Zellkulturtechniken und -praktiken zur Vermeidung von Kontaminationen durch Pilze und Bakterien im Forschungszellkulturlabor

Die Zellkultur ist eine heikle Fertigkeit, die für die Züchtung verschiedener Arten von Zellen und Geweben in einer kontrollierten Laborumgebung erforderlich ist. Das Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturen ist die Kontamination. Diese Kontamination kann in Form von Bakterien, Schimmelpilzen oder Mykoplasmen auftreten.

Die in diesem Video beschriebenen Techniken und Praktiken stellen sicher, dass Ihre Zellen lebensfähig, gesund und kontaminationsfrei bleiben. Diese Praktiken sollten strikt eingehalten werden, und das gesamte Laborpersonal sollte mindestens einmal im Jahr geschult werden. Tragen Sie vor Beginn der Arbeit einen sauberen Laborkittel, der nur für die Verwendung im Zellkulturraum bestimmt ist.

Tragen Sie neue Handschuhe, die keine anderen Oberflächen berührt haben. Achten Sie darauf, dass die Handschuhe fest sitzen. Am besten eignen sich puderfreie Handschuhe aus Nitril.

Der Laborkittel und die Handschuhe müssen nicht steril sein. Zur Vorbereitung auf die Arbeit Handschuhe, Laborkittelärmel und das Innere der biologischen Sicherheitswerkbank mit 70%igem Ethanol einsprühen. Sprühen Sie die Arbeitsfläche, die Seiten, die Rückseite, alle Gegenstände im Schrank und die vordere Glasscheibe sowohl von innen als auch von außen ein.

Wischen Sie die Arbeitsfläche und die Glasscheibe mit einem fusselfreien Papiertuch trocken. Nehmen Sie sich etwas Zeit, um den Arbeitsbereich im Schrank einzurichten. Halten Sie Wasserbäder im Zellkulturraum und verwenden Sie diese nur für Zellkulturzwecke, wie z. B. zum Erwärmen von Medien oder Auftauen von Zellen.

Die Wasserbäder sollten einmal pro Woche abgelassen und gewaschen werden. Begrenzen Sie die Menge der Gegenstände, die in den Schrank gebracht werden, und unterbrechen Sie den Luftstrom in der biologischen Sicherheitswerkbank nicht, indem Sie die vorderen oder hinteren Gitter blockieren. Sprühen Sie alle Gegenstände im Schrank mit 70%igem Ethanol ein und wischen Sie sie trocken.

Beginnen Sie damit, die Oberseite der Medienflasche zu besprühen, und arbeiten Sie sich nach unten vor. Beginnen Sie mit einem sauberen Papiertuch von oben, um die Medienflasche trocken zu wischen, und arbeiten Sie sich nach und nach nach nach unten vor. Gehen Sie nicht wieder nach oben in Richtung der Kappe.

Die Funktionsweise dieser Schränke besteht darin, dass sie Luft aus dem Raum und dem Schrank selbst durch die vorderen und hinteren Gitter ziehen. Die Luft strömt nach hinten in den Schrank und nach oben. Dort gelangt die verunreinigte Luft durch einen Haufen von Filtern, und ein Teil der gefilterten Reinluft wird auf den Arbeitsbereich im Schrank gedrückt.

Wenn der Schrank groß genug ist, um serologische Pipetten aufzunehmen, können sie im Inneren platziert werden, andernfalls können sie in einem Behälter aufbewahrt werden, der an der Außenseite des Schranks montiert ist. Es empfiehlt sich, beide Seiten der umhüllten Pipette vor der Verwendung auf Löcher, Risse oder Einstiche in der Verpackung zu überprüfen. Reißen Sie die Verpackung nicht ab.

Schälen Sie stattdessen vorsichtig die Enden der Verpackung. Führen Sie die serologische Pipette in eine Pipettenhilfe ein und entfernen Sie die Umhüllung in einer flüssigen Bewegung. Bewegen Sie den Mauszeiger nicht über geöffnete Flaschen oder Flaschen.

Es wird nicht empfohlen, über eine offene Flasche oder Flasche zu greifen oder über offenen Flaschen zu arbeiten. Der Luftstrom in den Schränken drückt auf alles im Inneren. Wenn Sie darüber greifen, können Sie Ihren Ärmel oder Handschuh auf Gegenständen legen, die möglicherweise Verunreinigungen auf Ihrem Ärmel in Ihre Zellkultur drücken könnten.

Gießen Sie nach Möglichkeit keine Flüssigkeiten ein. Fügen Sie sie stattdessen mit einer serologischen Pipette hinzu. Mischen Sie den Inhalt gründlich und initialisieren Sie die Flasche.

Schreiben Sie auf, womit die Medien ergänzt werden. Wenn Sie mit adhärenten Kulturen arbeiten und eine Plastikflasche benötigen, sprühen Sie die gesamte Packung ein und holen Sie sie hinein. Wenn Ihre Handschuhe getrocknet sind, sprühen Sie sie erneut mit dem Ethanol ein.

