgläsern, indem Sie die DPBS-gewaschenen Zellen 10 Minuten lang in 4%Paraformaldehyd inkubieren. Fotografieren Sie die immunzytochemisch gefärbten Proben an acht definierten Regionen rund um das DRG-Explantat in der Mitte mit einem inversen Mikroskop.Das Erscheinungsbild von Schwannzellen mit einer länglichen und spindelförmigen Morphologie und den dünnen DRG-Axonen in einer Kokultur ist hier dargestellt. Die Myelinisierung in der Co-Kultur wurde an verschiedenen Tagen durch Färbung der DRG-Explantate und Schwann-Zellen auf Myelin-Basisprotein (MBP), Beta-Drei-Tubulin und DAPI untersucht. Das axonale Netzwerk in der Co-Kultur war dicht und veränderte sich im zeitlichen Verlauf der Beobachtung nicht sichtbar.Erste Anzeichen einer Myelinisierung waren an den Tagen 10 und 12 der Co-Kultur sichtbar. Ab Tag 14 war das MVP-Signal ausgeprägter und myelinumhüllte Axone wurden detektiert. Die Myelinisierung nahm mit der Zeit der Co-Kultur bis zum 20. Tag zu.Die Myelinisierung wurde als Verhältnis der MVP- und Beta-Drei-Tubulin-positiven Areale quantifiziert. An den Tagen 18 und 20 wurde ein signifikanter Anstieg der Myelinisierung im Vergleich zu Tag 10 beobachtet. DRG-Explantatkulturen sind zerbrechlich und müssen vorsichtig gehandhabt werden.Zum Beispiel bei der Entnahme aus dem Inkubator oder beim Mediumwechsel und der Fixierung. Eine Genexpressionsanalyse von Co-Kulturproben kann gebildet werden, um Myelin genauer zu untersuchen. Hier konnten wir die Myelinmarker PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 an Tag 22 nachweisen.

in-vitro-myelination-peripheral-axons-coculture-rat-dorsal-root

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

A-Protokolle für eine embryonale Rattenhirn Aggregat-Kultur-System beschrieben wird. Multipotente Vorläuferzellen in die Aggregate entwickeln können und differenzieren sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten.

Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) aus Rattenembryonen und deren Co-Kultivierung mit Schwann-Zell-Vorläufern, um reife Schwann-Zellen zu erzeugen. Die isolierten DRGs werden verarbeitet, um Neuronen und Gliazellen zu isolieren. Die isolierten Zellen werden kultiviert, um die Neuronen zu reinigen, die dann mit Schwann-Zell-ähnlichen Zellen (SCLCs) in einem Co-Kulturmedium co-kultiviert werden. Die Interaktion mit den DRG-Neuronen führt...

Isolierung von DRG-Neuronen und Kokultur mit Schwann-Zell-Vorläufern zur Erzeugung von Schwann-Zellen

Das Video zeigt die Co-Kultivierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit Schwann-Zellen. DRG-Neuronen werden zunächst auf einer vorgedehnten Membran gezüchtet, um das Axonwachstum auszurichten. Dann werden Schwann-Zellen eingeführt, die sich an die Axone anheften, sie isolieren und das Überleben und die Funktion der Nervenzellen fördern.

Co-Kultur von Schwann-Zellen mit DRG-Neuronen auf einer vorgedehnten Membran

Dieses Video zeigt das Coculturing-Modell eines Explantats aus dem Spinalwurzelganglion und Schwann-Zellen. Unter Kokulturbedingungen fördert Ascorbinsäure die Differenzierung von Schwann-Zellen in myelinisierende Formen. Myelinisierende Schwann-Zellen umhüllen die Axone mehrmals, um eine Myelinscheide zu bilden, die für die Nervenfunktion unerlässlich ist.

Co-Kultivierung eines Explantats eines Spinalganglien-Explantats mit Schwann-Zellen für die Myelinisierung von Neuronen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von Schwann-Zellen aus Ischias-Nervenfasern von Mäusen.

Magnetische Trennung von Schwann-Zellen von Ischiasnerven der Maus

Hier präsentieren wir Protokolle, die eine flexible und strategische Grundlage für die virale Manipulation von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen bieten, um interessante Proteine zu überexprimieren, um ihre Rolle in Oligodendrozyten spezifisch über das in vitro-Modell der Myelinisierung des Zentralnervensystems zu untersuchen.

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays

Spinalganglien (DRG) sind Strukturen, die die sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems. Wenn distanziert, sie co-kultiviert mit SC-wie Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) sein kann, eine wertvolle Modell zur in-vitro-Nervenregeneration und Myelinisierung zu untersuchen, imitiert die in vivo-Umgebung an der Verletzungsstelle.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung ganzer und dissoziierter Kulturen von dorsalen Wurzelganglien (DRG) der Maus und deren Verwendung zur Beurteilung von Tumor-Nerven-Interaktionen.

Etablierung von In-vitro-Modellen der Kultur der Spinalganglien: Komplementäre Ansätze zur Untersuchung der Krebs-Nerven-Wechselwirkung

Erfahren Sie die In-vitro-Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Ratten-Dorsalwurzelganglien und Schwann-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Myelin und die Untersuchung von Axon-Schwann-Zell-Interaktionen.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

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