Name: Untersuchung der protektiven Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Erfahren Sie die protektive Wirkung von Platycodin D auf NAFLD in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell mit AML-12-Zellen. Diese Methode ermöglicht kosteneffiziente Arzneimittelforschung.

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Diese Arbeit wird durch Zuschüsse der Chongqing Science and Technology Commission (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 und jbky20210029) und der China Postdoctoral Science Foundation (Nr. 2021MD703919) unterstützt.

AML-12-Zellen (eine normale Hepatozyten-Zelllinie der Maus) werden für die zellbasierten Studien verwendet. Die Zellen werden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Vorbehandlung der AML-12-Zellen zur Modellierung der NAFLD in vitro
<ol><li>Halten Sie die Zellen in normalen Zellkulturmedien (DMEM plus Ham's F12 [1:1] mit 0,005 mg/ml Insulin, 5 ng/ml Selen, 0,005 mg/ml Transferrin, 40 ng/ml Dexamethason und 10 % fötalem Rinderserum [FBS], siehe Materialtabelle) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 auf.</li>
	<li>Säen Sie die Zellen in 12-Well-Platten (1 ml / Well) mit einer Dichte von 2,8 x 105 Zellen / Well. HINWEIS: Alle Zellverdauungs- und Medienaustauschvorgänge werden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium der Zellen nach der Inkubation über Nacht (~ 10 h) und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 1 ml serumfreiem Medium (pro Vertiefung).</li>
	<li>Teilen Sie die 12-Well-Zellplatte von links nach rechts in vier verschiedene Behandlungsgruppen auf, darunter (1) die Kontrollgruppe, (2) die mit Parkinson behandelte Gruppe, (3) die mit PA behandelte Gruppe und (4) die mit PA + PD behandelte Gruppe. HINWEIS: Drei Replikate jeder experimentellen Behandlungsgruppe sind von oben nach unten auf derselben 12-Well-Zellplatte angeordnet.</li>
	<li>Fügen Sie die normalen Zellkulturmedien (1 ml/Well) zur Kontrollgruppe und zur mit Parkinson behandelten Gruppe hinzu und fügen Sie die normalen Zellkulturmedien (1 ml/Well), die mit 300 μM PA ergänzt sind, zur PA-behandelten und PA + PD-behandelten Gruppe hinzu.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium der Zellen nach 24 Stunden Inkubation und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 1 ml serumfreiem Medium (pro Vertiefung).</li>
	<li>Fügen Sie der Kontrollgruppe normale Zellkulturmedien (1 ml/Well) hinzu, die mit einem Vehikel (Dimethylsulfoxid, DMSO, 0,1% v/v) ergänzt werden. Zugabe normaler Zellkulturmedien (1 ml/Well), die mit 1 μM PD ergänzt sind, zur PD-behandelten Gruppe; Zugabe normaler Zellkulturmedien (1 ml/Well), ergänzt mit 300 μM PA, zur PA-behandelten Gruppe; Fügen Sie der PA + PD-behandelten Gruppe normale Zellkulturmedien (1 ml/Well) hinzu, die mit 300 μM PA und 1 μM PD ergänzt wurden.</li>
	<li>Untersuchen Sie nach einer Inkubation von weiteren 24 Stunden die schützenden Wirkungen von Parkinson auf Zellen mittels 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-Färbung (Schritt 2), JC-1-Färbung (Schritt 3) und Western-Blot (Schritt 4). HINWEIS: Alle Inkubationsvorgänge werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 durchgeführt.</li>
</ol>2. Messung der Veränderung der ROS-Produktion
HINWEIS: Die intrazellulären ROS-Spiegel in den Zellen werden auf der Grundlage des DCFH-DA-Färbeassays bewertet.
