Name: Chromatin-Immunpräzipitation im Nesseltier-Modellsystem Exaiptasia diaphana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation für epigenetische Studien am Nesseltier-Modell Exaiptasia diaphana. Diese optimierte Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in symbiotischen Organismen.

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Gemäß dem obigen Protokoll wurde die gewonnene DNA erfolgreich für die ChIP-qPCR und ChIP-Seq verwendet. Das gleiche allgemeine Peakprofil für H3K4me3, das zuvor von anderen Organismen 26,27,28 berichtet wurde, wurde hier erhalten, mit dem höchsten Peak um das TSS und einer hohen Anreicherung an den erwarteten Stellen in der ChIP-qPCR. Die relativ hohe Anzahl von mehrfach kartierten Reads in den ChIP-Seq-Daten könnte durch PCR-Duplikate verursacht worden sein. Die Anzahl der eindeutig kartierten Reads könnte durch Änderungen am Protokoll zur Vorbereitung der DNA-Bibliothek erhöht werden, um PCR-Duplikate zu reduzieren. Es gibt mehrere Normalisierungsmethoden für ChIP-qPCR-Daten, wobei die hier vorgestellte Methode des prozentualen Anteils der Eingabe häufiger verwendet wird. Bei dieser Methode werden die IP- und Mock-Samples direkt auf die Eingabe normalisiert, mit dem Nachteil, dass die Eingabe während der ChIP anders verarbeitet wird als die IP- und Mock-Samples, was zu Fehlern führen kann. Die alternative Fold-Anreicherungsmethode normalisiert das Signal des IP basierend auf dem Signal des Mocks unter Verwendung der gleichen Primer-Sätze, wodurch ein Signal-über-Hintergrund-Verhältnis entsteht. Die Signalintensität der Mock-Stichprobe kann jedoch stark variieren, was wiederum große Auswirkungen auf die Daten hat. Eine ausführliche Diskussion der ChIP-qPCR und der Datennormalisierung findet sich in Haring et al.29.
Eine wesentliche Änderung der oben vorgestellten Methode im Vergleich zu gängigen ChIP-Protokollen ist die viel längere Vernetzungszeit, von etwa 15 Minuten für Histonproteine bis hin zu einer Inkubation über Nacht. Das Hauptziel dieser Anpassung ist es, das Eindringen des Fixiermittels Formaldehyd durch die Schleimschicht in das tiefere Gewebe von E. diaphana zu erleichtern, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen im Zellkern zu erhalten. Die Optimierung dieses Schritts ist entscheidend, um eine ausreichende Vernetzung zu gewährleisten, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten, ohne dass die Vernetzung durch Ultraschall so stark erfolgt, dass die Scherung des Chromatins durch Beschallung unwirksam wird. Die Zugabe von Reinigungsmitteln wie SDS kann auch die Beschallungseffizienz erhöhen29. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine lange Inkubation mit Formaldehyd den Homogenisierungsschritt erleichtert und zu einer feiner und gleichmäßiger gemahlenen Probe im Vergleich zu frischen oder gefrorenen Anemonen führte, die vor dem Vernetzungsschritt homogenisiert wurden. Die empfohlenen Bereiche der Fragmentlängen variieren zwischen 100 bp und 1.000 bp29,30 und können vom Zielprotein abhängen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass jeder Benutzer die Beschallungsbedingungen optimiert, um die gewünschte Fragmentlänge mit so wenig Beschallungsleistung wie möglich zu erreichen, da eine Überbeschallung die Proteine denaturieren und somit das IP31 beeinträchtigen kann. Eine weitere Einschränkung von ChIP ist die benötigte Materialmenge, die insbesondere relativ kleine Organismen wie Anemonen betrifft; Dieses Problem wurde behoben, indem der Probenverlust zwischen den Schritten reduziert wurde. Nach der Homogenisierung der Probe wurde sie sofort lysiert, wodurch mehrere übliche Schritte der Kernpräparation entfielen. Der Probenpool von 20 Anemonen enthielt im Allgemeinen genügend Chromatin für drei IPs und sowohl Mock- als auch Input-Kontrollen. Die Menge des Ausgangsmaterials (d.h. die Anzahl der Anemonen) könnte in Zukunft weiter reduziert werden, insbesondere bei einer ChIP mit nur einem Zielprotein. Je nach der beabsichtigten nachgelagerten Methode sollten die Kontrollen angepasst werden; für ChIP-qPCR sollte erwogen werden, zusätzliche Kontrollen29 einzuschließen, während für ChIP-seq der Mock zugunsten einer Eingabekontrolle weggelassen werden kann.
