Name: Spannungsabhängige Kaliumstromaufzeichnung an H9C2-Kardiomyozyten mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Technik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Lernen Sie die Aufzeichnung spannungsabhängiger Kaliumströme in H9C2-Kardiomyozyten mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kardiotoxischer Mechanismen von Arzneistoffen wie Aconitin auf Ionenkanälebene.

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Die kommerziell gewonnenen H9c2-Kardiomyozyten der Ratte (siehe Materialtabelle) wurden in DMEM inkubiert, das 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einer mit 5%CO2 befeuchteten Atmosphäre enthielt. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik wurde dann verwendet, um die Veränderungen in IKv in normalen H9c2-Zellen und 4-AP- oder AC-behandelten Zellen zu erkennen (Abbildung 1 und Abbildung 2).
1. Lösungsvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie das DMEM-Zellkulturmedium vor, das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin enthält (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>1,5 M 4-AP-Lösung werden durch Zugabe von 14,1165 mg 4-AP zu 100 μL DMSO-Lösung hergestellt (siehe Materialtabelle). 1,5 M 4-AP wird durch Zugabe der extrazellulären Lösung auf 1,5 mM verdünnt (Schritt 1.5).</li>
	<li>Bereiten Sie 400 mM AC vor, indem Sie 5 mg AC zu 19,36 μL DMSO-Lösung geben (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Alle oben genannten Lösungen wurden in einem 4 °C Kühlschrank gelagert, und die Endkonzentration des DMSO darf 0,1% (v/v) nicht überschreiten.</li>
	<li>50 ml intrazelluläre Lösung werden durch Zugabe von 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 gMgCl2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) und 0,1900 g EGTA (10,0 mM) in 50 ml doppelt destilliertes Wasser gegeben (siehe Tabelle 1 und Materialtabelle). HINWEIS: Der pH-Wert der intrazellulären Lösung wurde mit 1 M KOH auf 7,2 eingestellt und in kleine Volumina (1,5-2 ml) aliquotiert und bei −20 °C gelagert.</li>
	<li>50 ml extrazelluläre Lösung werden hergestellt, indem 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) und 0,0990 g D-Glucose (10,0 mM) in 50 ml doppelt destilliertes Wasser gegeben werden (siehe Tabelle 1 und Materialtabelle). HINWEIS: Die extrazelluläre Lösung muss für die sofortige Verwendung vorbereitet werden, und ihr pH-Wert muss mit 1 M NaOH auf 7,4 eingestellt werden.</li>
</ol>2. Zellkultur
<ol><li>Sobald die H9c2-Kulturschale zu 80% konfluiert ist, verdauen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin für 30 s.</li>
	<li>Kultur 2 x 10 5 Zellen/ml mit normalem Medium oder arzneimittelhaltigem Medium (25 μM, 50 μM, 100 μM und 200 μM AC) in einer 35 mm Schale mit Glasplatten für 24 h bei 37 °C, mit einer Atmosphäre von5 % CO2 und 70% bis 80% relativer Luftfeuchtigkeit (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>3. Herstellung von Mikropipetten
<ol><li>Schalten Sie den Mikropipettenzieher ein (siehe Materialtabelle) und heizen Sie 30 min vor.</li>
	<li>Legen Sie eine Borosilikatglaskapillare mit einem Filament (AD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm Länge) auf den Mikropipettenzieher. Wählen Sie das in Schritt 3.3 eingestellte Programm aus und klicken Sie in der Systemsteuerung auf Enter . Klicken Sie auf das Programm Rampe in der oberen rechten Ecke, um den "Wärme"-Wert der Glaskapillare zu bestimmen.</li>
	<li>Schreiben Sie das Programm zum Ziehen der Elektrode gemäß dem durch den "Rampen"-Test ermittelten Wert und führen Sie die folgenden Schritte aus: "Heat" -Wert = "Ramp" -Wert, Pull = 0, Vel = Zugstangenbewegungsgeschwindigkeit, Zeit = 200-250. Klicken Sie auf Pull , um mit der Herstellung der Pipetten zu beginnen. HINWEIS: Beachten Sie die Farbe der Trockenmittel im versiegelten Behälter des Mikropipettenziehers, bevor Sie ihn verwenden. Wenn sich die Farbe von blau nach rosa ändert, müssen die Trockenmittel ersetzt werden. Um eine Kontamination der Elektrodenspitze zu vermeiden, versuchen Sie, den mittleren Teil der Glaskapillare während der Pipettenvorbereitung nicht zu berühren. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die produzierten Pipetten und legen Sie sie in einen geschlossenen und verschlossenen Behälter.</li>
