Name: Ex vivo Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Lernen Sie die Expansion und genetische Manipulation funktioneller hämatopoetischer Stammzellen der Maus in einer Polyvinylalkohol-basierten Kultur. Diese Methode ermöglicht Langzeitstudien zur Hämatopoese.

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Wir danken dem WIMM Flow Cytometry Core für den Zugang zur Durchflusszytometrie und dem WIMM Virus Screening Core für die Generierung lentiviraler Vektoren. Diese Arbeit wurde vom Kay Kendall Leukaemia Fund und dem UK Medical Research Council finanziert.

Alle Tierverfahren, einschließlich Zucht und Euthanasie, müssen innerhalb der institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt werden. Die unten aufgeführten Experimente wurden vom britischen Innenministerium genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste aller Materialien, Reagenzien und Geräte, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Vorbereiten von Bestandslösungen
<ol><li>PVA-Lagerlösung<ol><li>Nehmen Sie 50 ml Wasser in Gewebekulturqualität in eine kleine Glasflasche (zum Autoklavieren geeignet). Erwärmen Sie das Wasser in der Mikrowelle fast zum Kochen.</li>
		<li>5 g PVA-Pulver abwiegen und in das Wasser geben. HINWEIS: Es wird empfohlen, nur 1-5 g PVA aufzulösen. Das Auflösen größerer Mengen kann zu einer unvollständigen Rekonstitution führen.</li>
		<li>Schließen Sie den Deckel fest und schütteln Sie ihn, um ihn zu mischen. Lösen Sie dann den Deckel. Anmerkungen: Seien Sie beim erneuten Öffnen vorsichtig, da sich der Druck aufgrund der sich ändernden Wassertemperatur ändern kann.</li>
		<li>Autoklavieren und abkühlen lassen. Schließen Sie den Deckel fest und schütteln Sie ihn, um ihn zu mischen. Aliquots in sterilen Röhrchen herstellen und bis zu 3 Monate bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Lösen Sie lyophilisierte Zytokine in F-12-Medium auf, das 1 mg/ml PVA enthält. Rekonstituieren Sie den Stammzellfaktor auf 10 μg/ml und Thrombopoietin auf 100 μg/ml, um 1:1.000 Vorräte zu erzeugen. Aliquots in sterilen Röhrchen herstellen und langfristig bei -80 °C lagern. Alternativ können die Aliquots bei 4 °C bis zu 1 Woche gelagert werden. HINWEIS: Vermeiden Sie die Rekonstitution von Zytokinen im Rinderserumalbumin aufgrund des negativen Einflusses auf die HSZ-Expansion der Maus.</li>
</ol>2. HSC-Knochenmarkentnahme und c-Kit+ Anreicherung
<ol><li>Sezieren Sie die Oberschenkelknochen, Schienbeine, Becken und Wirbelsäule von frisch eingeschläferten 8-12 Wochen alten C57BL/6-Mäusen (durch CO2 -Erstickung und/oder zervikale Luxation) und legen Sie die Knochen in PBS auf Eis. Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen und Werkzeuge mit 70 % Ethanol sterilisiert sind.</li>
	<li>Reinigen Sie die Knochen mit fusselfreien, empfindlichen Arbeitstüchern, entfernen Sie Muskeln und Rückenmark und geben Sie sie mit ~ 3 ml PBS in einen Mörser. Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass der Stößel und der Mörser mit 70% Ethanol sterilisiert und dann einmal mit PBS ausgewaschen werden.</li>
	<li>Zerkleinern Sie die Knochen mit dem Stößel, ohne zu mahlen, um die Scherkräfte zu minimieren. Brechen Sie große Knochenmarkfragmente, die in das PBS freigesetzt werden, mit einer 19-G-Nadel auf, die an einer 5-ml-Spritze befestigt ist. Überführen Sie die Zellsuspension durch einen 70-μm-Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Sobald die Suspension übertragen wurde, wiederholen Sie den Vorgang mit frischem PBS, bis die Knochen gebleicht sind und kein Knochenmark mehr sichtbar ist. Streben Sie ein Endvolumen von ~30 ml pro Maus und ~50 ml für zwei Mäuse an.</li>
	<li>Mischen Sie die Knochenmarkszellen, sammeln Sie 10 μl Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:10-1:20 mit einem Hämozytometer. HINWEIS: Es wird erwartet, dass eine Maus 2-5 × 108 ganze Knochenmarkzellen liefert.</li>
	<li>Schleudern Sie bei 450 × g für 5 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in kaltem PBS (350 μl für eine Maus oder 500 μl für zwei Mäuse).</li>
	<li>Fügen Sie 0,2 μl Allophycocyanin (APC) Anti-c-Kit-Antikörper pro 10 Millionen Zellen hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C.</li>
	<li>Geben Sie 5 ml kaltes PBS zu den inkubierten Zellen, um überschüssige Antikörper abzuwaschen, und filtern Sie sie durch einen 50-μm-Filter in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie das Originalröhrchen mit 7 ml kaltem PBS und füllen Sie es durch den Filter. Wenn der Filter verstopft ist, kratzen Sie die Filteroberfläche mit einer P1000-Spitze.</li>
	<li>Schleudern Sie bei 450 × g für 5 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in kaltem PBS (350 μl für eine Maus oder 500 μl für zwei Mäuse).</li>
	<li>Fügen Sie 0,2 μl Anti-APC-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C. Fügen Sie 12 ml steriles PBS hinzu, um überschüssige Mikrokügelchen abzuwaschen.</li>