<ol><li>Waschen Sie die Zellen am Ende des Behandlungszeitraums (Schritt 1.8) dreimal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro Vertiefung (1x PBS, pH 7,4) und färben Sie die Zellen dann mit 100 μl 10 μM DCFH-DA pro Vertiefung (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln. HINWEIS: Wenn nach 30 Minuten Inkubation keine offensichtliche grüne Fluoreszenz beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verlängert werden (30-60 Minuten). Wenn nach 30 min Inkubation eine Überbelichtung des grünen Fluoreszenzwertes beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verkürzt werden (15-30 min).</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS (1 ml/Well). Fügen Sie 1 ml 1x PBS zu jeder Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie dann ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen zu beobachten (Vergrößerung: 200-fach).</li>
	<li>Nehmen Sie drei repräsentative Fluoreszenzbilder (Vergrößerung: 200x) für jede Vertiefung am Fluoreszenzmikroskop auf, indem Sie den grünen Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm verwenden. HINWEIS: Der grüne Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm wird empfohlen, um den DCFH-DA zu detektieren. Zusätzlich kann DCFH-DA mit den Parametereinstellungen für GFP und FITC im Fluoreszenzmikroskop35,36 detektiert werden.</li>
	<li>Verarbeiten Sie schließlich die Bilder mit einer Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) und berechnen Sie dann mit der ImageJ-Software die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Gruppe oder die Verhältnisse der verschiedenen Gruppen. ANMERKUNG: Die technischen Details des Fluoreszenzmikroskops und der Bild-J-Software, die für die Bildgebungsarbeiten verwendet wurden, wurden zuvorbeschrieben 37,38.</li>
</ol>3. Messung der Änderung des mitochondrialen Membranpotentials
HINWEIS: Die Änderungen des mitochondrialen Membranpotentials werden durch den JC-1-Färbetest überwacht.
<ol><li>Waschen Sie die Zellen am Ende des Behandlungszeitraums (Schritt 1.8) dreimal mit 1 ml 1x PBS pro Vertiefung und färben Sie die Zellen dann mit 100 μl 5 μg/ml JC-1-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) 30 min lang bei 37 °C im Dunkeln. HINWEIS: Wenn nach 30 Minuten Inkubation keine offensichtliche grüne Fluoreszenz beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verlängert werden (30-60 Minuten). Wenn nach 30 min Inkubation eine Überbelichtung des grünen Fluoreszenzwertes beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verkürzt werden (15-30 min).</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS (1 ml/Well). Fügen Sie 1 ml 1x PBS zu jeder Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie dann ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen zu beobachten (Vergrößerung: 200-fach).</li>
	<li>Nehmen Sie drei repräsentative Fluoreszenzbilder (Vergrößerung: 200x) für jede Vertiefung am Fluoreszenzmikroskop auf, wobei Sie den grünen Fluoreszenzkanal mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 nm bzw. 535 nm und den roten Fluoreszenzkanal mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 550 nm bzw. 600 nm verwenden. HINWEIS: Der grüne Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm wird verwendet, um das JC-1-Monomer zu detektieren, das als depolarisierte Mitochondrien 39,40,41 behandelt wird, und der rote Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 550 nm und einer Emissionswellenlänge von 600 nm wird verwendet, um das JC-1-Dimer zu detektieren. die als polarisierte Mitochondrien 39,40,41 behandelt werden.</li>
	<li>Verarbeiten Sie schließlich die Bilder mit einer Bilderfassungssoftware und verwenden Sie dann die Software Image J, um die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Gruppe oder die Verhältnisse der verschiedenen Gruppen zu berechnen. ANMERKUNG: Die technischen Details des Fluoreszenzmikroskops und der Bild-J-Software, die für die Bildgebungsarbeiten verwendet wurden, wurden zuvorbeschrieben 37,38.</li>
</ol>4. Messung der Proteinexpressionsniveaus von LC3-II/LC3-I und p62/SQSTM1
<ol><li>Waschen Sie die Zellen nach der Behandlung (Schritt 1.8) dreimal mit 1x PBS (1 ml/Well), das auf 4 °C vorgekühlt wurde.</li>