</ol>4. Geräteeinrichtung
<ol><li>Schalten Sie die entsprechenden Instrumente in der folgenden Reihenfolge ein: den Digital-Analog-Wandler, den Signalverstärker, den Mikromanipulator, das Mikroskop und die Kamera (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Öffnen Sie die Imaging-Anwendung, die Signalverstärker-Software und die Datenerfassungssoftware nacheinander (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Das Instrument muss nacheinander eingeschaltet werden. Andernfalls erscheint nach dem Öffnen der Software der Status "Demo Digitizer".</li>
</ol>5. IKv Parametereinstellung
<ol><li>Bearbeiten Sie das Protokoll für die Aufzeichnung des IKv, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Klicken Sie auf Bearbeiten und wählen Sie Protokoll bearbeiten in der Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Bearbeiten Sie das Programm in der "Wellenform"-Schnittstelle: Epoche A (Erster Pegel = −60 mV, Deltapegel = 0 mV, Erste Dauer = 20 ms und Deltadauer = 0 ms); Epoche B (Erste Stufe = −40 mV, Delta-Ebene = 10 mV, Erste Dauer = 150 ms und Delta-Dauer = 0 ms) und Epoche C (Erste Stufe = −60 mV, Delta-Ebene = 0 mV, Erste Dauer = 30 ms und Delta-Dauer = 0 ms).</li>
		<li>Klicken Sie dann auf die Schnittstelle Mode / Rate und legen Sie die Daten "Testhierarchie" fest: Testverzögerung = 0 s, Läufe = 1, Sweeps = 11 und Sweep-Dauer = 0,22 s22,23. HINWEIS: Erfassen Sie die IKv-Kanalströme durch Anwendung von 150 ms Depolarisationsschritten von -40 mV bis +60 mV mit einem Inkrement von 10 mV bei einem Haltepotential von -60 mV unter Kontrollbedingungen. Die Gesamtzeit des Protokolls muss größer sein als die im Programm "Wellenform" eingestellte Zeit.</li>
	</ol></li>
	<li>Bearbeiten Sie das P/N Leak Subtraction Programm: Klicken Sie auf Edit Protocol (Protokoll bearbeiten ), um die Schaltfläche Stimulus auszuwählen, und stellen Sie das Lecksubtraktionsprogramm im Dialogfeld P/N Leak Subtraction ein: Anzahl der Subsweeps = 2-8 (4 in dieser Studie), Einschwingzeit = 100-1.000 ms (200 in dieser Studie), "Polarität" = "Entgegengesetzt zur Wellenform", Haltepegel = −80 mV. HINWEIS: Die P/N-Lecksubtraktion muss einen niedrigeren Haltegrad als den "Ersten Halt" (−60 mV) aufweisen.</li>
</ol>6. Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufzeichnung des I Kv im Spannungsklemmmodus
<ol><li>Legen Sie den Datenspeicherpfad fest: Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Datendateinamen festlegen in der Datenerfassungssoftware. Öffnen Sie das etablierteI-Kv-Protokoll (Schritt 5.1), indem Sie Bearbeiten auswählen und in der Datenerfassungssoftware auf Protokoll öffnen klicken. Klicken Sie abschließend auf die Option Tools und wählen Sie Membrantest , um die Ausführung des Protokolls zu starten.</li>
	<li>Die extrazelluläre Lösung (Schritt 1.5) wird in das Zellbad auf dem Ganzzell-Patch-Clamp-Gerät gegeben (siehe Materialtabelle) und das Deckglas mit den H9c2-Zellen (kultiviert in Schritt 2.1) im Bad nach oben gelegt.</li>
	<li>Füllen Sie 30% der Pipette (hergestellt in Schritt 3) mit der extrazellulären Lösung und installieren Sie sie auf dem Aufzeichnungselektrodenhalter, der in die Patchklemmvorrichtung integriert ist. Ziehen Sie die Pipette mit der O-Ring-Gummidichtung und der Kunststoffscheibe fest. Dann lassen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in das Bad fallen. Klicken Sie auf die Pipetten-Offset-Schnittstelle der Signalverstärker-Software (siehe Materialtabelle), um die I-Kv-Strombasislinie bei 0 pA zu halten. HINWEIS: Die intrazelluläre Lösung (Schritt 1.4) muss in Kontakt mit dem AgCl/Ag-Teil des Silberdrahts sein, und der Silberdraht darf sich nicht in der Nähe der Innenwand der Pipette befinden. Der Widerstand der Pipette muss 2-6 MΩ betragen. Um das Verschließen der Pipettenspitze zu vermeiden, muss ein kontinuierlicher Überdruck an die Pipette unter Verwendung einer 1,0-ml-Spritze abgegeben werden, die über einen Kunststoffschlauch24 mit dem Aufzeichnungselektrodenhalter verbunden ist.</li>
