Name: Ein menschliches zerebrales Organoidmodell der neuronalen Zelltransplantation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie ein Protokoll zur Transplantation neuronaler Zellen in humane zerebrale Organoide. Diese Methode ermöglicht die Langzeitverfolgung von Zellengraftment und funktionalen Ergebnissen in vitro.

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Die Mittel für diese Arbeit wurden durch die philanthropischen IRIC-Fonds der Stiftung Marcelle und Jean Coutu und des Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647) bereitgestellt. D.J.H.F.K. erhält Gehaltsunterstützung von FRQS in Form eines Chercheurs-boursiers Junior 1-Stipendiums (#283502). M.I.I.R. wurde durch einen IRIC-Doktorandenpreis des Instituts für Immunologie und Krebsforschung, eine Bourse de passage accélère de la maîtrise au doctorat der Universität Montreal und eine Bourse de Mérite aux cycles supérieurs unterstützt.

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
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<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
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<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
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<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Angesichts des großen Interesses an zelltherapeutischen Ansätzen zur Behandlung von ZNS-Verletzungen/neurodegenerativen Erkrankungen 1,2,3,4,5,6,7,8 gewinnen Modelle der Zellfunktion in einem Transplantationssetting an Bedeutung. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Transplantation von markierten, menschlichen NPCs in menschliche zerebrale Organoide vorgestellt, zusammen mit ihrer Lebendzellverfolgung und Endpunktbewertung durch Histologie und Immunfluoreszenzfärbung. Wichtig ist, dass wir zeigten, dass die transplantierten Zellen in der Lage waren, zu migrieren, zu differenzieren und langfristig (4 Monate) in der Organoid-Umgebung zu persistieren. Eine solche langfristige Persistenz ist ein deutlicher Anstieg gegenüber der Wartbarkeit von Hirnschnittkulturen17. Dieses System ist daher geeignet, um viele der Verhaltensweisen zu untersuchen, die man in einem potenziellen therapeutischen Umfeld beurteilen müsste, wie z. B. Überleben, Proliferation und Differenzierung. Tatsächlich hat eine orthogonale Studie kürzlich gezeigt, dass sich transplantierte NPCs in zerebralen Organoiden ähnlich verhalten wie NPCs, die in NSG-Mausgehirne transplantiert wurden20, was den Nutzen von Organoiden als Transplantatempfänger bestätigt. Da es sich um ein In-vitro-System handelt, ist es auch einfach, Zytokine oder Medikamente von Interesse hinzuzufügen. Dies könnte verwendet werden, um die Auswirkungen bestimmter Umgebungen wie Entzündungen und Immunsuppressiva auf die transplantierten Zellen besser zu verstehen, um weiter nachzuahmen, was ihnen in einem therapeutischen Umfeld begegnen könnte. Das zyklische Immunfluoreszenzprotokoll, das wir demonstriert haben (basierend auf früheren Forschungen21), erweitert die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes weiter, indem es die gleichzeitige Bewertung einer breiten Palette von linien- und potenziell krankheitsspezifischen Markern in einem einzigen Abschnitt ermöglicht und somit eine genaue Verfolgung der transplantierten Zellen und ihrer Auswirkungen auf das Gewebe ermöglicht. Natürlich können stattdessen andere Endpunktbewertungsmethoden verwendet werden, abhängig von den Zielen der Analyse. Zum Beispiel könnte die Gewebereinigung mit 3D-Rekonstruktion verwendet werden, wenn die Zellmorphologie von primärem Interesse ist, oder die Dissoziation gefolgt von Durchflusszytometrie, wenn die Quantifizierung bestimmter Zelltypen das Endziel ist. Wir erwarten, dass diese Methode leicht auf andere Zelltypen wie ZNS-Tumoren erweiterbar ist und möglicherweise deren Untersuchung in einem mikroumweltrelevanten Kontext ermöglicht. In ähnlicher Weise könnten die als Empfänger verwendeten Organoide gegen Krankheitsmodell-Organoide ausgetauscht werden 25,26,27, was möglicherweise die Modellierung von Transplantationsansätzen für diese Erkrankungen ermöglicht.