	<li>Die Zellen werden bei 450 × g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert und in 2 ml kaltem PBS resuspendiert. Während sich die Zellen in diesem Schritt drehen, fahren Sie mit Schritt 2.13 fort.</li>
	<li>Bereiten Sie sich auf die Säulenanreicherung vor, indem Sie eine magnetische Filtrationssäule in den Magneten eines magnetischen Säulenseparators einsetzen, mit einem 50-μm-Filter oben und einem konischen 15-ml-Röhrchen unten.</li>
	<li>Lassen Sie 3 ml steriles PBS durch den 50-μm-Filter und die Filtrationssäule laufen. Sobald das PBS durchlaufen ist, führen Sie die Zellsuspension durch die Säule, gefolgt von drei Waschgängen mit jeweils 3 ml kaltem PBS. Warten Sie bei jeder Wäsche, bis die Säule aufgehört hat zu tropfen, bevor Sie die nächste Wäsche hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie auf ein frisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 5 ml kaltes PBS hinzu, setzen Sie den Säulenkolben auf die Säule und eluieren Sie die Zellen, indem Sie den Kolben drücken.</li>
	<li>Mischen Sie die mit c-Kit angereicherten Zellen, sammeln Sie 10 μl Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer. Die typische Ausbeute einer Maus beträgt 2-5 × 106 c-Kit+ Zellen. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen direkt in HSC-Medien eingesät oder für die HSC-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) vorbereitet werden.</li>
</ol>3. Initiierung von Zellkulturen mit c-Kit-angereicherten HSPCs
<ol><li>Bereiten Sie frisches Medium (Tabelle 1) für die erforderliche Anzahl von Zellen/Vertiefungen vor. Samenbildung von 0,5 bis 1 Million Zellen pro ml für c-Kit-angereicherte HSPCs.</li>
	<li>Die mit c-Kit angereicherten Zellen werden heruntergedreht und in HSC-Medium mit der gewünschten Zelldichte resuspendiert.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf Fibronektin-beschichtete oder negativ oberflächengeladene Platten mit 200 μl pro 96-Well-Platte oder 1 ml pro 24-Well-Platte.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen in einen Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist.</li>
</ol>4. Initiierung von Zellkulturen mit FACS-gereinigten HSCs
<ol><li>Bereiten Sie ein geeignetes Volumen der biotinylierten Antikörperfärbung vor: 3 μl Mastermix (Tabelle 2) pro 10 Millionen Zellen, verdünnt 1:100 in PBS.</li>
	<li>Die mit c-Kit angereicherten Zellen werden heruntergedreht und 30 Minuten lang bei 4 °C in der Linienantikörperfärbung resuspendiert.</li>
	<li>Mit 10 ml sterilem PBS waschen und bei 450 × g 5 min bei 4 °C schleudern.</li>
	<li>Bereiten Sie ein geeignetes Volumen der frischen HSC-Antikörperfärbung vor (Tabelle 3): 300 μl pro 10 Millionen Zellen. Bereiten Sie neben dieser Probenfärbung geeignete Färbekontrollproben für die Kompensation und das Gating vor. Anmerkungen: Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube bei ausgeschaltetem Licht, wenn Sie farbstoffkonjugierte Antikörper verwenden.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in der HSC-Antikörperfärbung und inkubieren Sie sie bei 4 °C für 90 min. Mischen Sie die Zellen alle 20-30 Minuten durch Klopfen, um eine Zellpelletierung zu verhindern.</li>
	<li>Mit 10 ml sterilem PBS waschen und bei 450 × g 5 min bei 4 °C schleudern.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an, schnippen Sie das Pellet, um es zu unterbrechen, und resuspendieren Sie es in sterilem PBS mit 0,5 μg/ml Propidiumiodid (PI).</li>
	<li>Bereiten Sie frisches Medium (Tabelle 1) für die erforderliche Anzahl von Wells vor und plattieren Sie in Fibronektin- oder negativ oberflächengeladene Platten (200 μl pro 96-Well-Platte oder 1 ml pro 24-Well-Platte).</li>
	<li>Bereiten Sie die FACS-Maschine für die Sortierung vor und sortieren Sie CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-HSCs direkt in medienhaltige Vertiefungen (siehe Abbildung 1 für die hier verwendete Standard-FACS-Anschnittstrategie). Sortieren Sie bis zu 200 Zellen pro 96-Well-Plattenvertiefung oder bis zu 1.000 Zellen pro 24-Well-Well. HINWEIS: FACS-Maschinen sollten von einem geschulten Wissenschaftler bedient werden. Es wird empfohlen, dass sich Benutzer an ihre örtliche FACS-Einrichtung wenden, um diese Sortierstrategie zu besprechen, wenn sie keine Erfahrung mit der FACS-Isolierung von Maus-HSCs haben.</li>
</ol>5. Medienwechsel durchführen
<ol><li>Bei Zellkulturen, die aus c-Kit-angereicherten Zellen initiiert wurden, beginnt der Medienwechsel nach 2 Tagen. Bei Zellkulturen, die aus FACS-isolierten HSCs initiiert wurden, beginnt der Medienwechsel nach 5 Tagen.</li>
