Agrobacterium tumefaciens-vermittelte genetische Transformation des Spitzwegerichs

Plantago-Arten können als Modellpflanzen für die Gefäßbiologie und Stressphysiologie von Pflanzen verwendet werden. Die Etablierung eines Transformationsprotokolls ermöglicht eingehende Studien an diesen Pflanzen, um die Beziehungen zwischen Genen und dem damit verbundenen Phänotyp zu erforschen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Lebensmittel als Explantaten verwendet werden, um schmalblättrige Wegeriche mit hoher Effizienz umzuwandeln.

Geben Sie zunächst handelsübliche Wildtyp-Samen von Plantago lanceolata in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bis zur 5-Milliliter-Marke, je nach Anzahl der gewünschten Pflanzen. Tauchen Sie die Samen 60 Sekunden lang in 75%iges Ethanol. Nachdem Sie das Ethanol verworfen haben, tauchen Sie die Samen 40 Minuten lang in frisch zubereiteten 20%igen Natriumhypochlorit, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen.

Entsorgen Sie die Natriumhypochloritlösung unter einer Laminat-Fließhaube und waschen Sie die Samen fünfmal mit destilliertem Wasser. Gib nach dem letzten Spülen eine kleine Menge Wasser zu den Samen, da dies die Bewegung der Pflanzen auf Tellern unterstützen kann. Übertragen Sie die Samen mit einer sterilen Pinzette auf eine vorbereitete Petrischale mit festem MS-Medium, indem Sie die Samen gleichmäßig auf der Oberfläche des Tellers verteilen, etwa 1 Zentimeter zwischen den einzelnen Samen, um eine Überfüllung der keimenden Sämlinge zu verhindern.

Versiegeln Sie die Platte mit zwei Schichten Paraffinfolie, um eine Kontamination zu vermeiden, und inkubieren Sie sie unter einem kühlweißen Wachstumslicht bei Raumtemperatur. Sobald die Sämlinge gekeimt sind und groß genug sind, um sie zu übertragen, typischerweise nach zwei oder drei Tagen der Keimung, verwenden Sie eine sterile Pinzette und setzen Sie die Sämlinge in sterile Boxen mit 50 bis 100 Millilitern MS Medium um. Verschließe die Schachteln mit chirurgischem Klebeband und lasse die Pflanzen etwa drei bis vier Wochen lang unter dem kühlweißen Wachstumslicht wachsen.

Streak Agrobacterium tumefaciens mit dem gewünschten Plasmid auf eine präparierte feste LB-Platte mit dem entsprechenden Selektionsmittel. Inkubieren Sie die paraffinversiegelte Platte bei 28 Grad Celsius bis zu 48 Stunden lang oder bis die Bakterien groß genug sind, um sie zu pflücken. Picken Sie nach der Inkubation zwei Tage vor der Transformation eine Bakterienkolonie mit einer Pipettenspitze und beimpfen Sie sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, das sechs Milliliter flüssiges LB enthält, mit dem entsprechenden Selektionsmittel.

Bei 200 U/min in einem Tischschüttler bei 28 Grad Celsius über Nacht schütteln, bis der OD 600 0,6 bis 0,7 erreicht. Sobald die Bakterien den erforderlichen OD erreicht haben, werden 200 Mikroliter der Bakterienkultur in einen sterilen Kolben mit 100 Millilitern LB mit dem Selektionsmittel überführt. Bei 200 U/min bei 28 Grad Celsius über Nacht schütteln.

Übertragen Sie dann die Bakterienkultur in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.200 G, um die Bakterien zu sammeln. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in fünf Millilitern frisch zubereiteter Suspensionslösung oder SS bei Raumtemperatur durch Pipettieren. Dann mehr SS bis zur 50-Milliliter-Marke hinzufügen und mehrmals umdrehen, um zu mischen.

Sobald die Pflanzen in etwa drei Wochen das ideale Stadium für die Transformation erreicht haben, verwenden Sie eine sterile Pinzette und eine Schere, um die Wurzeln von der Pflanze zu trennen und das Blatt- und Stängelmaterial zu entsorgen. Übertragen Sie die Wurzelstücke unmittelbar nach dem Schneiden aseptisch mit einer Pinzette in Kartons mit sterilem Wasser, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen. Als nächstes gießen Sie die SS-suspendierte Agrobacterium tumefaciens-Bakterienkultur in sterile 150 x 15 Millimeter große Einweg-Petrischale.

