Spannungsabhängige Kaliumstromaufzeichnung an H9C2-Kardiomyozyten mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Technik

Dieses Protokoll zeichnet erfolgreich die Auswirkungen des Aconitins auf das IKv von H9C2-Zellen auf. Förderung neuer Phasen zur Untersuchung des Mechanismus der Kardiotoxizität von Arzneimitteln aus der Perspektive von Ionenkanälen. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik ist der Goldstandard der Ionenkanalforschung mit hoher Empfindlichkeit, hoher Präzision und hoher Spezifität.

Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik kann eingesetzt werden, um die pharmakologischen oder toxischen Mechanismen der Gegenüberstellung spezifischer Ionenkanäle für Multisystemerkrankungen wie Herz-Kreislauf-System und Nervensystem zu erforschen. Um zu beginnen, verdauen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin für 30 Sekunden, sobald die H9C2-Kulturschale 80% konfluent ist. Kultur 2 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter mit normalem Medium oder arzneimittelhaltigem Medium in einer 35-Millimeter-Schale, die mit Glasplatten ausgelegt ist, für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, mit einer Kohlendioxidatmosphäre von 5% und 70 bis 80% relativer Luftfeuchtigkeit.

Schalten Sie den Mikropipettenzieher ein und heizen Sie ihn 30 Minuten vor. Dann legen Sie eine Borosilikatglaskapillare mit einem Filament auf den Mikropipettenzieher. Wählen Sie das Programm aus und klicken Sie in der Systemsteuerung auf Enter.

Klicken Sie auf das Rampenprogramm in der oberen rechten Ecke, um den Heizwert der Glaskapillare zu bestimmen. Schreiben Sie das Programm zum Ziehen der Elektrode gemäß dem durch den Rampentest ermittelten Wert und klicken Sie auf Pull, um mit der Herstellung der Pipetten zu beginnen. Schalten Sie den digitalen Analogwandler, den Signalverstärker, den Mikromanipulator, das Mikroskop und die Kamera ein.

Öffnen Sie die Imaging-Anwendung, die Signalverstärker-Software und die Datenerfassungssoftware nacheinander. Klicken Sie auf Erfassen und wählen Sie Protokoll bearbeiten in der Datenerfassungssoftware. Bearbeiten Sie das Programm in der Wellenformschnittstelle.

Geben Sie Werte für die erste Ebene, die Delta-Ebene, die erste Dauer und die Delta-Dauer für Epoche A, Epoche B und Epoche C ein.Klicken Sie dann auf die Modus-Tarifschnittstelle und legen Sie die Testhierarchiedaten fest. Klicken Sie anschließend auf Protokoll bearbeiten, um die Stimulus-Schaltfläche auszuwählen und das Leck-Subtraktionsprogramm im PM-Leck-Subtraktionsdialog einzustellen. Um den Datenspeicherpfad einzurichten, klicken Sie auf Datei und wählen Sie Datendateinamen in der Datenerfassungssoftware festlegen.

Öffnen Sie dann das etablierte lKv-Protokoll, indem Sie in der Datenerfassungssoftware Acquire auswählen und auf Open Protocol klicken. Klicken Sie abschließend auf die Option Tools und wählen Sie Membrantest, um die Ausführung des Protokolls zu starten. Die extrazelluläre Lösung wird in das Zellbad auf dem Ganzzellen-Patch-Clamp-Apparat gegeben und der Deckel mit den H9C2-Zellen im Bad nach oben gelegt.

Füllen Sie 30% der Pipette mit der extrazellulären Lösung und installieren Sie sie auf dem in die Patchklemmvorrichtung integrierten Aufzeichnungselektrodenhalter. Ziehen Sie die Pipette mit dem Aufnahmeelektrodenhalter fest. Lassen Sie dann die Pipette mit dem Mikromanipulator in das Bad fallen.