Obwohl die Antikörpervalidierung außerhalb des Rahmens dieses Protokolls liegt und daher hier nur kurz angesprochen wurde, ist sie ein kritischer Schritt vor der Durchführung von ChIP. Insbesondere bei der Verwendung kommerzieller Antikörper an wirbellosen Spezies kann die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern für die gewünschten Ziele eine Einschränkung darstellen. Im ersten Schritt wurde die H3-N-terminale Schwanzsequenz von E. diaphana und anderen Modellorganismen, einschließlich Zebrafischen und Mäusen, verglichen und für hoch konserviert befunden12. Die Antikörperspezifität wurde dann mittels Immunfluoreszenz getestet, bei der die Signale der Nukleinsäure und des Antikörpers kolokalisiert wurden. Das aus den Sequenzierungsdaten gewonnene Peak-Profil von H3K4me3 um das TSS gibt weitere Sicherheit hinsichtlich der Spezifität des Antikörpers.
Eine weitere Überlegung in Bezug auf die Antikörperspezifität ist die Möglichkeit einer Wechselwirkung mit den symbiotischen Dinoflagellaten, die E. diaphana sowie viele andere Anthozoen in ihren Zellen beherbergen. Transkriptomanalysen in Dinoflagellaten der Gattungen Lingulodinium32 und Symbiodinium33 haben histonkodierende Gene gefunden, darunter Kernhiston H3 und mehrere H3-Varianten bei niedrigen Expressionsniveaus, und das Ausmaß der funktionellen Konservierung des Histoncodes ist unklar34. Marinov und Lynch34 verglichen die Sequenzkonservierung von N-terminalen Schwänzen der H3-Variante innerhalb und zwischen Dinoflagellaten-Arten, und Symbiodiniaceae-Arten zeigten eine hohe Divergenz um Lysin 4 in der Schwanzsequenz, insbesondere wenn man die Kongruenz benachbarter Aminosäuren zu Lysin 4 als Faktor berücksichtigt. Es wurde auch gezeigt, dass sich diese Region von anderen Modellarten wie Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster und Saccharomyces cerevisiae unterscheidet, die mit der Sequenz von E. diaphanaübereinstimmen 12. Daher ist das Risiko einer unbeabsichtigten Wechselwirkung des Antikörpers gegen H3K4me3 mit dem Dinoflagellaten H3 gering. Darüber hinaus sind die Sequenzen nur auf das Genom von E. diaphana ausgerichtet, und die qPCR-Primer sollten spezifisch für E. diapana-Sequenzen sein, um eine zusätzliche Filtrationsschicht für unbeabsichtigt ausgefällte Sequenzen zu bieten.
Das vorgestellte ChIP-Protokoll liefert ausreichend DNA für die qPCR sowie für die Sequenzierung der nächsten Generation, und obwohl wahrscheinlich eine individuelle Optimierung durch jeden Benutzer erforderlich sein wird, bietet es einen Ausgangspunkt für die verstärkte Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in benthischen Nesseltieren, möglicherweise im Zusammenhang mit Symbiose und Umweltveränderungen.

Der Bericht des Weltklimarats (IPCC) aus dem Jahr 2022 hebt hervor, dass trotz wachsender Sensibilisierung und Bemühungen zur Eindämmung des Klimawandels immer intensivere und häufigere Hitzewellen im Meer die Korallenriffe einem hohen Risiko für großflächige Bleiche und Massensterben in den nächsten Jahrzehnten aussetzen1. Um die Bemühungen zum Schutz und zur Wiederherstellung von Korallenriffen zu unterstützen, werden die aktuellen und prognostizierten Auswirkungen sich ändernder Umweltbedingungen auf benthische Nesseltiere auf mehreren biologischen Ebenen untersucht, um die zugrunde liegenden Mechanismen von Reaktion und Resilienzzu verstehen 2.