	<li>Bereiten Sie für alle Vertiefungen ausreichend frisches, vorgewärmtes (~37 °C) HSC-Medium (Tabelle 1) vor.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte vorsichtig aus dem Gewebekultur-Inkubator. HINWEIS: Da HSPCs auf negativ oberflächengeladenen Platten leichter gestört werden als solche auf Fibronektin, sollte beim Wechsel des Mediums auf negativ oberflächengeladenen Platten besondere Vorsicht walten lassen, um eine Störung der Zellkulturen zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Pipette oder Vakuumpumpe langsam ~90%-95% des Mediums aus dem Brunnenmeniskus. Anmerkungen: Vermeiden Sie es, das Medium vom Boden der Vertiefung aufzuziehen, da sonst viele Zellen entfernt werden.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl (für 96-Well-Platten; 1 ml für 24-Well-Platten) frisches Medium in die Well.</li>
	<li>Setzen Sie die Platte wieder in den Inkubator für Gewebekulturen ein.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.6 alle 2-3 Tage bis zum experimentellen Endpunkt.</li>
	<li>Bei Zellkulturen, die mit c-Kit-angereicherten HSPCs (Abschnitt 3) initiiert wurden, werden die Kulturen nach ~3 Wochen im Verhältnis 1:2-1:3 aufgeteilt. Bei Zellkulturen, die mit FACS-gereinigten HSCs (Abschnitt 4) initiiert wurden, teilen Sie die Kulturen im Verhältnis 1:2-1:3 nach ~3 Wochen und wenn die Kulturen zu >90% konfluent sind. HINWEIS: Der genaue Zeitplan hängt von den experimentellen Interessen ab. Diese Kulturen wurden für 4-8Wochen charakterisiert 8, aber es können auch zusätzliche Kulturlängen möglich sein.</li>
</ol>6. Elektropolieren von kultivierten HSPCs
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Elektroporation von Cas9/sgRNA-Ribonukleoprotein (RNP) vorgesehen, könnte aber auch für die Elektroporation von mRNA oder anderen rekombinanten Proteinen angepasst werden. Initiieren Sie Kulturen mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen, um dies zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt durchzuführen.
<ol><li>Führen Sie 1 Tag vor der Elektroporation einen Mediumwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben. HINWEIS: Es wird empfohlen, vor der Elektroporation mindestens eine Kultur über Nacht zu erhalten. Die Zellen werden jedoch in der Regel 1-3 Wochen lang kultiviert, bevor sie transduziert werden.</li>
	<li>Stellen Sie am Tag der Elektroporation den Nukleofektor auf. Schalten Sie das Gerät ein. Wählen Sie auf dem Touchscreen das X-Modul und dann die verwendete Küvettengröße aus.</li>
	<li>Bereiten Sie eine ausreichende P3-Lösung (gemäß den Anweisungen des Herstellers) für den Maßstab der Elektroporation vor (100 μl pro Küvette oder 20 μl pro Mikroküvette) und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausgleichen.</li>
	<li>Bereiten Sie ausreichend frisches Medium (Tabelle 1) für die Anzahl der zu plattierenden Wells vor und fügen Sie 500 μl Medium für eine 24-Well-Plattenvertiefung oder 100 μl Medium für eine 96-Well-Plattenvertiefung hinzu.</li>
	<li>Die sgRNA (vorverdünnt auf 2 μg/ml in RNase-freiem Wasser) auf Eis auftauen und 16 μg sgRNA mit 30 μg Cas9-Enzym (bei 10 μg/ml) in einem sterilen PCR-Röhrchen mischen. Fügen Sie ein zusätzliches PCR-Röhrchen hinzu, das nur Cas9-Protein als Kontrolle enthält. Mischen Sie, indem Sie die Röhre schnippen und dann kurz nach unten drehen. Bei 25 °C für 10 min in einem Thermocycler inkubieren, um das RNP zu komplexieren, und dann die Röhrchen auf Eis halten. HINWEIS: Dies kann verfünffacht werden, wenn die Elektroporation in Mikroküvetten durchgeführt wird.</li>
	<li>Mischen und überführen Sie die HSPCs für die Elektroporation in ein Röhrchen; Sammeln Sie 10 μL der Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer. HINWEIS: Es wird empfohlen, 1-5 Millionen Zellen pro 100-μl-Küvette zu elektroporieren (für die Mikroküvette fünffach herunterskaliert).</li>
	<li>Die entsprechenden Zahlenzellen werden in einem 1,5-ml-Röhrchen bei 450 × g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert. Saugen Sie so viel wie möglich vom Überstand ab und resuspendieren Sie ihn mit 100 μl Nukleofektionspuffer.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension sofort in das PCR-Röhrchen mit dem komplexierten RNP und pipettieren Sie langsam auf und ab, um sie vorsichtig zu mischen und in eine 100-μl-Elektroporationsküvette zu überführen. Werfen Sie das Gemisch langsam und in einer flüssigen Bewegung in die Küvette aus, um die Bildung von Luftblasen in der Küvette zu vermeiden.</li>
	<li>Wählen Sie am Elektroporator die Position der zu elektroporierenden Wells aus. Wählen Sie über den Touchscreen das Zelltypprogramm CD34+, Mensch oder geben Sie den Impulscode EO100 ein. Drücken Sie die OK-Taste.</li>
	<li>Übertragen Sie die Küvetten in den Elektroporator. Drücken Sie die Start-Taste auf dem Touchscreen, um die Elektroporation zu starten. Direkt nach der Elektroporation werden 500 μl des Nährmediums in die Küvette gegeben (100 μl bei Verwendung einer Mikroküvette).</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen vorsichtig auf die vorbereitete Platte und kehren Sie in den Gewebekultur-Inkubator zurück.</li>