Klicken Sie auf die Pipettenoffset-Schnittstelle der Signalverstärkersoftware, um die lKv-Strombasislinie bei null Pikoampere zu halten. Liefern Sie manuell einen geeigneten Überdruck mit einer 1,0-Milliliter-Spritze, die mit dem Aufzeichnungselektrodenhalter verbunden ist, durch einen Kunststoffschlauch. Bewegen Sie die Pipette leicht, indem Sie den Mikromanipulator dreidimensional manipulieren, um die Zelle zu kontaktieren.

Sobald die Rechteckwelle der Membrantests um ein Drittel bis zur Hälfte abfällt, nachdem die Pipette die Zellmembran berührt hat, entfernen Sie den Überdruck und liefern Sie manuell einen entsprechenden Unterdruck. Klicken Sie dann auf die Patch-Oberfläche der Datenerfassungssoftware, um das Gigaseal zu bilden. Verwenden Sie die Software für die Kapazitätskompensation schnell und die Kapazitätskompensation für langsame Signalverstärker während der Zelldecke, um die schnelle und langsame Kapazität zu kompensieren.

Wenden Sie kurze Unterdruckimpulse an, um einen Fleck der Zellmembran zu zerreißen. Führen Sie die Kapazitätskompensation der Ganzzellenmembran aus, indem Sie auf die Ganzzellentaste der Signalverstärkersoftware klicken. Speichern und notieren Sie abschließend die Daten, indem Sie auf die Schaltfläche Datenaufzeichnung klicken.

Öffnen Sie die gespeicherten lKv-Daten mit der Datenanalysesoftware. Speichern Sie die aktuellen Spannungsbeziehungen. Klicken Sie auf Analysieren, um Statistiken auszuwählen.

Wählen Sie den Bereich als Cursor 1 2 für die Datenanalyse aus, klicken Sie auf die Schaltflächen Spitzenamplitude und Mittelwert und klicken Sie dann auf OK, um die Daten auf der Ergebnisseite anzuzeigen. Kopieren Sie schließlich die Spalte mit lKv-Mittelwertdaten zur weiteren Analyse in die Funktionszeichnungssoftware. Speichern Sie die repräsentativen lKv-Stromspuren.

Klicken Sie auf Bearbeiten, um Übertragungsspuren auszuwählen, und wählen Sie dann die vollständige Ablaufverfolgung in der zu übertragenden Region aus. Klicken Sie anschließend auf Select in trace selection und wählen Sie IN 0 in Signalen. Klicken Sie abschließend auf OK, um die Daten auf der Ergebnisseite anzuzeigen, und kopieren Sie die Gesamtdaten in die Funktionszeichensoftware, um die aktuellen Spuren zu zeichnen.

Speichern Sie das lKv-Protokoll. Klicken Sie auf Bearbeiten, um Stimulus-Wellenformsignal erstellen auszuwählen, und wählen Sie OK. Wiederholen Sie dann den Schritt zum Zeichnen von Stromspuren, ohne das Signal auszuwählen.

Der lKv wurde durch 150 Millisekunden depolarisierenden Impulsreizes von minus 40 bis plus 60 Millivolt bei einem Haltepotential von minus 60 Millivolt ausgelöst. Der lKv der H9C2-Kardiomyozyten der Ratte erschien zuerst um minus 20 Millivolt, und dann nahm die Amplitude mit weiterer Depolarisation zu. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die lKv-Amplitude nach der fünfminütigen Behandlung mit 1,5 Millimolar 4-AP beobachtbar reduziert.

Zusätzlich sank der lKv bei Membranpotentialen dosisabhängig nach der 24-stündigen AC-Behandlung signifikant von 10 bis 60 Millivolt. Die einzelne Zelle nach der Aufnahme des Ionenkanals kann für weitere Einzelzell-Omics-Beurteilungen verwendet werden, wie z.B. Einzelzellgenomik, Transkriptomik, Proteomik und die Metabolomik.