Die Verfügbarkeit von Untersuchungsinstrumenten, die auf benthische Nesseltiere anwendbar sind, ist von entscheidender Bedeutung, um dieser Herausforderung zu begegnen, und die Entwicklung dieser Werkzeuge erfordert aktive Anstrengungen zur Weitergabe von Wissen und Technologien, die in anderen Bereichen etabliert wurden, auf Meeresorganismen3. Die Hürden bei der Arbeit mit vielen Korallenarten werden teilweise durch den Einsatz von Modellsystemen wie der Seeanemone Exaiptasia diaphana (allgemein als Aiptasia bezeichnet)4 abgebaut. Diese schnellwüchsigen, fakultativ symbiotischen Seeanemonen sind unter Laborbedingungen relativ einfach zu halten, vermehren sich sowohl sexuell als auch asexuell und es fehlt das Kalziumkarbonat-Skelett5. Das frei zugängliche Referenzgenom5 von E. diaphana ermöglicht den Einsatz epigenetischer Methoden, die eine Sequenzierung erfordern. Merkmale wie ein hoher Wassergehalt, eine Schleimproduktion und geringe Gewebemengen pro Individuum stellen jedoch eine Herausforderung für die Etablierung replizierbarer Protokolle dar, wodurch die epigenetische Forschung an E. diaphana und anderen Nesseltieren mit ähnlichen Merkmalen eingedämmt wird.
Epigenetische Modifikationen können den Phänotyp verändern, ohne die genomische Nukleotidsequenz eines Organismus zu verändern, indem sie Chromatin-assoziierte Prozesse regulieren6. Die epigenetische Regulation von Nesseltieren wird hauptsächlich im Kontext der Evolutionsgeschichte und -entwicklung 7,8,9,10, der Etablierung und Aufrechterhaltung von Symbiosen 11,12,13 und der Reaktion auf Umweltveränderungen14,15 untersucht.. Insbesondere wurden Variationen in den Mustern der DNA-Methylierung, die in den meisten Fällen die Hinzufügung einer Methylgruppe zu einer Cytosinbase beinhalten, als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen wie die Erwärmung13 und die Versauerung der Ozeane16 beobachtet. Es wurde auch gezeigt, dass DNA-Methylierungsmuster intergenerationell vererbbar sind, was die Rolle der Epigenetik bei der Akklimatisierung von Korallen an Umweltstressoren unterstreicht17. Im Vergleich zur DNA-Methylierung gab es relativ wenige Studien zu anderen wichtigen epigenetischen Regulatoren, wie z. B. nicht-kodierenden RNAs 11,18,19, Transkriptionsfaktoren 9,10 oder posttranslationalen Histonmodifikationen (PTMs) bei Nesseltieren20. Die Untersuchung von DNA-assoziierten Proteinen ist besonders anspruchsvoll, da die verfügbaren Methoden den Zugang zu einem Referenzgenom des Studienorganismus erfordern und aufgrund der großen Stichprobengrößen und der benötigten Antikörper mit hoher Spezifität teuer sind3. Mit einer Vielzahl chemischer Gruppen, die PTMs an spezifischen Histonresten bilden, bleibt das Verständnis der Chromatinmodifikationslandschaften bei Nesseltieren, insbesondere im Zusammenhang mit drohenden Umweltbelastungen, eine große Herausforderung.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Untersuchung von Histon-PTMs, Histonvarianten und anderen Chromatin-assoziierten Proteinen bei Nesseltieren voranzutreiben, indem ein optimiertes Chromatin-Immunpräzipitationsprotokoll (ChIP) für das Korallenmodell E. diaphana vorgestellt wird (Originalprotokoll von Bodega et al.21). ChIP kann mit quantitativer PCR kombiniert werden, um locusspezifische Protein-DNA-Interaktionen zu charakterisieren, oder mit Next-Generation-Sequencing (NGS), um diese Interaktionen über das gesamte Genom hinweg abzubilden. Im Allgemeinen werden Proteine und DNA reversibel vernetzt, so dass das Protein of Interest (POI) an denselben Locus gebunden bleibt, mit dem es in vivo assoziiert ist. Während die im Säugetiermodellsystem weit verbreitete Vernetzungsmethode in der Regel bei Raumtemperatur auf 15 Minuten oder darunter gehalten wird, wurde der Vernetzungsansatz optimiert, damit das Formaldehyd den von E. diaphana produzierten Schleim effektiver durchdringen kann. Das Gewebe wird dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren, homogenisiert und lysiert, um die Zellkerne aus den Zellen zu extrahieren. Der Materialverlust in diesen Schritten wird vermieden, indem nur ein Lysepuffer verwendet wird und dann direkt zur Beschallung übergegangen wird, bei der das Chromatin in ~300 bp lange Fragmente fragmentiert wird. Diese Fragmente werden mit einem für den POI spezifischen Antikörper bis auf PTM-Niveau inkubiert. Der Antikörper-Protein-DNA-Immunkomplex wird mit Hilfe von magnetischen Beads gefällt, die an die primären Antikörper binden und dabei nur die DNA-Abschnitte auswählen, die mit dem POI assoziiert sind. Nach der Cross-Link-Umkehr und der Reinigung des Niederschlags können die gewonnenen DNA-Segmente für die qPCR oder den Aufbau einer DNA-Bibliothek für die Sequenzierung verwendet werden, um die Segmente auf ein Referenzgenom abzubilden und so die Loci zu identifizieren, mit denen der POI assoziiert ist. Weitere Einzelheiten zu den Überlegungen für die einzelnen Schritte finden Sie in Jordán-Pla und Visa22.