Nachweis und Quantifizierung von Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in humanem Plasma mit Hilfe eines modifizierten Enzyme-linked Immunosorbent Assays

Dieses modifizierte ELISA-Protokoll ermöglicht die Aufreinigung und genaue Quantifizierung von CGRP in humanem Plasma. Es wurde den notwendigen Validierungsexperimenten unterzogen und kann zur Standardisierung zukünftiger Quantifizierungsmethoden dienen. Dieses Protokoll bietet den Vorteil, dass die Probenverarbeitung vor einem signifikanten Proteaseabbau, die Aufreinigung durch Festphasenextraktion und die Begrenzung der unspezifischen Bindung durch Aufbringen von Blockierungspuffer auf die Mikrotiterplatten eingeschlossen werden.

CGRP spielt eine strafende Rolle in der Pathophysiologie der Migräne und könnte ein Kandidat für den Biomarker-Status sein. Es wurde auch mit kardiologischen, dermatologischen, viralen und sogar COVID-19-bedingten Krankheitsprozessen in Verbindung gebracht. Sammeln Sie zunächst 5 Milliliter Vollblut aus der Vena antecubitalis durch Standard-Venenpunktionsmethoden in ein 6-Milliliter-Vacutainer-EDTA-Röhrchen.

Um die Lyse des Zielpeptids zu blockieren, fügen Sie 0,5 Milliliter Aprotinin-kompetitiven Serinprotease-Inhibitor hinzu. Drehen Sie das Röhrchen 10 Mal um und lagern Sie es bis zum nächsten Schritt auf Eis. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600 4g für vier Minuten bei 4 Grad Celsius.

Übertragen Sie die Plasmafraktion in ein steriles Kryofläschchen mit rundem Boden von 2 Millilitern. Lagern Sie das Kryo-Fläschchen sofort bei minus 80 Grad Celsius für bis zu zwei Wochen. Um die Plasmaprobe zu extrahieren, legen Sie eine Extraktionskartusche in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Millilitern.

Geben Sie 5 Milliliter 100%iges Methanol und dann 10 Milliliter Reinstwasser durch die Kartusche, um sie zu aktivieren. Die Flüssigkeit wird im Schlauch gesammelt, während sie durch die Schwerkraft durch die Kartusche fließt. Entsorgen Sie angesammelte überschüssige Flüssigkeit, um zu verhindern, dass sie die Kartusche verschlingt, und stellen Sie sicher, dass sie während des Experiments nicht austrocknet.

Verdünnen Sie 250 Mikroliter Plasma in 750 Mikrolitern 4%iger Essigsäure und passieren Sie es langsam durch die Kartusche. Waschen Sie dann die Kartusche mit 10 Milliliter Essigsäure. Sobald die überschüssige Flüssigkeit entfernt ist, setzen Sie die Kartusche in ein neues konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Millilitern um.

Bereiten Sie 3 Milliliter Methanolessigsäurelösung vor, um das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid oder CGRP zu eluieren. Führen Sie 1 Milliliter davon durch die Kartusche und warten Sie zwischen jeder Elution 25 Minuten. Nach der letzten Elution enthält das Röhrchen 3 Milliliter Gesamteluant.

Übertragen Sie 1 Milliliter des Eluators in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie es eine Sekunde lang in einer Minizentrifuge, um das Eluationsmittel abzusetzen. Anschließend trocknen Sie die Probe in einer Vakuumzentrifuge bei 1.400 U/min und 4 Grad Celsius. Unmittelbar vor dem Assay wird die getrocknete Probe mit einem aufgetauten Enzymimmunoassay oder EIA-Puffer rekonstituiert.

Zum Verstopfen der Platte geben Sie 250 Mikroliter TBS-Fischgelatine-Blockierpuffer in jede Vertiefung. Legen Sie ein Deckblatt über die Platte und inkubieren Sie es zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Inkubation das Deckblatt und entleeren Sie die Platte, indem Sie sie umdrehen.

Tupfen Sie dann die Platte auf ein Papiertuch, um Spuren von Flüssigkeit zu entfernen, und trocknen Sie sie 10 Minuten lang in einer Laminar-Flow-Haube. Sobald die Platte sichtbar trocken ist, legen Sie sie in einen griffversiegelten Folienbeutel mit einem Kieselgel-Trockenmittelbeutel. Lagern Sie es 24 Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius.

Tauen Sie vor der Durchführung des Assays alle Proben und vorbereiteten Reagenzien bei Raumtemperatur auf. Um die Vertiefungen der Blockplatte zu spülen, fügen Sie 300 Mikroliter Waschpuffer hinzu und lassen Sie ihn 30 Sekunden ruhen. Entsorgen Sie dann den Waschpuffer und wiederholen Sie das Spülen fünfmal.

Tupfen Sie die Platte nach dem letzten Spülen wie zuvor gezeigt ab. Als Nächstes geben Sie 100 Mikroliter EIA-Puffer an die beiden dedizierten unspezifischen Bindungs- oder NSB-Vertiefungen ab. Fügen Sie 100 Mikroliter der CGRP-Standards hinzu, gefolgt von der rekonstituierten Probe und der Qualitätskontrolle in zweifacher Ausführung in geeignete Vertiefungen.

Geben Sie 100 Mikroliter CGRP-Tracer in jede Vertiefung, mit Ausnahme der leeren Vertiefungen. Zum Schluss versiegeln Sie die Platte mit einer transparenten Deckfolie, um sicherzustellen, dass die Proben und Reagenzien nicht verdunsten, und inkubieren Sie die Platte 16 bis 20 Stunden lang bei 4 Grad Celsius. Wenn die Inkubationszeit abgelaufen ist, bereiten Sie das Ellman-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.

Sobald der Teller dekantiert ist, waschen Sie jede Vertiefung dreimal, wie zuvor gezeigt. Schütteln Sie die Platte nach dem letzten Spülgang zwei Minuten lang bei 120 U/min. Spülen Sie den Teller erneut dreimal aus und tupfen Sie ihn trocken.

Klopfen Sie auf die umgedrehte Platte, bis die Flüssigkeit sichtbar aus den Vertiefungen entfernt ist. Geben Sie dann 200 Mikroliter des Ellman-Reagenzes in jede Vertiefung mit Ausnahme von leeren Vertiefungen. Sobald die Platte abgedeckt ist, wickeln Sie sie in Alufolie ein, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und inkubieren Sie sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, bevor Sie die Absorption aufzeichnen.

Die vorliegende Studie zeigte, dass die Wiederfindungsraten in jeder CGRP-Spike-Probe durch die Hinzufügung des Blockierungsschritts innerhalb des akzeptablen Bereichs lagen. Wenn jedoch der Blockierungsschritt ausgeschlossen wurde, führte die unspezifische Bindung zu Wiederfindungsraten, die die Obergrenze von 125 % überstiegen. Es ist wichtig, Aprotinin hinzuzufügen, um Blutproben kurz nach der Entnahme zu halten, um den CGRP-Abbau zu begrenzen. Zusätzlich sollte der Blockierungspuffer vor dem ELISA in die Mikrotiterplatte gegeben werden, um die unspezifische Bindung weiter zu reduzieren.

Daher kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Kandidatur von CGRP als Biomarker für vestibuläre Migräne zu untersuchen, indem die CGRP-Spiegel bei Plasmapatienten mit Migräne und vestibulärer Migräne im Vergleich zu Kontrollen quantifiziert werden.