	<li>RIPA-Lysepuffer (100 μl/Well), ergänzt mit Protease und einem Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (1x) (siehe Materialtabelle), auf die 12-Well-Platte geben und 5 Minuten lang auf Eis lysieren.</li>
	<li>Das Zelllysat wird in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und bei 12.000 x g 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Überstände nach der BCA-Methode gemäß den Standardverfahren42.</li>
	<li>Fügen Sie den Zelllysatüberständen einen SDS-PAGE-Probenladepuffer (5x, siehe Materialtabelle) hinzu (Volumenverhältnis = 1:4).</li>
	<li>Mischen Sie durch Vortexen (bei hoher Geschwindigkeit für ~ 15 s) und erhitzen Sie die gemischten Proben bei 100 °C für 5 Minuten, um das Protein zu denaturieren.</li>
	<li>Geben Sie das 12-fach gut vorbereitete 12%ige SDS-PAGE-Gel in den Elektrophoresetank und geben Sie dann den mit Reinstwasser verdünnten SDS-Up-Sample-Puffer (1x) bis zur Höhenbegrenzungsposition hinzu. HINWEIS: Das SDS-PAGE-Gel wird mit einem handelsüblichen Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.</li>
	<li>Geben Sie den Proteinmarker (5 μl/Well) und die Proben (20 μg/Well) in verschiedene Vertiefungen des SDS-PAGE-Gels.</li>
	<li>Stellen Sie den stabilen Spannungsmodus auf 100 V ein und führen Sie die Elektrophorese 80 Minuten lang durch.</li>
	<li>Führen Sie nach der SDS-PAGE-Elektrophorese den Elektrotransfer der Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (0,45 μM, siehe Materialtabelle) gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten43,44 durch.</li>
	<li>Nach dem Elektrotransfer der Proteine wird die PVDF-Membran mit 10 mL TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) zweimal (5 min/Zeit) in einem Shaker bei Raumtemperatur gewaschen.</li>
	<li>Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5 ml Rinderserumalbumin (BSA, 5%) in einem Schüttler bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	<li>Waschen Sie die PVDF-Membran dreimal (10 min/Zeit) mit 10 ml TBST. Anschließend wird die PVDF-Membran in 5 ml der spezifischen Primärantikörper inkubiert, die in Blockierungspuffer für LC3 (Maus-mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (im Folgenden als p62, Maus-mAb 1:2.000 bezeichnet) und β-Aktin (Maus-mAb, 1:2.000) (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C verdünnt sind.</li>
	<li>Waschen Sie die PVDF-Membran dreimal (10 min/Zeit) mit 10 ml TBST bei Raumtemperatur. Anschließend wird die PVDF-Membran mit einem Kaninchen-Anti-Maus-IgG (HRP)-Sekundärantikörper inkubiert, der in Blockpuffer (1:10.000) (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur verdünnt und 2 h lang vor Licht geschützt ist.</li>
	<li>Waschen Sie die PVDF-Membran dreimal (10 min/Zeit) mit 10 ml TBST bei Raumtemperatur. Legen Sie dann die PVDF-Membran auf die Plastikfolie, fügen Sie eine geeignete Menge ECL-Arbeitslösung (200 μl/Membran) hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation die ECL-Arbeitslösung und legen Sie die PVDF-Membran zur Bildentwicklung im Bildgebungssystem frei. Verwenden Sie schließlich die Image J-Software, um die Grauwerte der einzelnen Bänder zu analysieren. ANMERKUNG: Die technischen Details der Western-Blotting- und Image-J-Software, die für die Bildgebungsarbeiten verwendet wurden, wurden zuvorbeschrieben 45,46.</li>
</ol>5. Statistische Analyse
<ol><li>Präsentieren Sie die Daten aus den Experimenten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).</li>
	<li>Führen Sie die Signifikanzanalyse mit dem zuvor beschriebenen statistischen Softwaretool47 durch.</li>
	<li>Berechnen Sie die statistischen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen mit einem t-Test. Ein P-Wert unter 0,05 gilt als statistisch signifikant: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Studien haben die Tatsache hervorgehoben, dass NAFLD ein klinisch-pathologisches Syndrom ist, das von Fettleber bis NASH reicht und zu Leberzirrhose und Leberkrebs führen kann51. Eine fettreiche Ernährung und ein inaktiver Lebensstil sind typische Risikofaktoren für NAFLD. Sowohl nicht-medikamentöse Therapien als auch medikamentöse Therapien zur NAFLD-Behandlung wurden erforscht 51,52,53. Die Pathogenese ...