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd Lösung (w/v), Methanolfrei</td><td>Thermo scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock Röhrchen</td><td>Quantabio</td><td>2302820</td><td>Phase Lock Gel - leichte</td></tr><tr><td>AGANI Nadel 25 G</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie</td><td></td><td></td><td>Open Source, erhältlich von https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td><td>Sonicator&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Mit Rotoren für 15 mL und 1,5 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>ChIP-Grade Antikörper (hier polyklonaler H3K4me3 Antikörper)</td><td>Diagenode</td><td>C15410003</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA-freier Proteasehemmer Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>2 Tabletten/mL Wasser für 100x Vorrat</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>vwr</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>Einwegspatel</td><td>vwr</td><td>80081-188</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigungskit (hier QIAGEN QIAquick PCR-Aufreinigungskit)</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Gewebemühle</td><td>Wheaton</td><td></td><td>fester Stößel</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x</td><td>gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresesystem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FASTQC v0.11.9</td><td></td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Dokumentationssystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td>Gel Imaging</td></tr><tr><td>System Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Tuberkulin-Spritze 1 mL</td><td>B. Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Lineares Acrylamid (5 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td>mit geringer Retention</tr><tr><td>Magnetisches Trenngestell</td><td></td><td></td><td>für 1,5-ml-Röhrchen</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS)</td><td></td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>Mörser und Stößel, Porzellan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c Spektralphotometer</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61739</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol Gemisch (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (20 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Purple Loading Farbstoff 6x</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase Cocktail Enzymmischung</td><td>Invitrogen</td><td>AM2286</td><td>RNase A = 500 U/ml, RNase T1 = 20000 U/ml</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TAE Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Gefahr: kann Krebs erzeugen. Im Verdacht, die Fruchtbarkeit oder das ungeborene Kind zu schädigen</td></tr><tr><td>Schlauchrotator SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Lösung, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin-immunpräzipitation im nesseltier-modellsystem exaiptasia diaphana

Chromatin Immunoprecipitation in the Cnidarian Model System Exaiptasia diaphana

Posttranslationale Histonmodifikationen (PTMs) und andere epigenetische Modifikationen regulieren die Zugänglichkeit von Genen zum Transkriptionsapparat und beeinflussen so die Fähigkeit eines Organismus, auf Umweltreize zu reagieren. Die Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird häufig eingesetzt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in den Bereichen Epigenetik und Genregulation zu identifizieren und zu kartieren. Das Gebiet der Nesseltier-Epigenetik wird jedoch durch einen Mangel an anwendbaren Protokollen behindert, was zum Teil auf die einzigartigen Eigenschaften von Modellorganismen wie der symbiotischen Seeanemone Exaiptasia diaphana zurückzuführen ist, deren hoher Wassergehalt und Schleimmengen molekulare Methoden behindern. Hier wird ein spezialisiertes ChIP-Verfahren vorgestellt, das die Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen bei der Genregulation von E. diaphana ermöglicht. Die Vernetzungs- und Chromatinextraktionsschritte wurden für eine effiziente Immunpräzipitation optimiert und anschließend durch die Durchführung von ChIP mit einem Antikörper gegen die Histonmarkierung H3K4me3 validiert. Anschließend wurde die Spezifität und Wirksamkeit des ChIP-Assays durch Messung der relativen Belegung von H3K4me3 um mehrere konstitutiv aktivierte Genorte mittels quantitativer PCR und durch Next-Generation-Sequencing für die genomweite Analyse bestätigt. Dieses optimierte ChIP-Protokoll für die symbiotische Seeanemone E. diaphana ermöglicht die Untersuchung der Protein-DNA-Wechselwirkungen, die an der Reaktion von Organismen auf Umweltveränderungen beteiligt sind, die symbiotische Nesseltiere, wie z.B. Korallen, betreffen.