	<li>Liefern Sie manuell einen geeigneten Überdruck mit einer 1,0-ml-Spritze, die über einen Kunststoffschlauch mit dem Aufzeichnungselektrodenhalter verbunden ist. Bewegen Sie die Pipette leicht, indem Sie den Mikromanipulator dreidimensional manipulieren, um die Zelle zu kontaktieren.</li>
	<li>Sobald die Rechteckwelle des Membrantests um 1/3 bis 1/2 abfällt, nachdem die Pipette die Zellmembran berührt hat, entfernen Sie den Überdruck und liefern Sie manuell einen entsprechenden Unterdruck. Klicken Sie dann auf die Patch-Schnittstelle der Datenerfassungssoftware, um das GΩ-Siegel zu bilden. Verwenden Sie die Signalverstärkersoftware "C p Fast" und "Cp Slow" während der Zellversiegelung, um die schnelle und langsame Kapazität zu kompensieren. HINWEIS: Wenn der Membrantest ≥1 GΩ beträgt, wird eine zellgebundene Konfiguration zwischen der Pipettenspitze und der Zelle gebildet.</li>
	<li>Wenden Sie kurze Unterdruckimpulse an, um einen Fleck der Zellmembran zu zerreißen. HINWEIS: Eine steile Verringerung des Membranwiderstands kennzeichnet ein erfolgreiches Ganzzellaufnahmemuster. Wenn der Zugangswiderstand(RA) ≥30 MΩ beträgt, müssen die Zellen für die Schritte 6.3-6.6 erneut ausgewählt werden. Um die Genauigkeit der aufgezeichnetenI-Kv-Daten zu gewährleisten, muss der Unterdruck entfernt werden, nachdem die Zellmembran gebrochen ist.</li>
	<li>Führen Sie die Kapazitätskompensation der Ganzzellenmembran durch, indem Sie auf die Schaltfläche Ganzzelle der Signalverstärkersoftware klicken. Speichern und zeichnen Sie abschließend die Daten auf, indem Sie auf die Schaltfläche Datenaufzeichnung klicken.</li>
	<li>Öffnen Sie die gespeicherten IKv-Daten mit der Datenanalysesoftware. Speichern Sie die Strom-Spannungs-Beziehungen (I−V): Klicken Sie auf Analysieren , um Statistik auszuwählen, um Folgendes zu tun: Wählen Sie den Bereich als Cousors 1,2 für die Datenanalyse; Klicken Sie auf die Schaltflächen Spitzenamplitude und Mittelwert , und klicken Sie dann auf OK , um die Daten auf der Seite Ergebnisse anzuzeigen. Kopieren Sie schließlich die Spalte der IKv-Mittelwertdaten zur weiteren Analyse in die Funktionszeichnungssoftware (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Speichern Sie die aktuellen Spuren des Repräsentanten IKv : Klicken Sie auf Bearbeiten , um Leiterbahnen übertragen auszuwählen. Wählen Sie dann die vollständige Ablaufverfolgung in der zu übertragenden Region aus. Klicken Sie anschließend auf Select in Trace Selection und wählen Sie IN 0 (pA) in Signale; Klicken Sie abschließend auf OK , um die Daten auf der Seite "Ergebnisse" anzuzeigen, und kopieren Sie die Gesamtdaten in die Funktionszeichensoftware, um die aktuellen Spuren zu zeichnen.</li>
	<li>Speichern Sie das IKv-Protokoll : Klicken Sie auf Bearbeiten , um Stimulus-Wellenformsignal erstellen auszuwählen, und wählen Sie OK. Wiederholen Sie dann Schritt 6.9, mit Ausnahme der Auswahl von A0 # 0 (mA) unter "Signale".</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik wird hauptsächlich verwendet, um die elektrische Aktivität und funktionelle Eigenschaften von Ionenkanälen auf der Zellmembran25 aufzuzeichnen und zu reflektieren. Gegenwärtig umfassen die Hauptaufzeichnungsverfahren der Patch-Clamp-Technik die Einkanalaufzeichnung und die Ganzzellenaufzeichnung26. Für den Ganzzellenmodus werden die Glasmikroelektrode und der Unterdruck verwendet, um eine hochohmige Abdichtung zwischen einem kle...