Wie bei allen Modellen hat auch das hier vorgestellte seine eigenen Einschränkungen. Zum einen sind iPSC-abgeleitete Organoide entwicklungsunreif19 und weisen daher wichtige Unterschiede zum alternden Gehirn auf, in dem sich viele neurodegenerative Erkrankungen manifestieren. Zerebrale Organoide sind auch in der Entwicklung uneinheitlich19, was eine konsistente Injektion in genau dieselbe physiologische Nische ausschließt. Darüber hinaus enthalten sie zwar die Zelltypen der relevanten Hirnregionen18,19, ihnen fehlen jedoch die Endothel-, Mikroglia- und Immunkomponenten, die auch im In-vivo-Setting wichtig sind14. Dies schränkt die Untersuchung ein, wie der Wirt auf die Zelltransplantation reagieren wird. Derzeit werden Techniken zur Hinzufügung von vaskulären28- undMikroglia-29-Zellen sowie zur Erhöhung der Organoidkonsistenz und Regionalisierung18 in Betrieb genommen, wodurch die Modellierungsleistung des Organoid-Transplantationssystems verbessert wird. Sie würden jedoch weitere Tests und Optimierungen erfordern, die über das hier Dargestellte hinausgehen. Obwohl dieses Protokoll kostengünstig ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert, gibt es eine Reihe wichtiger technischer Überlegungen, z. B. die Injektionstiefe. Dies liegt sowohl daran, dass Organoide nicht durchblutet sind und daher oft ein nekrotisches Zentrum haben, wenn sie zu groß werden19 und dass Licht nicht durch den Organoidkern für die Verfolgung lebender Zellen eindringen kann. So können die Zellen, die zu tief injiziert wurden, und Kolonien, die ins Innere gewandert sind, übersehen werden. Dies kann zwar durch die Verwendung von Fluorophoren mit längerer Wellenlänge und besserer Gewebepenetranz30 verbessert werden, aber je nach Organoidgröße und Nachweisgerät wird dies wahrscheinlich eine Überlegung bleiben. Da sich Gehirnorganoide in einem Entwicklungsstadium befinden, ist der Transplantationszeitpunkt eine weitere wichtige Überlegung, da die Umgebung wahrscheinlich je nach Entwicklungsstadium des Organoids, in das es injiziert wird, unterschiedlich ist. Dies kann zwar bis zu einem gewissen Grad kontrolliert werden, indem ein konsistentes Organoid-Alter zum Zeitpunkt der Injektion sichergestellt wird, ist aber zweifellos ein Faktor, der berücksichtigt werden muss.
Dieses Protokoll ist kostengünstig, einfach, tierversuchsfrei und erfordert keine spezielle Ausrüstung, wodurch die Transplantationsmodellierung für eine größere Anzahl von Labors zugänglich wird. Angesichts des rasanten Fortschritts sowohl bei neuralen Zelltherapeutika als auch bei Organoid-Modellsystemen gehen wir davon aus, dass das hier vorgestellte Organoid-Transplantationsprotokoll ein nützliches Modell für eine Reihe von Krankheiten und therapeutischen Ansätzen sein wird.

Das menschliche Gehirn ist ein komplexes Organ, das aus mehreren Zelltypen der neuronalen und glialen Linien besteht. Zusammen bilden diese ein ausgeklügeltes Netzwerk, das Kognition entstehen lässt. Es besteht ein großes Interesse an der Transplantation von Zellen in dieses System zur Behandlung einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, einschließlich traumatischer Hirnverletzungen (TBI)1,2, neurodegenerativer Erkrankungen 3,4,5,6,7 und Schlaganfall8. Eine große Einschränkung bei der Weiterentwicklung solcher Strategien ist jedoch der relative Mangel an verfügbaren präklinischen Modellen, um die erwarteten Transplantationsergebnisse zu bestimmen. Die derzeit am häufigsten verwendeten Modelle sind In-vitro-Kulturmethoden zur Bestimmung des Zellpotenzials und die Xenotransplantation in Mäuse. Während Zellkulturmethoden das Differenzierungs- und Selbsterneuerungspotenzial beurteilen können9, werden diese unter optimalen Wachstumsbedingungen durchgeführt, die nicht die Mikroumgebung nachahmen, der die Zellen in einem Transplantationskontext begegnen würden. Darüber hinaus kann die Art und Weise, wie die Zellen gezüchtet werden, ihr Verhalten beeinflussen10.
Mäusegehirne enthalten alle Zellen der Mikroumgebung und sind daher äußerst leistungsfähige Modellsysteme für die Transplantation11. Es gibt jedoch wichtige Unterschiede zwischen dem Kortex der Maus und dem Menschen 12,13, und nicht alle Wachstumsfaktoren reagieren zwischen den Arten. Primatenmodelle sind eine engere Alternative, die das menschliche System besser nachahmen und auch wichtige präklinische Ergebnisse geliefert haben14. Selbst diese näher verwandten Verwandten behalten jedoch wichtige Unterschiede in ihrer zellulären Zusammensetzungbei 15. Obwohl diese beiden Modellsysteme wertvolle Einblicke in das Zellverhalten während der Transplantation liefern und die chirurgischen Elemente einer eventuellen Therapie einbeziehen, bleiben sie unvollkommen. Sie sind auch kostspielig und technisch anspruchsvoll (d. h. man muss Gehirnoperationen an den Tieren durchführen), wodurch der mögliche Durchsatz begrenzt wird. Darüber hinaus gibt es eine Fülle von ethischen Fragen, die mit der Transplantation menschlicher Gehirnzellen in Tiere verbunden sind16. Gehirnschnittkulturen ermöglichen es, ein Gehirn zu schneiden und für mehrere Behandlungen zu verwenden, wodurch einige der Einschränkungen von Tiertransplantationen beseitigt werden. Diese haben jedoch eine begrenzte Lebensdauer (Wochen), sind immer noch tierischen Ursprungs und haben (da es sich um eine dünne Scheibe handelt) keine ausreichende Volumen-/Oberflächenintegrität, um die Injektion von Zellennachzuahmen 17. Es bleibt also eine wichtige Lücke zwischen reinen Zellkultur-/Potenzialmodellen und In-vivo-Transplantation.