Wenn Sie mit einer adhärenten Zelllinie arbeiten, verwenden Sie autoklavierte Glaspipetten oder sterile Einwegpipetten aus Kunststoff, um Medien oder Waschlösungen anzusaugen. Entfernen Sie vorsichtig die Metallkappe vom Vorratsbehälter. Isolieren Sie eine Glaspipette, indem Sie den Behälter vorsichtig schräg schütteln.

Wenn Sie in den Behälter greifen, vermeiden Sie es, andere Pipetten zu berühren. Fassen Sie die gewählte Pipette nur von einem Ende aus an. Setzen Sie die Verschlüsse von Flaschen und Flaschen so schnell wie möglich wieder auf.

Legen Sie die Kappen verkehrt herum auf die Arbeitsfläche, damit der Rand die Arbeitsfläche nicht berührt. Fassen Sie die Kappe nicht von oben oder unten. Berühren Sie stattdessen die Kappen von den Seiten.

Verwenden Sie zum Absaugen von Flüssigkeiten einen Vakuumkolben, der sich außerhalb des Schranks in einem sekundären Behälter auf dem Boden befindet. Bei der Arbeit im Schrank entsteht Abfall. Da das zu häufige Ein- und Ausfahren der Hände in den Schrank den Luftstrom unterbricht, ist es in Ordnung, Abfälle vorübergehend im Schrank zu lassen.

Legen Sie es zur Seite, damit es Ihre Arbeit nicht unterbricht. Besprühen Sie die Handschuhe großzügig mit 70 % Ethanol, wenn sie trocken sind. Reiben Sie Ihre Hände aneinander, damit sie nicht tropfnass sind.

Eine kurze Anmerkung zu serologischen Pipetten. Wenn sie versehentlich etwas anderes in der Haube berühren, zögern Sie nicht, sie wegzuwerfen. Es ist am besten, mit einer sauberen serologischen Pipette neu zu beginnen, anstatt eine zu verwenden, die möglicherweise kontaminiert ist.

Bevor Sie die Zellen in den Inkubator legen, überprüfen Sie, wie sie unter dem Mikroskop aussehen. Einzelne Zellen sollten beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die Zellen gründlich resuspendiert wurden.

Sprechen, niesen, husten oder schwer atmen Sie nicht in die Inkubatoren. Schnelles Öffnen und Schließen von Inkubatortüren. Wenn Sie sie länger als nötig offen lassen, können in der Luft vorhandene Verunreinigungen in die Inkubatoren gelangen.

Stellen Sie sicher, dass die Verschlüsse aller Flaschen gründlich verschlossen sind, bevor Sie sie aus dem Schrank nehmen. Medien sind lichtempfindlich. Es sollte bei Nichtgebrauch im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Sprühen Sie das Innere des Schranks nach Abschluss der Zellkulturarbeit erneut mit 70%igem Ethanol ein und wischen Sie die Oberfläche mit einem Papiertuch trocken. Leeren Sie den Beutel für biologisch gefährliche Abfälle. Wiederholen Sie diesen Vorgang und ersetzen Sie die Handschuhe, wenn Sie zu einer anderen Zelllinie wechseln.

Wenn Sie mit Suspensionskulturen arbeiten, die in Glaskolben gezüchtet wurden, stellen Sie sicher, dass die Handschuhe nass sind. Berühren Sie die Alufolie mit Ihren nassen Handschuhen und besprühen Sie dann nur den Boden der Flasche, bevor Sie sie in die biologische Sicherheitswerkbank stellen. Wenn Sie eine Probe für die Zellzählung entnehmen, nehmen Sie nur ein 1,5-ml-Röhrchen aus dem Behälter.

Berühren Sie keine der anderen Röhren. Legen Sie die Kappe verkehrt herum auf die Arbeitsfläche. Berühren Sie nicht die innere Felge.

Behandeln Sie es vorsichtig von den Seiten und ersetzen Sie es, wenn Sie fertig sind. Entfernen Sie beim Umgang mit Suspensionszellen und Glaskolben vorsichtig das doppelt gefaltete Stück Aluminiumfolie, das den gesamten Flaschenhals bedeckt. Ziehen Sie vorsichtig an allen vier Ecken und legen Sie die Folie verkehrt herum auf die Arbeitsfläche.

Fassen Sie den Glaskolben nur von unten an. Berühren Sie es nicht vom Hals aus, wenn die Folie abgenommen ist. Verwenden Sie eine serologische 1-ml-Pipette, um eine Probe für die Zellzählung zu entnehmen.

Lassen Sie das Medium nicht an der Seite der Kolben heruntertropfen. Wenn dies der Fall ist, sprühen Sie das Papiertuch mit 70%igem Ethanol ein und reinigen Sie es sofort. Stellen Sie sicher, dass die Kappen oder die Aluminiumfolie festgezogen sind, bevor Sie Flaschen oder Flaschen aus den biologischen Sicherheitswerkbänken entfernen.