Übertragen Sie die geschnittenen Wurzeln in die Bakterienkultur und inkubieren Sie sie mindestens 20 Minuten lang. Verwenden Sie während der Inkubation ein steriles Skalpell mit einer scharfen Klinge, um die Wurzeln in ein Zentimeter große Fragmente zu schneiden, um die Primärwurzeln von den Seitenwurzeln zu trennen. Machen Sie dann dünne, flache Schnitte auf der Oberfläche der Wurzeln, damit die Bakterien die Pflanze infizieren können.

Übertragen Sie die Wurzelstücke nach der Inkubation auf sterile Papiertücher, um überschüssige Bakterien zu entfernen. Anschließend werden die getrockneten Wurzeln in die vorbereiteten Petrischalen mit festen Co-Kultivierungsmedien überführt, je nach Größe der Wurzeln etwa 10 bis 20 Wurzeln pro Platte. Versiegeln Sie die Platten mit zwei Schichten transparenter Plastikfolie und dann mit Aluminiumfolie, um sie drei Tage lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Nach drei Tagen Inkubation. In den Co-Kulturmedien werden die Wurzelstücke in vorbereitete Petrischalen mit festem Spross-Induktionsmedium oder SIM mit 500 Milligramm pro Liter Temetin und entsprechender Antibiotikaauswahl überführt. Inkubieren Sie die mit transparenter Plastikfolie versiegelten Platten einen Monat lang unter einem Wachstumslicht oder bis die Triebe zu erscheinen beginnen.

Einmal werden die Pflänzchen 1,5 bis 2,0 Zentimeter lang. Übertragen Sie sie in vorbereitete sterile Boxen. Mit Festwurzel-Induktionsmedien.

Züchten Sie die Pflanzen mehrere Wochen lang unter einer Wachstumslampe, bis sich Wurzeln bilden. In der Regel nach einer Woche, wenn das Wurzelsystem groß genug ist, um sich zu übertragen, nehmen Sie die Pflanze und waschen Sie die Wurzeln vorsichtig mit Wasser, um jegliches Medium zu entfernen, das an den Wurzeln haftet. Setzen Sie dann die Pflanzen in quadratische 3,5-Zoll-Töpfe um, die vorbenetzte Allzweckerde BM seven enthalten, und decken Sie die Pflanzen mit einer Kunststoff-Topfabdeckung und dann mit einer durchsichtigen Plastiktüte ab, um sicherzustellen, dass die Pflanzen in einer feuchten Umgebung bleiben.

Diese Methode wurde am Wurzelblatt und an kleinlichem altem Gewebe getestet. Im Vorexperiment konnte zwar in allen Gewebetypen Schwieligkeit induziert werden, aber nur das Wurzelgewebe produzierte nach einem Monat in SIM Sprossinitialen, das Blatt und das Pedal verfärbten sich braun und starben ab. Das Fortschreiten der Sprossinitialen, die aus transformiertem Gewebe hervorgingen, wurde vom ersten Tag an beobachtet.

Die Wurzeln wurden auf die SIM gelegt, bis die Triebe bereit waren, bewurzelt zu werden. Nach einer Woche bildete sich im Wurzelgewebe eine Schwiel, in der zu Beginn der Triebinitialen beobachtet werden konnte. In den Wochen zwei und drei tauchten die Triebe weiter auf, und nach vier Wochen waren die Triebe bereit, in das Wurzelinduktionsmedium übertragen zu werden.

Die Identifizierung der transgenen Pflanzen erfolgte mittels Beta-Glucuronidase-GUS-Histochemie unter Verwendung der Blattsegmente, die entnommen wurden, sobald die Triebe etwa 0,5 Zentimeter lang waren. Der Wildtyp in der Transformation mit leeren Vektoren zeigt kein Färbemuster. Aufgrund des Fehlens des GUS-Gens zeigte die Transformation mit dem Beta-Glucuronidase-GUS-Gen ein deutliches blaues Färbemuster in den Adern, was bestätigt, dass die Pflanzen transgen sind. Die Wurzeln sollten immer hydratisiert werden, um ein Austrocknen während des Verfahrens zu verhindern.