Zerebrale Organoide sind ein In-vitro-Modell, das die wichtigsten im Gehirn vorkommenden neuralen Zelltypen enthält und in großer Zahl aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) erzeugt werden kann18,19. Solche Organoide bieten somit einen zellulären Kontext, der die Beurteilung der Funktionsfähigkeit einer Testzelle von Interesse in der Transplantationsumgebung ermöglichen könnte. In der Tat zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass neurale Vorläuferzellen (NPCs), die in menschliche zerebrale Organoide transplantiert wurden, überleben, sich vermehren und sich ähnlich differenzieren wie NPCs, die in das Gehirn einer starkkombinierten immundefizienten g amma(NSG) Maus transplantiert wurden20. Zerebrale Organoide stellen somit ein tierversuchsfreies, langlebiges (>6 Monate), kostengünstiges System dar, das die Zelltypen des menschlichen Gehirns erfasst. Als solche könnten sie ein idealer Transplantatempfänger für die frühe Prüfung der Regenerationsfähigkeit von Nervenzellen darstellen.
In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Transplantation und anschließende Verfolgung von markierten menschlichen NPCs in menschliche zerebrale Organoide vorgestellt (Abbildung 1). Dies beginnt mit der Injektion von GFP-markierten NPCs in reife (2-4 Monate alte) zerebrale Organoide18. Die transplantierten Zellen werden dann über einen Zeitraum von 4 Monaten von einer Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen verfolgt. Während dieser Zeit zeigen wir sowohl die Persistenz von Zellen an der Injektionsstelle, als auch die Migration in distale Regionen des Organoids. Am Endpunkt demonstrieren wir die Antigengewinnung, Färbung und Bildgebung von histologischen Schnitten, die von diesen Organoiden abgeleitet wurden, einschließlich eines Protokolls für das Quenching bestehender Farbstoffe auf AlexaFluor-Basis, um zusätzliche Färbe- und Bildgebungsrunden zu ermöglichen, basierend auf früheren Arbeiten21. Dieses Protokoll könnte daher bei der Messung der Differenzierungskapazität von Zellen in einer Transplantationsumgebung, der Haltbarkeit des Transplantats, der Zellexpansion in situ und der Zellmigration von der Transplantationsstelle nützlich sein. Wir gehen davon aus, dass dies sowohl für Anwendungen in der regenerativen Medizin/Zelltherapie als auch für die Tumormodellierung durch Transplantation von Tumorzellen in relevante regionsspezifische Organoide nützlich sein wird.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>proteolytisch-kollagennolytischer</td></tr><tr><td>Enzymmix Alexa Fluor 488 anti-GFP Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (Klon SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antikörper (Klon SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (Klon 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Tubulin &Beta 3 (TUBB3) (Klon TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure-Monohydrat</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek-Denaturierter</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ethylalkohol (wasserfrei)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxid (DMSO), steril</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Wachstumsfaktor reduziert (GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Phenolrot-frei, LDEV-frei</td></tr><tr><td>MX35 Mikrotom-Klinge&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochlorid</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; Basisformen aus Edelstahl</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; UNISETTE Kassette für die Verarbeitung/Einbettung von Biopsien</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neuronen-Differenzierungskit für das Vorderhirn</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Progenitor Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi Neural Induction Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Mikrotom</td><td>Thermo Scientific-Tissue</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Prep</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; AI Tissue Processor</td><td>Sakura</td> <td>Finetek-Toluol</td><td></td></tr> <tr><td>(histologisch)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>blau; 0,4% (wt/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

ein menschliches zerebrales organoidmodell der neuronalen zelltransplantation

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

Die Weiterentwicklung von Zelltransplantationsansätzen erfordert Modellsysteme, die eine genaue Beurteilung der funktionellen Potenz transplantierter Zellen ermöglichen. Für das zentrale Nervensystem ist die Xenotransplantation zwar nach wie vor auf dem neuesten Stand der Technik, aber technisch anspruchsvoll, im Durchsatz begrenzt und teuer. Darüber hinaus reagieren die vorhandenen Umweltsignale nicht perfekt mit menschlichen Zellen. In diesem Artikel wird ein kostengünstiges, zugängliches und hochdurchsatzkompatibles Modell für die Transplantation und Verfolgung menschlicher Nervenzellen in menschliche Hirnorganoide vorgestellt. Diese Organoide können mit kommerziellen Kits leicht aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden und enthalten die wichtigsten Zelltypen des Großhirns. 