Platycodon grandiflorus (PG), die getrocknete Wurzel von Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., wird in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) verwendet. Es wird hauptsächlich in den nordöstlichen, nördlichen, östlichen, zentralen und südwestlichen Regionen Chinasproduziert 1. Zu den PG-Komponenten gehören Triterpenoid-Saponine, Polysaccharide, Flavonoide, Polyphenole, Polyethylenglykole, ätherische Öle und Mineralien2. PG hat eine lange Geschichte der Verwendung als Lebensmittel und Kräutermedizin in Asien. Traditionell wurde dieses Kraut zur Herstellung von Medikamenten gegen Lungenkrankheiten verwendet. Die moderne Pharmakologie liefert auch Hinweise auf die Wirksamkeit von PG bei der Behandlung anderer Krankheiten. Studien haben gezeigt, dass PG eine therapeutische Wirkung auf eine Vielzahl von medikamenteninduzierten Leberschädigungsmodellen hat. Die Nahrungsergänzung mit PG- oder Platycodin-Extrakten kann fettreiche, ernährungsbedingte Fettleibigkeit und die damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen lindern 3,4,5. Polysaccharide aus PG können zur Behandlung von akuten Leberschäden verwendet werden, die durch LPS/D-GalN bei Mäusen verursacht werden6. Darüber hinaus verbessern Saponine aus den Wurzeln von PG die fettreiche, diätinduzierte nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH)7. Darüber hinaus kann Platycodin D (PD), eine der wichtigsten therapeutischen Komponenten von PG, die Expression von Lipoproteinrezeptoren niedriger Dichte und die Aufnahme von Lipoproteinen niedriger Dichte in humanen hepatozellulären Karzinomzellen (HepG2) verbessern8. Darüber hinaus kann Parkinson auch Apoptose induzieren und Adhäsion, Migration und Invasion in HepG2-Zellen hemmen 9,10. Daher werden in dieser Studie Hepatoma-AML-12-Zellen der Maus für die In-vitro-Modellkonstruktion und zur weiteren Untersuchung der pharmakologischen Wirkungen und der zugrunde liegenden Mechanismen der Parkinson-Krankheit in diesem Modell verwendet.
Der Begriff nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) bezieht sich auf eine Gruppe von Lebererkrankungen, zu denen einfache Steatose, NASH, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinomgehören 11. Obwohl die Pathogenese der NAFLD von der klassischen "Two-Hit"-Theorie bis zur aktuellen "Multiple-Hit"-Theorie unvollständig verstanden ist, wird die Insulinresistenz als zentral für die Pathogenese der NAFLDangesehen 12,13,14. Studien haben gezeigt, dass eine Insulinresistenz in Hepatozyten zu einem erhöhten Anteil an freien Fettsäuren führen kann, die Triglyceride bilden, die sich in der Leber ablagern und dazu führen, dass die Leber fett wird15,16. Die Ansammlung von Fett kann zu Lipotoxizität, oxidativem Stress induzierter mitochondrialer Dysfunktion, endoplasmatischem Retikulumstress und entzündlicher Zytokinfreisetzung führen, was zur Pathogenese und Progression von NAFLD17,18 führt. Darüber hinaus spielt die Autophagie auch eine Rolle bei der Pathogenese der NAFLD, da sie an der Regulierung der zellulären Insulinsensitivität, des zellulären Fettstoffwechsels, der Hepatozytenschädigung und der angeborenen Immunität beteiligt ist 19,20,21.
Eine Vielzahl von Tiermodellen und zellulären Modellen wurde etabliert, um eine Grundlage für die Erforschung der Pathogenese und potenzieller therapeutischer Ziele von NAFLD22,23 zu schaffen. Einzeltiermodelle können jedoch nicht alle pathologischen Prozesse von NAFLD24 vollständig nachahmen. Individuelle Unterschiede zwischen Tieren führen zu unterschiedlichen pathologischen Merkmalen. Die Verwendung von Leberzelllinien oder primären Hepatozyten in In-vitro-Studien der NAFLD gewährleistet eine maximale Konsistenz unter den experimentellen Bedingungen. Eine Dysregulation des hepatischen Lipidstoffwechsels kann bei NAFLD25 zu einer höheren Akkumulation von Hepatozyten-Lipidtröpfchen führen. Freie Fettsäuren wie Ölsäure und Palmöl wurden im In-vitro-Modell verwendet, um NAFLD nachzuahmen, die durch eine fettreiche Ernährung verursacht wurde26,27. Die humane Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 wird häufig bei der Konstruktion von NAFLD-Modellen in vitro verwendet, aber als Tumorzelllinie unterscheidet sich der Metabolismus von HepG2-Zellen signifikant von dem von Leberzellen unter normalen physiologischen Bedingungen28. Daher ist die Verwendung von primären Hepatozyten oder primären Hepatozyten der Maus zur Konstruktion des In-vitro-NAFLD-Modells für das Wirkstoffscreening vorteilhafter als die Verwendung von Tumorzelllinien. Vergleicht man die synergistische Untersuchung von Arzneimittelwirkungen und therapeutischen Zielen sowohl in Tiermodellen als auch in vitro-Hepatozytenmodellen, so scheint es, dass die Verwendung von Maushepatozyten zur Konstruktion des In-vitro-NAFLD-Modells ein besseres Anwendungspotenzial hat.