Ionenkanäle sind spezielle integrierte Proteine, die in die Lipiddoppelschicht der Zellmembran eingebettet sind. In Gegenwart von Aktivatoren bilden die Zentren solcher speziellen integrierten Proteine hochselektive hydrophile Poren, die Ionen geeigneter Größe und Ladung passiv transportieren1. Ionenkanäle sind die Grundlage der Zellerregbarkeit und Bioelektrizität und spielen eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten2. Das Herz versorgt andere Organe durch regelmäßige Kontraktionen mit Blut, die aus einem Erregungs-Kontraktions-gekoppelten Prozess resultieren, der durch Aktionspotentiale ausgelöstwird 3. Frühere Studien haben bestätigt, dass die Erzeugung von Aktionspotentialen in Kardiomyozyten durch die Änderung der intrazellulären Ionenkonzentration verursacht wird, und die Aktivierung und Inaktivierung von Na+, Ca2+ und K + Ionenkanälen in menschlichen Kardiomyozyten führt zur Bildung von Aktionspotentialen in einer bestimmten Sequenz 4,5,6. Gestörte spannungsabhängige Kalium (Kv) Kanalströme (IKv) können den normalen Herzrhythmus verändern und zu Arrhythmien führen, die eine der häufigsten Todesursachen sind. Daher ist die Erfassung des IKv entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von Medikamenten zur Behandlung lebensbedrohlicher Arrhythmien7.
Der Kv-Kanal ist ein wichtiger Bestandteil des Kaliumkanals. Die Koordinationsfunktion des Kv-Kanals spielt eine wichtige Rolle bei der elektrischen Aktivität und myokardialen Kontraktilität des Säugetierherzens 8,9,10. In Kardiomyozyten hängen Amplitude und Dauer der Aktionspotentiale von der Koleitung von nach außen gerichteten K+-Strömen durch mehrere Kv-Kanal-Subtypen11 ab. Die Regulation der Kv-Kanalfunktion ist sehr wichtig für die normale Repolarisation des kardialen Aktionspotentials. Schon die geringste Änderung der Kv-Leitfähigkeit wirkt sich stark auf die kardiale Repolarisation aus und erhöht die Möglichkeit einer Arrhythmie12,13.