Wir demonstrieren dieses Transplantationsprotokoll zunächst mit der Injektion von EGFP-markierten humanen iPSC-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in diese Organoide. Als nächstes diskutieren wir Überlegungen zur Verfolgung des Wachstums dieser Zellen im Organoid durch Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie und demonstrieren die Verfolgung von transplantierten EGFP-markierten NPCs in einem Organoid über einen Zeitraum von 4 Monaten. Schließlich stellen wir ein Protokoll für das Schneiden, die zyklische Immunfluoreszenzfärbung und die Bildgebung der transplantierten Zellen in ihrem lokalen Kontext vor. Das hier vorgestellte Organoid-Transplantationsmodell ermöglicht die langfristige (mindestens 4 Monate) Verfolgung transplantierter menschlicher Zellen direkt in einer menschlichen Mikroumgebung mit einem kostengünstigen und einfach durchzuführenden Protokoll. Es stellt daher ein nützliches Modell sowohl für neuronale Zelltherapien (Transplantationen) als auch wahrscheinlich für die mikroumweltgenauere Modellierung von Tumoren des Zentralnervensystems (ZNS) dar.

Zur Validierung der zerebralen Organoididentität wurden histologische Schnitte eines reifen (2 Monate alten) zerebralen Organoids auf PAX6 (ein Marker für dorsale NPCs23) und SATB2 (ein Marker für reife, postmitotische Neuronen der oberen Schicht24) gefärbt. Wie erwartet waren PAX6+ -Zellen im Inneren des Organoids und SATB2+ -Zellen in den oberen Schichten vorhanden (Abbildung 2). Diese Ergebnisse unterstützen die Tatsache, dass es sich bei den verwendeten zerebralen Organoiden tatsächlich um das dorsale Vorderhirn handelte, wie im Differenzierungskit angegeben. Um die Dosisabhängigkeit des zerebralen Organoid-Transplantationssystems zu ermitteln, wurden 2 Monate alte zerebrale Organoide mit einer zunehmenden Anzahl von EGFP+ iPSC-abgeleiteten NPCs injiziert. Es war eine klare Dosisabhängigkeit der GFP-Fluoreszenz von der Anzahl der Eingangszellen vorhanden, mit konsistenter EGFP+ -Zellpatch-Detektion bei 10.000 Zellen und mehr (Abbildung 3). Die Persistenz und Migration der transplantierten NPCs wurde als nächstes bewertet, indem die transplantierten Organoide im Laufe der Zeit verfolgt wurden. Dazu wurden 50.000 iPSC-abgeleitete EGFP+ -NPCs in 2-3 Monate alte zerebrale Organoide transplantiert, die aus derselben iPSC-Linie erzeugt wurden. Die injizierten Organoide und Kontrollen wurden zu bestimmten Zeitpunkten in den nächsten 3-4 Monaten auf EGFP-Positivität untersucht. In dieser Transplantationsserie beobachteten wir die Persistenz der injizierten Stelle während des gesamten 4-monatigen Tracking-Zeitraums (Abbildung 4A). Zusätzliche EGFP+ -Zellpflaster erschienen 9 Tage nach der Transplantation und blieben bis zum Endpunkt der Studie (3-4 Monate je nach Organoid) bestehen, was auf die Migration der Zellen und die Integration an ihren neuen Stellen hinweist (Abbildung 4A). Bei einer höheren Vergrößerung war eine klare neuronale Morphologie mit langen Projektionen in das Organoid zu beobachten (Abbildung 4B), was die Integration der injizierten Zellen bestätigte.
Um den Differenzierungsstatus der injizierten Zellen spät nach der Injektion zu bestimmen, wurden das 4 Monate lang verfolgte Organoid und seine Kontrolle fixiert, paraffineingebettet, in 15 μm dicke Scheiben geschnitten und auf Objektträger montiert. Die Schichten wurden dann entweder in einer einzigen Runde der Fluoreszenzfärbung (EGFP, TUJ1, NESTIN) oder für zwei aufeinanderfolgende Färbezyklen verarbeitet und gefärbt, um zusätzliche Marker hinzuzufügen (MAP2, GFAP). Die anfängliche Einrundenfärbung bestätigte das Vorhandensein von EGFP+-Zellen an der Injektionsstelle, einschließlich einer Mischung aus Zellen mit NPC-Status (NESTIN+TUJ1−) und solchen, die sich in Richtung eines neuronalen Schicksals (NESTIN−TUJ1+) differenziert hatten (Abbildung 5). Sowohl für die Kontroll- als auch für die injizierten Organoide wurden nur sehr wenige NESTIN+-NPCs beobachtet (die meisten, wenn auch nicht alle waren EGFP+-transplantierte NPCs an der Injektionsstelle), wobei die Mehrheit der unreif-reifen TUJ1+-Neuronen bestand (Abbildung 5). Die Zwei-Runden-Färbung ergab mehr Details und enthüllte reife Neuronen (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) um den größten Teil der äußeren Region des Organoids, mit Bereichen unreifer (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) Neuronen in der Mitte (Abbildung 6A,B). Astrozyten (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) waren