Freie Fettsäuren, die in die Leber gelangen, werden zur Energiegewinnung oxidiert oder als Triglyceride gespeichert. Bezeichnenderweise weisen freie Fettsäuren eine gewisse Fettotoxizität auf und können zelluläre Funktionsstörungen und Apoptose induzieren12. Palmitinsäure (PA) ist die am häufigsten vorkommende gesättigte Fettsäure im menschlichen Plasma29. Wenn Zellen in nicht-adipösem Gewebe über einen längeren Zeitraum hohen Konzentrationen von PA ausgesetzt sind, stimuliert dies die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und verursacht oxidativen Stress, Lipidakkumulation und sogar Apoptose30. Daher verwenden viele Forscher PA als Induktor, um Leberzellen zur Produktion von ROS anzuregen und so das In-vitro-Modell der Fettlebererkrankung zu konstruieren und die schützende Wirkung bestimmter Wirkstoffe auf Zellen zu bewerten31,32,33,34. Diese Studie stellt ein Protokoll zur Untersuchung der protektiven Wirkungen von Parkinson auf ein Zellmodell von NAFLD vor, das durch PA induziert wird.

<table><tbody><tr><td>5% BSA-Blockierungspuffer</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>SW3015</td><td></td></tr><tr><td>AML12 (Alpha-Mausleber 12) Zelllinie</td><td>Procell Life Science& Technology Co., Ltd, China</td><td>AML12</td><td></td></tr><tr><td>Beyo ECL&nbsp; Plus</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Sicherheitswerkbank</td><td>Esco Micro Pte Ltd, Singapur</td><td>AC2-5S1 A2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus, Tokio, Japan</td> 1,8-Kultur-CO2-Inkubator <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Esco Micro Pte Ltd, Singapur</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>ST125</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; USA</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötaler</td><td>Rinderserum-Hyklone, Tauranga, Neuseeland</td><td>SH30406.05</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad software</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td><td>8.0</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziege Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>ABklonal, Wuhan, China</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobe PVDF-Transfermembran</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, Transferrin, Selenlösung, 100-fach;</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>C0341</td><td></td></tr><tr><td>MAP LC3&beta; Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>SC-376404</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit mit JC-1</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>M8650</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Inverses Mikroskop IX53</td><td>Olympus, Tokio, Japan</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>Palmitinsäure</td><td>Sigma, Deutschland</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x)</td><td>Hyclone,&nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; USA</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonyl&nbsp; Fluorid</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>ST506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Lösung</td><td>Hyklon &nbsp; Logan,&nbsp; UT,&nbsp; USA</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Platycodin D</td><td>Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China</td><td>CSA: 58479-68-8</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail für den allgemeinen Gebrauch, 100x</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>P1005</td><td></td></tr><tr><td>Protein Marker</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>PR1910</td><td></td></tr><tr><td>Reaktives Sauerstoffspezies Assay Kit</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>CA1410</td><td></td></tr><tr><td>RIPA&nbsp; Lyse&nbsp; Puffer</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>P0013E</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>P0012AC</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Probenladepuffer, 5x</td><td>Beyotime, Shanghai, China</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Zentrifuge</td><td>Sigma, Deutschland</td><td>3K15</td><td></td></tr><tr><td>SQSTM1/p62 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd</td><td>SC-28359</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH, Österreich</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>WB Transfer Buffer, 10x</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>D1060</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktin Maus mAb</td><td>ABclonal, Wuhan, China</td><td>AC004</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der protektiven wirkung von platycodin d auf die nicht-alkoholische fettlebererkrankung in einem palmitinsäure-induzierten in-vitro-modell