Als grundlegende Methode in der zellulären elektrophysiologischen Forschung kann durch Anlegen eines Unterdrucks eine hochohmige Abdichtung zwischen einem kleinen Bereich der Zellmembran und einer Pipettenspitze für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung hergestellt werden. Durch den kontinuierlichen Unterdruck kommt die Zellmembran mit der Pipettenspitze in Kontakt und haftet an der Innenwand der Pipette. Der resultierende vollständige elektrische Schaltkreis ermöglicht es, jeden einzelnen Ionenkanalstrom über die Oberfläche der Zellmembran14 aufzuzeichnen. Diese Technik hat eine sehr hohe Empfindlichkeit für den Ionenkanalstrom der Zellmembran und kann verwendet werden, um Ströme in allen Ionenkanälen zu detektieren, und die Anwendungen sind extrem breit15. Darüber hinaus hat Patch-Clamp im Vergleich zur fluoreszierenden Markierung und radioaktiven Markierung eine höhere Autorität und Genauigkeit16. Gegenwärtig wird die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Komponenten der traditionellen chinesischen Medizin nachzuweisen, die auf Kv-Kanalströme17,18,19 wirken. Zum Beispiel verwendeten Wang et al. die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik und bestätigten, dass die effektive Komponente des Lotussamens die Hemmung des Kv4.3-Kanals erreichen könnte, indem sie die aktivierten Zustandskanäleblockiert 19. Aconitin (AC) ist einer der wirksamen und aktiven Inhaltsstoffe von Aconitum-Arten, wie Aconitum carmichaeli Debx und Aconitum pendulum Busch. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Überdosierungen von AC Arrhythmien und sogar Herzstillstand verursachen können20. Die Wechselwirkung zwischen AC- und spannungsabhängigen Ionenkanälen führt zur Störung der intrazellulären Ionenhomöostase, die der Schlüsselmechanismus der Kardiotoxizität ist21. Daher wird in dieser Studie die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Auswirkungen von AC auf das IKv von Kardiomyozyten zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>4-Aminopyridin</td><td>Sigma</td><td>MKCJ2184</td><td></td></tr><tr><td>Aconitin</td><td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td><td>DSTDW000602</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Axon Instrument</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Sartorius</td><td>124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>ATP Na2</td><td>Solarbio</td><td>416O022</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas mit Filament (AD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm Länge)&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>163225-5</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale (100 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale (35 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>3012022</td><td></td></tr><tr><td>Clampex software</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Version 10. 5</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit-Software</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Version 10. 6. 0. 13</td><td>Datenerfassungssoftware</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Rhawn</td><td>RH289133</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instrument</td><td>Axon digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (1x)</td><td>Gibco</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Biofroxx</td><td>EZ6789D115</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>Flammender/brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>Modell P-1000</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 Zellen</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0111</td><td></td></tr><tr><td>HCImageLive</td><td>Hamamatsu</td><td>4.5.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>2106081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020082501</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020112601</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td><td>20160408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2021020101</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas (20 & 20 mm)</td><td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td><td>80340-0630</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>Milli-Q IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B Commander</td><td>Axon Instrument</td><td>MultiClamp Commander 2.0</td><td>Signalverstärker-Software&nbsp;</td></tr><tr><td>OriginPro 8 Software</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>PH&nbsp; Meter&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>S201K</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25% (1x)</td><td>HyClone</td><td>J210045</td><td></td></tr></tbody></table>

spannungsabhängige kaliumstromaufzeichnung an h9c2-kardiomyozyten mittels ganzzell-patch-clamp-technik

Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

Kaliumkanäle auf der myokardialen Zellmembran spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der elektrophysiologischen Aktivitäten der Zellen. Als einer der wichtigsten Ionenkanäle sind spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (Kv) eng mit einigen schweren Herzerkrankungen wie medikamenteninduzierten Myokardschäden und Myokardinfarkt verbunden. In der vorliegenden Studie wurde die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Wirkungen von 1,5 mM 4-Aminopyridin (4-AP, ein Breitband-Kaliumkanalinhibitor) und Aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM und 200 μM) auf den Kv-Kanalstrom (IKv) in H9c2-Kardiomyozyten zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass 4-AP das I Kv um etwa 54% hemmte, während die hemmende Wirkung von AC auf das IKv einen dosisabhängigen Trend zeigte (keine Wirkung für 25 μM, 30% Hemmrate für 50 μM, 46% Hemmrate für 100 μM und 54% Hemmrate für 200 μM). Aufgrund der Eigenschaften einer höheren Empfindlichkeit und Präzision wird diese Technik die Erforschung der Kardiotoxizität und der pharmakologischen Wirkungen der Ethnomedizin auf Ionenkanäle fördern.