sowohl in den injizierten als auch in den Kontrollorganoiden vorhanden und waren an den äußeren Rändern eingestreut (Abbildung 6A,B). Der Schnitt, für den die Zwei-Runden-Färbung im injizierten Organoid durchgeführt wurde, zeigte eine kleine Satellitenkolonie von EGFP+-Zellen weit von der Injektionsstelle entfernt, die den Phänotyp reifer Neuronen angenommen hatte (Abbildung 6B, C). Einige von ihnen schienen sich in unmittelbarer Nähe von Astrozyten zu befinden; es gab jedoch keine EGFP+-Zellen mit vollständiger Überlappung zur GFAP-Färbung, was darauf hindeutet, dass sie benachbart waren, anstatt die Astrozyten selbst zu erzeugen (Abbildung 6B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> Abbildung 1: Transplantationsmodell von markierten Zellen in zerebrale Organoide. Schematische Übersicht über die Erzeugung markierter Zellen durch lentivirale Transduktion, ihre Transplantation in zerebrale Organoide und die Verfolgung durch Lebendzellbildgebung und Immunfluoreszenz. Abkürzung: GFP = grün fluoreszierendes Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> Abbildung 2: Immunfluoreszenz histologischer Schnitte, die die Architektur früher und später Organoide zeigen. Ein 2 Monate altes zerebrales Organoid wurde fixiert, paraffineingebettet, geschnitten und mit PAX6, SATB2 und DAPI gefärbt. Ein ungefärbter Schnitt wurde verwendet, um die Belichtungs- und Integrationszeit einzustellen, um ein falsch-positives Signal durch Autofluoreszenz zu vermeiden. PAX6+-Zellen waren im Inneren des Organoids vorhanden, während SATB2+-Zellen in den oberen Schichten vorhanden waren. Z-Stapel-Bilder wurden alle 4,2 μm über den gesamten 15-μm-Gewebeschnitt aufgenommen. Optische Abschnitte wurden mit der Focus-Stacking-Option in der Gen5-Software mit Standardoptionen kombiniert. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: PAX6 = gepaartes Box-6-Protein; SATB2 = spezielles AT-reiches sequenzbindendes Protein 2; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Dosisabhängige Transplantation von NPCs in zerebrale Organoide. Die Organoide wurden mit 0 (Negativkontrolle), 1.000, 5.000, 10.000 oder 50.000 GFP+ iPSC-abgeleiteten NPCs transplantiert. 1 Woche nach der Transplantation wurden die Organoide auf einer Cytation 5 mit einem GFP-Filterwürfel abgebildet. Die Negativkontrolle wurde verwendet, um die Belichtungs- und Integrationszeit einzustellen, um die Autofluoreszenz zu minimieren. Dunklere Farben weisen auf eine höhere EGFP-Fluoreszenz im Vergleich zur Negativkontrolle hin. Maßstabsleisten = 100 μm. Dies sind 4x-Bilder der gesamten Organoide. Nach der Bildgebung wurde vor der Anzeige eine Rolling-Ball-Hintergrundsubtraktion mit einem Pixelradius von 50 durchgeführt, um die variable Hintergrundintensität über die Organoide hinweg zu korrigieren. Injektionsstellen, die als Regionen mit der höchsten Transplantation identifiziert wurden, sind mit einem roten Pfeil gekennzeichnet, wo eine Transplantation vorhanden war. Abkürzungen: NPCs = neuronale Vorläuferzellen; GFP = grün fluoreszierendes Protein; EGFP = erweitertes GFP; iPSC = induzierte pluripotente Stammzelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Verfolgung des Wachstums, der Migration und der Persistenz transplantierter Zellen mit Fluoreszenz-Lebendzell-Bildgebung. (A) Kontroll- und transplantierte (50.000 GFP+ iPSC-abgeleitete NPCs) Organoide wurden über einen Zeitraum von 2-4 Monaten von zwei unabhängigen Transplantationssets mit Fluoreszenz-Lebendzell-Bildgebung verfolgt. Negativkontrollorganoide wurden verwendet, um die Belichtungs- und Integrationszeit einzustellen, um die Autofluoreszenz zu jedem Zeitpunkt zu minimieren. EGFP-Bilder wurden mit einem GFP-Filterwürfel auf der Cytation 5 zu angegebenen Zeitpunkten nach der Transplantation aufgenommen. Dunklere Farben zeigen eine höhere EGFP-Fluoreszenz im Vergleich zur Negativkontrolle für diesen Zeitpunkt an. Vor der Anzeige wurde eine Rolling-Ball-Hintergrundsubtraktion mit einem Pixelradius von 50 durchgeführt, um die variable Hintergrundintensität über die Organoide hinweg zu korrigieren. Die Organoide wurden zu jedem Zeitpunkt in ungefähr der gleichen Ausrichtung platziert, und die Bilder wurden gedreht, um die Konsistenz der Anzeige zu gewährleisten und das transplantierte Zellwachstum deutlich zu zeigen. Die Injektionsstellen, die zum frühesten Zeitpunkt als Regionen mit der höchsten Transplantation identifiziert wurden, sind mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. Ein Beispiel für ein Organoid mit negativer Kontrolle ist unten in der Abbildung dargestellt. (B) Beispiel: 20x-Bilder von transplantierten Organoiden in Woche 1 und Woche 15 nach der Transplantation. Der lokale Kontrast wurde vor der Anzeige mit FIJI verbessert, um die Sichtbarkeit der Neuriten zu gewährleisten. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: NPCs = neuronale Vorläuferzellen; GFP = grün fluoreszierendes Protein; EGFP = erweitertes GFP; iPSC = induzierte pluripotente Stammzelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> Abbildung 5: Immunfluoreszenz der histologischen Schnitte, die die Persistenz der transplantierten NPCs an der Injektionsstelle zusammen mit Migration und neuronaler Differenzierung zeigt. Einkanal-Fluoreszenzbilder von (A) nicht injizierten und (B) transplantierten Organoiden. Das überlagerte Bild rechts zeigt die drei interessierenden Kanäle (NESTIN, TUJ1 und EGFP), enthält jedoch nicht DAPI. Die Anzeigeminimums wurden so eingestellt, dass nur das Signal von den negativen Zellen ausgeschlossen wird (bestimmt für EGFP aus der nicht injizierten Steuerung und für andere Kanäle basierend auf bekannten Markerkombinationen). Die Anzeigemaxima basierten auf dem höchsten Signal, das für diesen Antikörper in einer Zelle beobachtet wurde. Die Anzeigebereiche wurden zwischen den nicht injizierten und transplantierten Organoiden konstant gehalten, um einen direkten Vergleich zu ermöglichen. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: NPCs = neuronale Vorläuferzellen; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; TUJ1 = Beta-III-Tubulin; EGFP = verstärktes grün fluoreszierendes Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Beurteilung des Differenzierungszustands und der Lokalisation der transplantierten Zellen mittels zyklischer Immunfluoreszenz der histologischen Schnitte. Einkanal-Fluoreszenzbilder von den nicht injizierten, (A) altersangepassten und (B) transplantierten Organoiden werden für die erste und zweite Färberunde wie angegeben gezeigt. Die Anzeigeminimums wurden so eingestellt, dass nur das Signal von den negativen Zellen ausgeschlossen wird (bestimmt für EGFP aus der nicht injizierten Steuerung und für andere Kanäle basierend auf bekannten Markerkombinationen). Die Anzeigemaxima basierten auf dem höchsten Signal, das für diesen Antikörper in einer Zelle beobachtet wurde. Die Anzeigebereiche (und natürlich die Bildgebungsparameter) wurden zwischen dem Kontroll- und dem injizierten Organoid konstant gehalten, um einen direkten Vergleich zu ermöglichen. Maßstabsleisten = 100 μm. Ein überlagertes Bild (ohne DAPI) wird für jede Färberunde für jedes Organoid auf der rechten Seite angezeigt. (B) Für das injizierte Organoid, bei dem die Bildregistrierung durchgeführt wurde, werden alle Bilder auf den in beiden Färberunden beobachteten Bereich zugeschnitten. (B,C) Für das injizierte Organoid sind die EGFP+-Zellregionen blau umrandet. Ein Diagramm zur Verwendung von DAPI zum Abgleich der Features während der Bildregistrierung ist in (C) dargestellt, gefolgt von einer Gesamtzusammenführung des registrierten Bildes. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindole; TUJ1 = Beta-III-Tubulin; EGFP = verstärktes grün fluoreszierendes Protein; MAP2 = Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2; GFAP = saures Gliafibrillenprotein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Klonen</td>
			<td>Fluorophor</td>
			<td>Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Anti-NESTIN</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 zu 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 zu 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 zu 200</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 zu 500</td>
		</tr><tr><td>Anti-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 zu 1.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-PAX6</td>
			<td>Nr. O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 zu 100</td>
		</tr><tr><td>Anti-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 zu 500</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Antikörperkonzentrationen für die Färbung. Abkürzungen: TUBB3 = Beta-Tubulin III; GFP = grün fluoreszierendes Protein; GFAP = saures Gliafaserprotein; MAP2 = Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2; PAX6 = gepaartes Box-6-Protein; SATB2 = spezielles AT-reiches sequenzbindendes Protein 2.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Transplantation und Verfolgung markierter Nervenzellen in menschliche Hirnorganoide.