	<li>Bei Verfahren, bei denen eine AAV6-Spenderschablone verwendet wird, wird der Vektor sofort nach dem Transfer der Zellen auf eine mit Fibronektin beschichtete Platte in einer Konzentration von 5.000 Vektoren/Zelle hinzugefügt.</li>
	<li>Bereiten Sie nach 6-18 Stunden frisches Medium vor und führen Sie einen Mediumwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Entfernen Sie für diesen Medienwechsel nur 80%-90% des Mediums. Anmerkungen: Vermeiden Sie es, das Medium vom Boden der Vertiefung aufzuziehen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen nach 2 oder mehr Tagen mittels Durchflusszytometrie (siehe Abschnitt 8 für Details).</li>
	<li>Führen Sie weiterhin alle 2 Tage einen Medienwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben, bis der experimentelle Endpunkt erreicht ist. HINWEIS: Die Editierungsraten von CRISPR/Cas9 mit dieser Methode hängen stark von der Targeting-Effizienz der entworfenen sgRNA ab. Bearbeitungsraten von bis zu 95 % wurden mit einem effizienten Leitfadenbeobachtet 15. Richtlinien für das sgRNA-Design wurden bereits an anderer Stelle ausführlich beschrieben19,20.</li>
</ol>7. Transduzieren von kultivierten HSPCs mit lentiviralem Vektor
HINWEIS: Initiieren Sie Kulturen mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen, um dies zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt durchzuführen.
<ol><li>Generierung und Titer lentiviraler Vektoren (abhängig von den experimentellen Zielen). Lentiviralen Vektor auf Eis auftauen.</li>
	<li>Führen Sie einen Medienwechsel durch (wie in Abschnitt 5 beschrieben). Mischen Sie dann die HSPCs für die Transduktion und übertragen Sie sie in ein Röhrchen. Sammeln Sie 10 μl der Zellen und zählen Sie mit Türks-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer. Anmerkungen: Die Zellen können sofort nach dem Galvanisieren transduziert werden. Die Zellen werden jedoch in der Regel 1-3 Wochen lang kultiviert, bevor sie transduziert werden.</li>
	<li>Die erforderliche Dosis von Zellen für die Transduktion wird neu plattiert (in der Regel 100.000 Zellen pro 96-Well-Platte). Separat werden nicht transduzierte Negativkontrollzellen geblendet. HINWEIS: Wenn Sie negative oberflächengeladene Platten verwenden, übertragen Sie die Zellen auf Fibronektin-beschichtete Platten für die lentivirale Vektortransduktion.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Zelltopf einen lentiviralen Vektor hinzu: Fügen Sie 20 Transduktionseinheiten pro Zelle hinzu, um eine Transduktionseffizienz von ~30 % zu erreichen. Die lentivirale Vektordosis ist jedoch empirisch zu bestimmen, abhängig von den experimentellen Anforderungen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der lentivirale Vektor gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt wird.</li>
	<li>Bringen Sie die Zellen für 6 h in den Inkubator für Gewebekulturen zurück. Führen Sie anschließend einen Medienwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben. HINWEIS: Der Überstand enthält lebende Viren. Entsorgen Sie gemäß den institutionellen Richtlinien.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie (z. B. auf GFP-Expression) nach 2 Tagen oder mehr. Weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 8.</li>
	<li>Führen Sie weiterhin alle 2 Tage einen Medienwechsel durch, wie in Abschnitt 5 beschrieben, bis der experimentelle Endpunkt erreicht ist.</li>
</ol>8. Durchflusszytometrische Analyse von HSPC-Kulturen
<ol><li>Es wird eine konzentrierte kultivierte ex vivo HSC-Antikörpermischung in PBS hergestellt, die 2 % FBS enthält (Tabelle 4). Lagern Sie die Mischung bei 4 °C im Dunkeln bis zu 1 Monat. Anmerkungen: Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube bei ausgeschaltetem Licht, wenn Sie farbstoffkonjugierte Antikörper verwenden.</li>
	<li>Fügen Sie 2 μl konzentrierte Antikörpermischung zu 50 μl Zellen hinzu. 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie neben dieser Probenfärbung geeignete Färbekontrollproben für die Kompensation und das Gating vor.</li>
	<li>Fügen Sie 200-1.000 μl PBS mit 2% FBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 450 × g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und resuspendieren Sie 100-500 μl PBS mit 2 % FBS und 0,5 μg/ml PI.</li>
	<li>Richten Sie das Durchflusszytometer ein und erfassen Sie mindestens 10.000 lebende Zellen pro Probe. HINWEIS: Durchflusszytometer sollten von einem geschulten Wissenschaftler bedient werden. Benutzer müssen sich an ihre örtliche FACS-Einrichtung wenden, um diese Analyse zu besprechen, wenn sie keine Erfahrung in der Durchflusszytometrie haben.</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten im FCS-Format und analysieren Sie die Daten mit einer geeigneten Durchflusszytometrie-Analysesoftware. In Abbildung 2 finden Sie die hier verwendete Standard-Gating-Strategie.</li>
</ol>