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Das Auftreten der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) hat weltweit alarmierend zugenommen. Platycodon grandiflorum wird häufig als traditionelle Ethnomedizin zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt und ist ein typisches funktionelles Lebensmittel, das in die tägliche Ernährung integriert werden kann. Studien deuten darauf hin, dass Platycodin D (PD), einer der Hauptwirkstoffe in Platycodon grandiflorum, eine hohe Bioverfügbarkeit aufweist und das Fortschreiten der NAFLD signifikant abschwächt, aber der zugrunde liegende Mechanismus ist noch unklar. Ziel dieser Studie ist es, die therapeutische Wirkung von Parkinson gegen NAFLD in vitro zu untersuchen. AML-12-Zellen wurden mit 300 μM Palmitinsäure (PA) für 24 h vorbehandelt, um NAFLD in vitro zu modellieren. Dann wurden die Zellen entweder mit Parkinson behandelt oder erhielten 24 Stunden lang keine Parkinson-Behandlung. Die Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels 2′,7′-Dichlor-Dihydro-Fluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Färbung analysiert, und das mitochondriale Membranpotential wurde durch die JC-1-Färbemethode bestimmt. Darüber hinaus wurden die Proteinexpressionsniveaus von LC3-II/LC3-I und p62/SQSTM1 in den Zelllysaten mittels Western Blot analysiert. Es wurde festgestellt, dass Parkinson die ROS- und Mitochondrienmembranpotentialspiegel in der PA-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert. Währenddessen erhöhte die Parkinson-Krankheit die LC3-II/LC3-I-Spiegel und senkte die p62/SQSTM1-Spiegel in der PA-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigten, dass Parkinson die NAFLD in vitro verbesserte, indem es oxidativen Stress reduzierte und die Autophagie stimulierte. Dieses In-vitro-Modell ist ein nützliches Werkzeug, um die Rolle von Parkinson bei NAFLD zu untersuchen.

Intrazelluläre ROS in den Zellen AML-12-Zellen wurden mit 300 μM PA für 24 h induziert und ein NAFLD-Zellmodell wurde etabliert. Anschließend wurden die Zellen 24 h lang mit Parkinson behandelt. Die Zellen wurden mit einer DCFH-DA-Fluoreszenzsonde markiert und die ROS-Produktion wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Ergebnisse der DCFH-DA-Färbung von intrazellulärem ROS in den Zellen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Parkinson ...

Dieses Protokoll untersucht die protektive Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell .

Untersuchung der protektiven Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Diese Methode demonstriert die Verwendung von AML-12-Zellen, die es ermöglichen, Modelle zu erstellen und die schützenden Wirkungen von Platycodin D auf NAFLD zu untersuchen. Die übermäßige Abhängigkeit von der Verwendung von Tiermodellen erhöht die Belastung durch die Entwicklung therapeutischer Arzneimittel. Die Verwendung von Zellmodellen in der frühen Phase der NAFLD-Arzneimittelentwicklung ist praktischer und kostengünstiger.Dieses TCM-Modell kann dazu beitragen, das Verständnis der biologischen Funktion von Platycodin D zu verbessern und die Verwendung anderer TCM zur Behandlung von NAFLD zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Aussaat eines Milliliters AML-12-Zellen pro Vertiefung in 12-Well-Platten. Teilen Sie dann die 12-Well-Platte in vier verschiedene Behandlungsgruppen auf und kennzeichnen Sie sie als Kontrollgruppe, PD-behandelt, PA-behandelt und PA plus PD-behandelte Gruppe.Fügen Sie der Kontroll- und der mit Parkinson behandelten Gruppe einen Milliliter des normalen Zellkulturmediums pro Vertiefung hinzu. Fügen Sie der mit PA behandelten und mit PA plus PD behandelten Gruppe einen Milliliter des normalen Zellkulturmediums hinzu, das mit 300 mikromolare Palmitinsäure ergänzt wurde. Entfernen Sie nach 24 Stunden Inkubation das Kulturmedium der Zellen und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit einem Milliliter serumfreiem Medium.Als nächstes fügen Sie der Kontrollgruppe einen Milliliter normales Zellkulturmedium hinzu, das mit