Ein menschliches zerebrales Organoidmodell der neuronalen Zelltransplantation

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Mit dem wachsenden Interesse an Zelltherapien werden neue Methoden zur Bewertung der Funktionalität dieser Zellen benötigt. Dieses Protokoll ermöglicht eine In-vitro-Langzeitbewertung dieser Zelltransplantation in einem neuronalen Kontext. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle Komponenten menschlichen Ursprungs sind.Außerdem kann die Transplantation leicht verfolgt werden, und die Umgebung des Organoids kann leicht verändert werden, was das Testen verschiedener Medikamente oder Behandlungen ermöglicht. Diese Technik wird von Iliana Ibanez, einer talentierten Doktorandin in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, die Einzelzellsuspension von induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSC-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus dem Eis zu entfernen und sie fünf Minuten lang bei 300 g bei 4 Grad Celsius zu zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 Milligramm pro Milliliter gelöster Basalmembranmatrix, um ein Endvolumen von zwei Mikrolitern pro Injektion zu erhalten. Legen Sie die Suspension sofort wieder auf das Eis, bis sie verwendet wird. Übertragen Sie die vorgekühlte Spritze aus dem 20-Grad-Gefrierschrank zur weiteren Verwendung in einen Eiskübel.Nehmen Sie als Nächstes die Gehirnorganoidplatte aus dem Inkubator und geben Sie das Organoid mit einer breiten Spitze in eine 35-Millimeter-Schale. Um die Organoide zu stabilisieren und die Injektion zu erleichtern, entfernen Sie das Medium so weit wie möglich, ohne das Organoid zu beschädigen. Legen Sie die 35-Millimeter-Schale mit dem Organoid unter ein Präpariermikroskop, um die Injektion zu erleichtern.Sobald die Organoide zur Injektion bereit sind, resuspendieren Sie die EGFP-markierten NPC-Zellen vorsichtig mit einer gekühlten P20-Pipettenspitze und bewegen Sie zwei Mikroliter dieser Zellen auf einen vorgekühlten sterilen Glasobjektträger. Nehmen Sie eine vorgefüllte Insulinspritze aus dem Eis und ziehen Sie die 2 Mikroliter Zellsuspension langsam mit der Fase der Nadel nach unten nach oben. Öffnen Sie den Deckel der Schale, die das Organoid enthält, bevor Sie das Mikroskop darauf richten.Halten Sie die Schüssel mit einer Hand fest, legen Sie die Fase der Nadel nach oben. Und mit der anderen Hand injizieren Sie die Zelle langsam in die Organoidoberfläche. Setzen Sie nach der Injektion der Zellen den Deckel wieder in die Schale und inkubieren Sie das injizierte Organoid ein bis zwei Minuten lang.Geben Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter des Organoidmediums in die Platte, bevor Sie das Organoid in eine 24-Well-Platte mit einer breiten Bohrungsspitze überführen. Inkubieren Sie das Organoid bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit einem vollständigen Mediumwechsel jeden zweiten Tag. Laden Sie ein nicht injiziertes Organoid oder ein Organoid mit Negativkontrolle in ein Fluoreszenzmikroskop.Stellen Sie die Beleuchtungsintensität zwischen 1 und 2 und die Belichtungszeit zwischen 80 und 100 Millisekunden ein, um eine minimale Autofluoreszenz zu gewährleisten. Laden Sie als Nächstes das Positivkontrollorganoid und erhöhen Sie die Belichtungszeit, um sicherzustellen, dass markierte Zellen sichtbar sind. Positionieren Sie das Organoid mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang neu, um das verbesserte grün fluoreszierende Protein oder die EGFP plus-Region für die Injektion zu finden.Entfernen Sie das Medium vollständig aus dem Organoid, bevor Sie das Organoid laden. Und stellen Sie es mit den ausgewählten Einstellungen dar. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, fügen Sie sofort ein frisches Medium hinzu, um ein Austrocknen des Organoids zu verhindern.Nachdem Sie die Mediumentfernung und Bildgebung für alle Organoide wiederholt haben, bringen Sie die Organoide wieder in den normalen Inkubations- und Mediumwechsel. Wiederholen Sie die Bildgebung in den gewünschten Intervallen. Legen Sie den Objektträger für zwei Minuten in ein mit Toluol gefülltes Coplin-Objektträger-Färbeglas und wiederholen Sie diesen Schritt.Übertragen Sie dann den Objektträger für zwei Minuten in ein mit 100 % Ethylalkohol gefülltes Coplin-Objektträger-Färbeglas. Wiederholen Sie diesen Schritt, bevor Sie den Objektträger für zwei Minuten in ein mit Wasser gefülltes Coplin-Glas geben. Wiederholen Sie die Wäsche mit Wasser.Stellen Sie dann einen Plastikbehälter in das Wasserbad und stellen Sie sicher, dass der Kunststoff den Boden des Bades nicht berührt. Gießen Sie den Citratpuffer in den Plastikbehälter und lassen Sie ihn 95 bis 100 Grad Celsius erreichen. Sobald der Puffer die gewünschte Temperatur erreicht hat, legen Sie die Objektträger in den Puffer und decken Sie den Behälter locker mit einem Deckel ab, wobei Sie die Objektträger 30 bis 40 Minuten im Wasserbad belassen.Nach der