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<li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Wir hoffen, dass dieses Protokoll einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung der HSZ-Biologie, Hämatopoese und Hämatologie im Allgemeinen bietet. Seit der Erstentwicklung der PVA-basierten Kulturmethode für FACS-gereinigte HSCs8 wurde die Methode erweitert. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Methode mit c-Kit, angereichert mit Knochenmark, und mit negativ oberflächengeladenen Platten14 funktioniert. Seine Kompatibilität mit Transduktion und Elektroporation wurde ebenfall...

Das hämatopoetische System unterstützt eine Reihe essentieller Prozesse bei Säugetieren, von der Sauerstoffversorgung über die Bekämpfung von Krankheitserregern bis hin zu spezialisierten Blut- und Immunzelltypen. Eine kontinuierliche Blutproduktion (Hämatopoese) ist erforderlich, um die Homöostase des Blutsystems zu unterstützen, die von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aufrechterhalten wird1. Die primitivste hämatopoetische Zelle ist die hämatopoetische Stammzelle (HSC), die über einzigartige Fähigkeiten zur Selbsterneuerung und Multilineage-Differenzierung verfügt 2,3. Dabei handelt es sich um eine seltene Zellpopulation, die vor allem im adulten Knochenmark4 vorkommt, wo sie mit einer Häufigkeit von nur etwa einer von 30.000 Zellen vorkommt. Es wird angenommen, dass HSZ die lebenslange Hämatopoese unterstützen und helfen, die Hämatopoese nach hämatologischem Stress wiederherzustellen. Diese Kapazitäten ermöglichen es HSZ auch, das gesamte hämatopoetische System nach der Transplantation in einen bestrahlten Empfänger stabil zu rekonstituieren5. Dies stellt die funktionelle Definition einer HSZ dar und bildet auch die wissenschaftliche Grundlage für die HSZ-Transplantationstherapie, eine kurative Behandlung einer Reihe von Blut- und Immunerkrankungen6. Aus diesen Gründen sind HSZ ein wichtiger Schwerpunkt der experimentellen Hämatologie.
Trotz eines großen Forschungsschwerpunkts ist es nach wie vor eine Herausforderung, HSCs ex vivo stabil zu erweitern 7. Vor kurzem haben wir das erste langfristige ex vivo Expansionskultursystem für Maus-HSCs8 entwickelt. Der Ansatz kann transplantierbare HSZ über eine 4-wöchige Kultur um das 234- bis 899-fache erweitern. Im Vergleich zu alternativen Ansätzen bestand die wesentliche Änderung des Protokolls darin, dass Serumalbumin entfernt und durch ein synthetisches Polymer ersetzt wurde. Polyvinylalkohol (PVA) wurde als optimales Polymer für die HSC-Kulturender Maus identifiziert 8, das nun auch zur Kultivierung anderer hämatopoetischer Zelltypen9 verwendet wurde. Kürzlich wurde jedoch auch ein anderes Polymer namens Soluplus (ein Polyvinylcaprolactam-acetat-Polyethylenglykol-Pfropfcopolymer) identifiziert, das die klonale HSC-Expansion zu verbessernscheint 10. Vor der Verwendung von Polymeren wurde Serumalbumin in Form von fötalem Kälberserum, Rinderserumalbuminfraktion V oder rekombinantem Serumalbumin verwendet, die jedoch nur eine begrenzte Unterstützung für die HSC-Expansion boten und nur eine kurzfristige (~1 Woche) ex vivo Kultur unterstützten7. Es sollte jedoch beachtet werden, dass HSC-Kulturprotokolle, die HSCs in einem Ruhezustand halten, eine längere ex vivo Kulturzeit unterstützen können11,12.
Im Vergleich zu anderen Kulturmethoden ist ein großer Vorteil von PVA-basierten Kulturen die Anzahl der Zellen, die erzeugt werden können, und die Zeitspanne, in der das Protokoll verwendet werden kann, um HSZ ex vivo zu verfolgen. Dies überwindet mehrere Barrieren auf dem Gebiet der experimentellen Hämatologie, wie z.B. die geringe Anzahl von HSCs, die pro Maus isoliert werden können (nur einige Tausend) und die Schwierigkeit, HSCs über die Zeit in vivo zu verfolgen. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Kulturen die HSC-Proliferation stimulieren, während der In-vivo-HSC-Pool in einem stationären Zustand überwiegend ruht13. Obwohl die Kulturen selektiv für HSCs sind, reichern sich im Laufe der Zeit zusätzliche Zelltypen mit den Kulturen an, und transplantierbare HSCs machen nach 1 Monat nur etwa eine von 34 Zellen aus. Myeloische hämatopoetische Vorläuferzellen scheinen der wichtigste kontaminierende Zelltyp in diesen HSC-Kulturen zu sein8. Nichtsdestotrotz können wir diese Kulturen zur Anreicherung für HSCs aus heterogenen Zellpopulationen (z.B. c-Kit+ Knochenmark-HSPCs14) verwenden. Es unterstützt auch die Transduktion oder Elektroporation von HSCs für die genetische Manipulation14,15,16. Um die Identifizierung von HSCs aus der heterogen kultivierten HSPC-Population zu erleichtern, wurde CD201 (EPCR) kürzlich als nützlicher ex vivo HSC-Marker10,17,18 identifiziert, wobei transplantierbare HSCs auf die CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage- Fraktion beschränkt sind.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Bewertung von PVA-basierten HSC-Expansionskulturen der Maus sowie Protokolle zur genetischen Manipulation innerhalb dieser Kulturen mittels Elektroporation oder lentiviraler Vektortransduktion. Es wird erwartet, dass diese Methoden für eine Reihe von experimentellen Hämatologen nützlich sein werden.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionskit</td><td>Fisher Scientific</td><td>12764416</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Appleton Woods Ltd</td><td>HC002</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primärzelle 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Stößel und Mörser</td><td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td><td>X18000</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>VWR International Ltd</td><td>720-2519</td><td></td></tr><tr><td>19 G Nadel</td><td>VWR International Ltd</td><td>613-5394</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m Zellensieb</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2317</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Zellsieb</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Tücher</td><td>VWR International Ltd</td><td>115-2075</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuklease V3, 100 &mu; g</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td></td>1081058</tr><tr><td>Tierfreier rekombinanter Mausstammzellfaktor&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-250-03</td><td></td></tr><tr><td>Tierfreies rekombinantes Maus-Thrombopoietin</td><td>Peprotech</td><td>AF-315-14</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD117 APC (Klon: 2B8)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-1171-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD117 BV421 (Klon: 2B8)</td><td>Biolegend</td><td>105828</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD127&nbsp; APC/Cy7 (Klon: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD127 Biotin (Klon: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD150 PE/Cy7 (Klon: TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115914</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD201&nbsp; APC (Klon: eBio1560)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-2012-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD34 FITC (Klon: RAM34)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD4&nbsp; APC/Cy7 (Klon: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100526</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD4 Biotin (Klon: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100508</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45R&nbsp; APC/Cy7 (Klon: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45R Biotin (Klon: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD48 BV421 (Klon: HM48-1)</td><td>Biolegend</td><td>103428</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD8 Biotin (Klon: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD8a&nbsp; APC/Cy7 (Klon: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6G/Ly6C&nbsp; APC/Cy7 (Klon: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108424</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6G/Ly6C Biotin (Klon: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Sca1 PE (Klon: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ter119&nbsp; APC/Cy7 (Klon: TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ter119 Biotin (Klon: TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND-Platten, 24-Well-Corning</td><td></td><td>3337</td><td>negativ oberflächengeladene</td></tr><tr><td>CellBIND-Platten, 96-Well&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3330</td><td>negativ oberflächengeladene</td></tr><tr><td>kundenspezifische synthetische sgRNA&nbsp;</td><td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>F7524-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin beschichtete Platten, 96-well</td><td>BD Biosciences</td><td>354409</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nährstoffmischung</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen-X (100x)</td><td>Gibco</td><td>51500.056</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61196. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodid</td><td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td><td>EXB-0018</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405208</td><td></td></tr><tr><td>T&uuml; rks" Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Mettler-Toledo Ltd</td><td>95015662</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo expansion und genetische manipulation von hämatopoetischen stammzellen der maus in kulturen auf polyvinylalkoholbasis