einem Vehikel ergänzt wurde, und einen Milliliter normales Zellkulturmedium, das mit einem mikromolaren Platycodin D ergänzt wurde, zur mit Parkinson behandelten Gruppe. Fügen Sie der mit PA behandelten Gruppe einen Milliliter normales Zellkulturmedium hinzu, das mit 300 mikromolare Palmitinsäure ergänzt wurde, und einen Milliliter normales Zellkulturmedium, das mit 300 mikromolaren Palmitinsäure und einem mikromolaren Platycodin D ergänzt wurde, zu der mit PA plus PD behandelten Gruppe. Nachdem Sie die Zellen 24 Stunden lang behandelt haben, waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS pro Vertiefung.Färben Sie die Zellen dann mit 100 Mikrolitern 10 mikromolaren DCFH-DA pro Well. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit 1X PBS und geben Sie einen Milliliter 1X PBS in jede Vertiefung.Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen bei 200-facher Vergrößerung zu beobachten. Um das mitochondriale Membranpotential zu messen, waschen Sie die zuvor vorbereiteten behandelten Zellen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS pro Vertiefung. Dann färben Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern von fünf Mikrogramm pro Milliliter JC-1-Arbeitslösung und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln.Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit 1X PBS und geben Sie einen Milliliter 1X PBS in jede Vertiefung. Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen bei 200-facher Vergrößerung zu beobachten. Lysieren Sie die behandelten Zellen und sammeln Sie das Zelllysat in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie dann 5X SDS-PAGE Probenladepuffer in einem Volumenverhältnis von eins zu vier in den Zelllysatüberstand. Als nächstes geben Sie das vorbereitete 12%SDS-PAGE-Gel mit 12 Vertiefungen in den Elektrophoresetank und fügen 1X SDS bis zur empfohlenen Höhengrenze hinzu, verdünnt mit Reinstwasser.Führen Sie nach der SDS-PAGE-Elektrophorese den Elektrotransfer der Proteine auf eine 0,45 μm PVDF-Membran durch. Inkubieren Sie die Membran in fünf Millilitern der Primärantikörper, die in Blockierungspuffer verdünnt sind. Verwenden Sie Antikörper, die spezifisch für LC-III, p62 und Beta-Aktin sind.Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Dann inkubieren Sie die PVDF-Membran mit einem Kaninchen-Anti-Maus-LGG-HRP-Sekundärantikörper, der im Blockierungspuffer auf 10.000 verdünnt ist. Inkubieren Sie die Membran zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.Legen Sie die PVDF-Membran nach der Inkubation auf eine Plastikfolie. Fügen Sie eine angemessene Menge ECL-Arbeitslösung hinzu und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Entfernen Sie dann die ECL-Arbeitslösung und belichten Sie die PVDF-Membran im Bildgebungssystem zur Bildentwicklung.Die DCFH-DA-Färbung zeigte, dass Platycodin D den intrazellulären ROS-Spiegel in den ALM-12-Zellen signifikant reduzieren konnte, was darauf hindeutet, dass diese Behandlung den zellulären oxidativen Stress reduzieren kann. Darüber hinaus war die grüne Fluoreszenz, die JC-1-Monomere oder depolarisierte Mitochondrien darstellte, in den mit Palmitinsäure behandelten Zellen höher als in den unbehandelten Zellen, während die rote Fluoreszenz, die die JC-1-Dimere oder polarisierten Mitochondrien darstellte, in den mit Palmitinsäure behandelten Zellen niedriger war als in den unbehandelten Zellen, was auf eine Palmitinsäure-induzierte MMP-Depolarisation hinweist. Darüber hinaus nahm im Vergleich zur Modellgruppe das Verhältnis von JC-1-Monomeren zu Dimeren in der Platycodin-D-Behandlungsgruppe ab, was darauf hindeutet, dass es das Palmitinsäure-induzierte MMP verbessern könnte.Die Proteinexpressionsniveaus der Autophagie-verwandten Proteine LC-III und p62 wurden mittels Western Blot untersucht. Das Verhältnis von LC-32 zu LC-31 nahm signifikant ab und das Proteinexpressionsniveau von p62 stieg nach Behandlung mit Palmitinsäure an. Auf der anderen Seite reduzierte Platycodin D signifikant das Proteinexpressionsniveau von p62 und erhöhte das Verhältnis von LC-32 zu LC-31, was auf eine Wiederherstellung des durch Palmitinsäure induzierten autophagischen Flusses hinweist.Wenn der Fluoreszenzwert der Zellen in der Negativkontrollgruppe relativ hoch ist, können die Arbeitskonzentrationen der Fluoreszenzsonden nach Bedarf angepasst werden.

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