Dieses Protokoll ermöglichte die Aufzeichnung des IKv gemäß den Parametern, die in der Ganzzellen-Patch-Clamp-Technik eingestellt wurden. Das IKv wurde durch 150 ms depolarisierenden Pulsstimulus von −40 bis +60 mV bei einem Haltepotential von −60 mV ausgelöst (Abbildung 3A). Das IKv der H9c2-Kardiomyozyten der Ratte erschien zuerst um −20 mV, und dann nahm die Amplitude mit weiterer Depolarisation zu. Aus den gemessenen Stromamplituden wurde die mittlere Bez...

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Echtzeit- und dynamischen Erfassung von spannungsgesteuerten Kaliumkanalströmen (Kv) in H9c2-Kardiomyozyten unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik.

Spannungsabhängige Kaliumstromaufzeichnung an H9C2-Kardiomyozyten mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Technik

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Dieses Protokoll zeichnet erfolgreich die Auswirkungen des Aconitins auf das IKv von H9C2-Zellen auf. Förderung neuer Phasen zur Untersuchung des Mechanismus der Kardiotoxizität von Arzneimitteln aus der Perspektive von Ionenkanälen. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik ist der Goldstandard der Ionenkanalforschung mit hoher Empfindlichkeit, hoher Präzision und hoher Spezifität.Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik kann eingesetzt werden, um die pharmakologischen oder toxischen Mechanismen der Gegenüberstellung spezifischer Ionenkanäle für Multisystemerkrankungen wie Herz-Kreislauf-System und Nervensystem zu erforschen. Um zu beginnen, verdauen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin für 30 Sekunden, sobald die H9C2-Kulturschale 80% konfluent ist. Kultur 2 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter mit normalem Medium oder arzneimittelhaltigem Medium in einer 35-Millimeter-Schale, die mit Glasplatten ausgelegt ist, für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, mit einer Kohlendioxidatmosphäre von 5% und 70 bis 80% relativer Luftfeuchtigkeit.Schalten Sie den Mikropipettenzieher ein und heizen Sie ihn 30 Minuten vor. Dann legen Sie eine Borosilikatglaskapillare mit einem Filament auf den Mikropipettenzieher. Wählen Sie das Programm aus und klicken Sie in der Systemsteuerung auf Enter.Klicken Sie auf das Rampenprogramm in der oberen rechten Ecke, um den Heizwert der Glaskapillare zu bestimmen. Schreiben Sie das Programm zum Ziehen der Elektrode gemäß dem durch den Rampentest ermittelten Wert und klicken Sie auf Pull, um mit der Herstellung der Pipetten zu beginnen. Schalten Sie den digitalen Analogwandler, den Signalverstärker, den Mikromanipulator, das Mikroskop und die Kamera ein.Öffnen Sie die Imaging-Anwendung, die Signalverstärker-Software und die Datenerfassungssoftware nacheinander. Klicken Sie auf Erfassen und wählen Sie Protokoll bearbeiten in der Datenerfassungssoftware. Bearbeiten Sie das Programm in der Wellenformschnittstelle.Geben Sie Werte für die erste Ebene, die Delta-Ebene, die erste Dauer und die Delta-Dauer für Epoche A, Epoche B und Epoche C ein.Klicken Sie dann auf die Modus-Tarifschnittstelle und legen Sie die Testhierarchiedaten fest. Klicken Sie anschließend auf Protokoll bearbeiten, um die Stimulus-Schaltfläche auszuwählen und das Leck-Subtraktionsprogramm im PM-Leck-Subtraktionsdialog einzustellen. Um den Datenspeicherpfad einzurichten, klicken Sie auf Datei und wählen Sie Datendateinamen in der Datenerfassungssoftware festlegen.