Verwenden Sie separate Inkubatoren für verschiedene Zelltypen. Dadurch wird eine Kreuzkontamination verschiedener Zelltypen verhindert. Es wird empfohlen, den Isolierkolben zum Auffangen von flüssigen Abfällen außerhalb des Schranks auf dem Boden in einem sekundären Behälter mit der Bezeichnung Abfall aufzustellen.

Der Schlauch ist an einen Filter angeschlossen, der monatlich ausgetauscht wird. Der Schlauch wird durch die Seite des Schranks eingeführt. Entfernen Sie den Müll für biologische Gefahren, sobald die Arbeit abgeschlossen ist.

Führen Sie ein Gläserspülprotokoll an der Wand neben dem Waschbecken auf. Weichen Sie die verworfenen Zellen zunächst etwa fünf Minuten lang mit 10%igem Bleichmittel ein. Entsorgen Sie dann die Bleichmittelmischung und spülen Sie den Kolben gründlich mit Wasser aus.

Seife mit Wasser hinzufügen, mit einer Bürste sehr gut schrubben, mit mehr Wasser abspülen. Und dann ist der letzte Schritt, die Gläser mit dem DI-Wasser aus dem Wasserhahn rechts zu spülen. Gläser so schnell wie möglich waschen, die Gläser gut schrubben.

Sf9-Zellen hinterlassen diesen Rand abgestorbener Zellen, wenn sie nicht richtig geschrubbt werden. Verwenden Sie diese Kolben nur für Zellkulturen und autoklavieren Sie Zellkulturglaswaren, anstatt sie an eine Glaswaschanlage zu senden. Verwenden Sie den Vakuumzyklus auf dem Autoklaven für 40 Minuten sterilisierte Zeit und 40 Minuten Trocknungszeit.

Bewahren Sie es getrennt von Glaswaren im Hauptbereich des Labors auf. Organisieren Sie den Zellkulturraum so, dass sich alle Vorräte in einem Bereich befinden, wodurch die Notwendigkeit für Labormitglieder, den Zellkulturraum auf der Suche nach Vorräten zu verlassen, minimiert wird. Beschriften Sie alle Plastikflaschen, die zur Entnahme von Zellen verwendet und anschließend in der Zellkultur wiederverwendet werden, nur für die Verwendung in Zellkulturen.

Verwenden Sie die dafür vorgesehenen Zellkulturflaschen für einen bestimmten Zelltyp. Bewahren Sie diese Flaschen im Zellkulturraum auf, damit Sie leicht darauf zugreifen können. Bei Kulturen, die in Suspension gezüchtet werden, werden Schimmelpilze in den Medien als schwebende Kugeln erkannt.

Was die bakterielle Kontamination betrifft, so wird das Medium weiß und trüb. In ähnlicher Weise können bei adhärenten Zellen Schimmelpilzkontaminationen leicht als unscharfe Flecken erkannt werden. Eine bakterielle Kontamination führt dazu, dass normal klare Medien weiß und trüb werden.

Viele Arten von Mykoplasmen können mit einem PCR-basierten Assay zuverlässig identifiziert werden. Die Bande auf der linken Seite zeigt die Molekulargewichtsstandards für DNA. Die vier Bänder auf der rechten Seite sind Positivkontrollen.

Unter den getesteten Zelltypen treten keine Banden auf, da Mykoplasmen nicht nachgewiesen wurden. Zellkulturmedien verfärben sich von rot zu gelb, wenn pH-Indikatoren vorhanden sind. Die gelbe Farbe zeigt an, dass der pH-Wert niedrig ist und das Medium ausgetauscht werden sollte.

Wenn bei der Zellzählung andere Wucherungen oder Zellformen unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden, kann dies ein Indikator für eine Kontamination sein. Beachten Sie, dass vor der Zellzählung eine gründliche Reinigung des Hämozytometers durchgeführt werden sollte, da diese Art von Trümmern möglicherweise nur auf dem Hämozytometer und nicht in der Zellkultur selbst vorhanden ist. Während die Kontamination eines der Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturarbeiten ist, können diese Risiken durch die Befolgung der in diesem Video beschriebenen Praktiken und Techniken gemindert werden.

Wenn jeden Monat ein monatlicher Mykoplasmentest durchgeführt wird, das Laborpersonal jährlich geschult wird und diese Praktiken strikt eingehalten werden, bleiben Ihre Zellen gesund und kontaminationsfrei. Dies wird auch dazu beitragen, die Kosten zu senken, die mit dem Kauf teurer Zellkulturmedien und dem Kauf neuer Zellen verbunden sind, und es wird die Ausfallzeiten der Dekontamination des Inkubators reduzieren. Denken Sie daran, dass der Schlüssel zu einer erfolgreichen Zellkultur ein frühzeitiges Handeln ist, um eine Kontamination von vornherein zu verhindern.