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Selbsterneuernde multipotente hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind aufgrund ihrer Fähigkeit, die Hämatopoese ein Leben lang zu unterstützen und das gesamte Blutsystem nach einer Transplantation zu rekonstituieren, ein wichtiger Zelltyp. HSZ werden klinisch in Stammzelltransplantationstherapien eingesetzt, die eine kurative Behandlung für eine Reihe von Blutkrankheiten darstellen. Es besteht ein großes Interesse sowohl am Verständnis der Mechanismen, die die HSZ-Aktivität und Hämatopoese regulieren, als auch an der Entwicklung neuer HSZ-basierter Therapien. Die stabile Kultivierung und Expansion von HSCs ex vivo war jedoch ein großes Hindernis bei der Untersuchung dieser Stammzellen in einem handhabbaren ex vivo System. Wir haben kürzlich ein auf Polyvinylalkohol basierendes Kultursystem entwickelt, das die langfristige und großflächige Expansion von transplantierbaren Maus-HSCs und Methoden zu deren genetischer Editierung unterstützen kann. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kultivierung und genetischen Manipulation von Maus-HSCs durch Elektroporation und lentivirale Transduktion. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für ein breites Spektrum von experimentellen Hämatologen nützlich sein wird, die sich für HSZ-Biologie und Hämatopoese interessieren.