Öffnen Sie dann das etablierte lKv-Protokoll, indem Sie in der Datenerfassungssoftware Acquire auswählen und auf Open Protocol klicken. Klicken Sie abschließend auf die Option Tools und wählen Sie Membrantest, um die Ausführung des Protokolls zu starten. Die extrazelluläre Lösung wird in das Zellbad auf dem Ganzzellen-Patch-Clamp-Apparat gegeben und der Deckel mit den H9C2-Zellen im Bad nach oben gelegt.Füllen Sie 30% der Pipette mit der extrazellulären Lösung und installieren Sie sie auf dem in die Patchklemmvorrichtung integrierten Aufzeichnungselektrodenhalter. Ziehen Sie die Pipette mit dem Aufnahmeelektrodenhalter fest. Lassen Sie dann die Pipette mit dem Mikromanipulator in das Bad fallen.Klicken Sie auf die Pipettenoffset-Schnittstelle der Signalverstärkersoftware, um die lKv-Strombasislinie bei null Pikoampere zu halten. Liefern Sie manuell einen geeigneten Überdruck mit einer 1,0-Milliliter-Spritze, die mit dem Aufzeichnungselektrodenhalter verbunden ist, durch einen Kunststoffschlauch. Bewegen Sie die Pipette leicht, indem Sie den Mikromanipulator dreidimensional manipulieren, um die Zelle zu kontaktieren.Sobald die Rechteckwelle der Membrantests um ein Drittel bis zur Hälfte abfällt, nachdem die Pipette die Zellmembran berührt hat, entfernen Sie den Überdruck und liefern Sie manuell einen entsprechenden Unterdruck. Klicken Sie dann auf die Patch-Oberfläche der Datenerfassungssoftware, um das Gigaseal zu bilden. Verwenden Sie die Software für die Kapazitätskompensation schnell und die Kapazitätskompensation für langsame Signalverstärker während der Zelldecke, um die schnelle und langsame Kapazität zu kompensieren.Wenden Sie kurze Unterdruckimpulse an, um einen Fleck der Zellmembran zu zerreißen. Führen Sie die Kapazitätskompensation der Ganzzellenmembran aus, indem Sie auf die Ganzzellentaste der Signalverstärkersoftware klicken. Speichern und notieren Sie abschließend die Daten, indem Sie auf die Schaltfläche Datenaufzeichnung klicken.Öffnen Sie die gespeicherten lKv-Daten mit der Datenanalysesoftware. Speichern Sie die aktuellen Spannungsbeziehungen. Klicken Sie auf Analysieren, um Statistiken auszuwählen.Wählen Sie den Bereich als Cursor 1 2 für die Datenanalyse aus, klicken Sie auf die Schaltflächen Spitzenamplitude und Mittelwert und klicken Sie dann auf OK, um die Daten auf der Ergebnisseite anzuzeigen. Kopieren Sie schließlich die Spalte mit lKv-Mittelwertdaten zur weiteren Analyse in die Funktionszeichnungssoftware. Speichern Sie die repräsentativen lKv-Stromspuren.Klicken Sie auf Bearbeiten, um Übertragungsspuren auszuwählen, und wählen Sie dann die vollständige Ablaufverfolgung in der zu übertragenden Region aus. Klicken Sie anschließend auf Select in trace selection und wählen Sie IN 0 in Signalen. Klicken Sie abschließend auf OK, um die Daten auf der Ergebnisseite anzuzeigen, und kopieren Sie die Gesamtdaten in die Funktionszeichensoftware, um die aktuellen Spuren zu zeichnen.Speichern Sie das lKv-Protokoll. Klicken Sie auf Bearbeiten, um Stimulus-Wellenformsignal erstellen auszuwählen, und wählen Sie OK. Wiederholen Sie dann den Schritt zum Zeichnen von Stromspuren, ohne das Signal auszuwählen.Der lKv wurde durch 150 Millisekunden depolarisierenden Impulsreizes von minus 40 bis plus 60 Millivolt bei einem Haltepotential von minus 60 Millivolt ausgelöst. Der lKv der H9C2-Kardiomyozyten der Ratte erschien zuerst um minus 20 Millivolt, und dann nahm die Amplitude mit weiterer Depolarisation zu. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die lKv-Amplitude nach der fünfminütigen Behandlung mit 1,5 Millimolar 4-AP beobachtbar reduziert.Zusätzlich sank der lKv bei Membranpotentialen dosisabhängig nach der 24-stündigen AC-Behandlung signifikant von 10 bis 60 Millivolt. Die einzelne Zelle nach der Aufnahme des Ionenkanals kann für weitere Einzelzell-Omics-Beurteilungen verwendet werden, wie z.B. Einzelzellgenomik, Transkriptomik, Proteomik und die Metabolomik.

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