Inkubation den Plastikbehälter aus dem Wasserbad nehmen und 20 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils zwei Minuten mit PBS. Entfernen Sie das PBS mit einem Papiertuch, ohne die Probe zu berühren.Bereiten Sie den Permeabilisierungspuffer vor und füllen Sie damit ein Glasobjektträger-Färbeglas. Tauchen Sie die Objektträger in den Permeabilisierungspuffer und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang. Wiederholen Sie drei Wäschen PBS für jeweils zwei Minuten.Bereiten Sie dann eine Färbemischung vor, um jede Probe abzudecken, und geben Sie 25 Mikroliter in den Organoid-Objektträger, bevor Sie den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie nach der Inkubation drei Wäschen von PBS für jeweils zwei Minuten und entfernen Sie die Salze, indem Sie den Objektträger mit destilliertem Wasser in einem Glasobjektträger-Färbeglas abspülen. Als nächstes fügen Sie jeder Probe 10 Mikroliter Flüssigkeitshalterungen und DAPI hinzu, bevor Sie den Objektträger mit dem Fluoreszenzmikroskop abbilden.In das Glas-Coplin-Färbeglas, das zur Hälfte mit 2-fachem Quenching-Puffer gefüllt ist, fügen Sie 45 Milliliter PBS hinzu und legen Sie die Objektträger in dieses Glas. Inkubieren Sie das Glas über Nacht bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um zu überprüfen, ob die Fluorophore effektiv abgeschreckt wurden, bevor Sie die Färbung und Bildgebung wiederholen.Es zeigte sich eine klare Dosisabhängigkeit der GFP-Fluoreszenz von der Anzahl der Eingangszellen, mit konsistenter EGFP plus Zellpatch-Detektion bei 10.000 Zellen und mehr. Die injizierten Organoide und Kontrollen, die auf EGFP-Positivität abgebildet wurden, zeigten die Persistenz der injizierten Stelle während des viermonatigen Tracking-Zeitraums. Weitere EGFP-positive Zellpflaster traten neun Tage nach der Transplantation auf und blieben bis zum Endpunkt der Studie bestehen, was auf die Migration der Zellen und die Integration an ihren neuen Stellen hinweist.Bei einer höheren Vergrößerung war eine klare neuronale Morphologie mit langen Projektionen in das Organoid zu beobachten, was die Integration der injizierten Zellen bestätigte. Die anfängliche Einzelrundenfärbung bestätigte das Vorhandensein von EGFP plus-Zellen an der Injektionsstelle, einschließlich einer Mischung aus Zellen, die den NPC-Status behielten, und solchen, die sich in Richtung eines neuronalen Schicksals differenziert hatten. Für die Kontroll- und injizierten Organoide wurden nur sehr wenige Nestin plus NPCs beobachtet, mit einer Mehrheit von TUJ1 plus unreifen reifen Neuronen.Die zweirunde Färbung ergab mehr Details und enthüllte reife Neuronen um den größten Teil der äußeren Region des Organoids, mit Bereichen unreifer Neuronen in der Mitte. Astrozyten waren in den injizierten und Kontrollorganoiden vorhanden und an den äußeren Rändern eingestreut. Der Schnitt, für den die Zwei-Rund-Färbung im injizierten Organoid durchgeführt wurde, zeigte eine kleine Satellitenkolonie von EGFP-Plus-Zellen weit entfernt von der Injektionsstelle, die den Phänotyp reifer Neuronen angenommen hatte.Einige dieser Kolonien scheinen sich in der Nähe von Astrozyten zu befinden. Allerdings deuteten keine EGFP-plus-Zellen mit vollständiger Überlappung zur GFP-Färbung darauf hin, dass sie benachbart waren, anstatt die Astrozyten selbst zu erzeugen. Wenn Sie das Organoid injizieren, müssen Sie vermeiden, zu viel Kraft auszuüben oder es zu schnell zu tun, da Sie das Organoid vollständig zerstören können.So können die Organoide nach der Lebensverfolgung assoziiert und für Durchflusszytometrie-Analysen oder Einzelzellsequenzierungsansätze verwendet werden. Dies wird es uns ermöglichen, den molekularen Zustand der Zellen zu kennen. Diese Technik könnte äußerst nützlich sein, um die Zelltherapie für neurodegenerative Erkrankungen voranzutreiben, auch für die Modellierung von Hirntumoren oder Metastasen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Transplantation von aus Stammzellen gewonnenen neuronalen Vorläuferzellen in humane kortikale Schnitte

Quelle: Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt die Injektion von fluoreszenzmarkierten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in menschliche zerebrale Organoide unter Verwendung eines Zell-Matrix-Gemisches. Die Methode ist reproduzierbar und tierversuchsfrei und ermöglicht eine Transplantation mit minimalem Organoid-Bruch. Es bietet eine wertvolle Plattform für die Modellierung von neuronalen Transplantationen...

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Dieses Protokoll beschreibt langfristige organotypische Kulturen des adulten menschlichen Kortex in Kombination mit der intrakortikalen Ex-vivo-Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen, die eine neuartige Methodik zur weiteren Erprobung stammzellbasierter Therapien für neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen darstellen.

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