Für die FACS-Aufreinigung von HSCs erwarten wir, dass innerhalb des c-Kit-angereicherten Knochenmarks ~0,2% der Zellen die CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-Population für junge (8-12 Wochen alte) C57BL/6-Mäuse sind (Abbildung 1). Es ist jedoch wahrscheinlich, dass transgene Mäuse oder Mäuse unterschiedlichen Alters unterschiedliche HSZ-Frequenzen aufweisen. Nach 4 Wochen Kultur erwarten wir, dass der CD201+CD150+c-Kit+Sca1</...

Hier wird ein Protokoll zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Analyse hämatopoetischer Stammzellkulturen der Maus unter Verwendung von ex vivo Polyvinylalkohol-basierter Expansion sowie Methoden zur genetischen Manipulation dieser Zellen durch lentivirale Transduktion und Elektroporation vorgestellt.

Ex vivo Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Expansion und genetische Manipulation von funktionellen hämatopoetischen Stammzellen der Maus und ermöglicht so ein tieferes Verständnis der Biologie und Hämatopoese hämatopoetischer Stammzellen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hämatopoetische Stammzellen in einer langfristigen ex vivo Kultur unterstützen kann und eine genetische Manipulation ermöglicht, um die Genetik der Hämatopoese zu hinterfragen. Dieses Kultursystem bietet eine Plattformtechnologie für verschiedene Studien zur hämatopoetischen Stammzellbiologie und Hämatopoese, einschließlich genetischer, molekularer und biochemischer Studien.In der Tabelle zur Fehlerbehebung sind die Ursachen und Lösungen für die häufigsten Probleme aufgeführt, die bei dieser Technik auftreten. Es ist viel einfacher und effektiver zu zeigen, wie man Knochenmarkzellen richtig extrahiert und komplette Medienwechsel durchführt, als darüber zu lesen. Um mit der Extraktion hämatopoetischer Stammzellen (HSC) zu beginnen, verwenden Sie fusselfreie, empfindliche Tücher, um die Knochen zu reinigen, die frisch von ordnungsgemäß eingeschläferten Mäusen isoliert wurden.Entfernen Sie Muskeln und Rückenmark von den Knochen, bevor Sie sie in einen Mörser geben, der etwa drei Milliliter PBS enthält. Zerdrücken Sie die Knochen mit einem Stößel, ohne sie zu zerkleinern, um die Scherkräfte zu minimieren. Brechen Sie dann mit einer 19-Gauge-Nadel, die an einer 5-Milliliter-Spritze befestigt ist, die großen Knochenmarkfragmente auf, die in das PBS freigesetzt werden, und übertragen Sie die Suspension durch einen 70-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Sobald die Suspension übertragen wurde, wiederholen Sie den Vorgang mit frischem PBS, bis die Knochen gebleicht sind. Streben Sie ein Endvolumen von etwa 30 Millilitern pro Maus und 50 Milliliter für zwei Mäuse an, um die Knochen zu bleichen, bis kein Knochenmark mehr sichtbar ist. Bereiten Sie sich auf die Säulenanreicherung vor, indem Sie eine magnetische Filtrationssäule in den Magneten eines Magnetsäulenseparators mit einem 50-Mikron-Filter oben und einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen unten einsetzen.Nachdem Sie die Zellen mit Allophycocyanin-Anti-c-Kit-Antikörpern und magnetischen Allophycocyanin-Mikrokügelchen behandelt haben, lassen Sie als Nächstes drei Milliliter steriles PBS durch den 50-Mikron-Filter und die Filtrationssäule laufen. Sobald das PBS durchlaufen ist, führen Sie die Zellsuspension durch die Säule, gefolgt von drei Waschgängen mit jeweils drei Millilitern kaltem PBS. Warten Sie nach jedem Waschgang, bis die Säule aufgehört hat zu tropfen, bevor Sie PBS für den nächsten Waschgang hinzufügen.Entfernen Sie als Nächstes die Säule vom Magneten und legen Sie sie auf ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie fünf Milliliter kaltes PBS in die Säule, bevor Sie den Säulenkolben darauf montieren und die Zellen durch Drücken des Kolbens eluieren. Befolgen Sie das im Text beschriebene Protokoll, um genügend HSC-Medium für die gewünschte Anzahl von Zellen oder Vertiefungen vorzubereiten, um 0,5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter zu besiedeln. Anschließend werden die c-Kit-angereicherten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) heruntergedreht und das Pellet im frisch präparierten HSC-Medium mit der gewünschten Zelldichte resuspendiert.Übertragen Sie die Zellen unter Beibehaltung des entsprechenden Volumens auf Fibronektin-beschichtete oder negativ oberflächengeladene Platten. Legen Sie die Zellen in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nachdem Sie die Platte vorsichtig aus dem Gewebekultur-Inkubator entfernt haben, ohne die Zellkulturen zu stören, verwenden Sie eine Pipette oder Vakuumpumpe, um langsam etwa 90 bis 95 % des Mediums aus dem flüssigen Meniskus jeder Vertiefung anzusaugen.Vermeiden Sie es, Medium vom Boden der Vertiefung aufzuziehen. Dann einen Milliliter frisches, auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Medium in die Mulde geben. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator für Gewebekulturen zurück und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis das Experiment dies erfordert.Nachdem Sie die Zellen in Nukleofektionspuffer resuspendiert haben, übertragen Sie die Zellsuspension sofort in das PCR-Röhrchen, das das komplexierte Ribonukleoprotein enthält, und mischen Sie sie vorsichtig durch langsames Auf- und Abpipettieren. Übertragen Sie nun das Gemisch sehr langsam in eine Elektroporationsküvette mit entsprechendem Volumen und halten Sie eine kontinuierliche Flüssigkeitsbewegung aufrecht, um die Bildung von Luftblasen in der Küvette zu vermeiden. Wählen Sie dann auf dem Elektroporator die Position der zu elektroporierenden Wells aus.Wählen Sie über den Touchscreen das Zelltypprogramm als CD34-positiver Mensch aus oder geben Sie den Impulscode EO100 ein und drücken Sie dann die OK-Taste. Übertragen Sie die Küvette in den Elektroporator und drücken Sie die Starttaste auf dem Touchscreen, um die Elektroporation zu starten. Unmittelbar nach der Elektroporation wird das fünffache Reaktionsvolumen des Nährmediums in die Küvette gegeben.Übertragen Sie nun die Zellen vorsichtig auf die vorbereitete Platte und legen Sie die Platte wieder in den Gewebekultur-Inkubator. Nachdem Sie einen Mediumwechsel durchgeführt haben, wie zuvor gezeigt, sammeln Sie 10 Mikroliter der Zellen und zählen Sie sie mit Turk-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer. Die erforderliche Dosis der Zellen wird für die Transduktion in mit Fibronektin beschichteten Platten neu plattiert und die nicht transduzierten Negativkontrollzellen separat plattiert.Fügen Sie dann den lentiviralen Vektor zu jeder Vertiefung hinzu, die Zellen enthält, wobei eine Dosis von 20 Transduktionseinheiten pro Zelle beibehalten wird, um eine Transduktionseffizienz von etwa 30 % zu erreichen. Die lentivirale Vektordosis ist jedoch empirisch in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen zu bestimmen. Zum Schluss werden die Zellen für sechs Stunden in den Gewebekultur-Inkubator zurückgeführt.Führen Sie einen Medienwechsel wie zuvor beschrieben durch. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der c-Kit-angereicherten HSCs ergab etwa 0,2% der Zellen, die CD150-positiv, CD34-negativ, c-Kit-positiv, Sca1-positiv und liniennegativ waren. Nach vierwöchiger HSPC-Kultur betrug die CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive und lineage-negative Fraktion etwa 10 %Nach der Transduktion mit einem GFP-exprimierenden lentiviralen Vektor betrugen die GFP-positiven Zellen etwa 30 %Bei der Konfluation betrug die erwartete Dichte der Kulturen etwa 2 Millionen Zellen pro Milliliter.Innerhalb der ersten 24 bis 48 Stunden vor dem ersten Mediumwechsel wurde ein Zelltod von etwa 50 % beobachtet. Nach einer Woche kehrte die Zellzahl jedoch auf 80 bis 100 % der ausgesäten Zellzahl zurück. Genaue Medienwechsel mit frischen und vorgewärmten Medien sind entscheidend für die Langzeitstabilität dieser HSC-Kulturmethode.Seit der Veröffentlichung der ursprünglichen Methode im Jahr 2019 hat das Fachgebiet begonnen, sie auf unterschiedliche Weise zur Untersuchung der HSZ-Biologie einzusetzen.

ex-vivo-expansion-genetic-manipulation-mouse-hematopoietic-stem-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Ein 3D-Kultur für Hämatopoese wird unter Verwendung von humanem Nabelschnurblut und leukämischen Knochenmarkszellen. Verfahren basiert auf der Verwendung eines porösen, synthetischen Polyurethan Gerüst mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet ist. Dieses Gerüst ist anpassbar an eine Vielzahl von Zellen aufnehmen.

Ex-vivo-Mimikry von normalen und anormalen menschlichen Hämatopoese

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Hier beschreiben wir die Ex Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut behandelt mit einer Kombination aus einem Zytokin-cocktail und VPA. Diese Methode führt zu einem bedeutenden Grad von ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder für klinische oder Laboranwendungen.

Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34+ Zellen mit Valproinsäure

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes hämatopoetisches Stamm- und Vorläuferzell-Kulturverfahren (HSPC) für die robuste Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo.

CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Lernen Sie die Expansion und genetische Manipulation funktioneller hämatopoetischer Stammzellen der Maus in einer Polyvinylalkohol-basierten Kultur. Diese Methode ermöglicht Langzeitstudien zur Hämatopoese.

Ex vivo Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis

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