Gemäß dem obigen Protokoll wurde DNA, die mit der Trimethylierung von Histon-3-Lysin-4 (H3K4me3) assoziiert ist, immunpräzipitiert. Der Antikörper in ChIP-seq-Qualität wurde zuvor bei der Seeanemone Nematostella vectensis7 eingesetzt und hier durch die Immunfluoreszenzfärbung von E . diaphana-Gewebeschnitten validiert (Abbildung 3). Die DNA-Ausbeute hängt zwar von der Menge des Einsatzmaterials ab, lag aber regelmäßig bei etwa 100 ng/μL. Die gewonnenen DNA-Fragmente wurden mittels Sequenzierung und qPCR analysiert (Primerliste in Supplementary File 1).
Eine Sequenzierungstiefe von 40 Millionen Reads ergab ~17,6 Millionen einzigartig kartierte Reads. Nach Qualitätskontrollen wurden die Roh-Reads getrimmt und mit Hilfe von Bowtie24 auf das Genom von E. diaphana abgebildet (siehe Materialtabelle). Die modellbasierte Analyse der ChIP-Seq-Daten mit MACS (siehe Table of Materials) identifizierte insgesamt 19.107 Peaks25. Wie für H3K4me3 erwartet, befanden sich die meisten Peaks in der Nähe der transkriptionellen Startstelle (TSS), und die Häufigkeit der Peakzählung nahm auf beiden Seiten des TSS, insbesondere aber in Richtung des Genkörpers, stark ab (Abbildung 4).
Aus den Sequenzierungsdaten wurden drei Gene mit hohen Peaks um ihre TSS identifiziert, und qPCR-Primer wurden so konzipiert, dass sie auf mehrere Loci mit hohen Peaks innerhalb dieser Gene abzielen. Die qPCR-Daten wurden mit der Percentage-of-Input-Methode normalisiert (Abbildung 5). Es wurde eine hohe Anreicherung von H3K4me3 im Vergleich zu den Eingabe- und Mock-Steuerelementen beobachtet. Der prozentuale Anteil des Inputs schwankte zwischen 2,7 % und 10,7 %, wobei Unterschiede in der Anreicherung zwischen Genen und zwischen verschiedenen Loci innerhalb desselben Gens beobachtet wurden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Immunfluoreszenzfärbung von H3K4me3. Ein Gewebeschnitt von E. diaphana wurde mit (A) blauer Hoechst-Nukleinsäurefärbung und (B) einem gelben Fluorophor-markierten Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper gegen H3K4me3 gefärbt. (C) Eine Überlappung von A und B , die eine Kolokalisation im Zellkern zeigt. Maßstabsleiste = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Hohe Peak-Zählfrequenz um die transkriptionelle Startstelle. Die Verteilung der Peak-Zählfrequenz der H3K4me3-Modifikation über stromaufwärts (-) und stromabwärts (+) 2.000 bp um die transkriptionelle Startstelle (TSS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig05.jpg"> Abbildung 5: H3K4me3 ChIP-qPCR bei Exaiptasia diaphana. Die Ergebnisse werden in Prozent (%) der Eingabe dargestellt. Für die ChIP-qPCR wurden Loci in der Nähe der transkriptionellen Startstelle der jeweiligen Gene (AIPGENE12312, AIPGENE26042 und AIPGENE5950) ausgewählt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung zwischen den Replikaten an, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: Liste der für die qPCR verwendeten Primer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/ChIP_JoVE_SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Es wird ein Chromatin-Immunpräzipitationsassay (X-ChIP) gegen die Histonmarkierung H3K4me3 für den Modellorganismus Exaiptasia diaphana vorgestellt. Die Spezifität und Wirksamkeit des Assays werden durch quantitative PCR und Next-Generation-Sequencing bestätigt. Dieses Protokoll ermöglicht die verstärkte Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der Seeanemone E. diaphana.

Chromatin-Immunpräzipitation im Nesseltier-Modellsystem Exaiptasia diaphana

Histone post-translational modifications (PTMs) and other epigenetic modifications regulate the chromatin accessibility of genes to the transcriptional ...

Die Etablierung eines ChIP-seq-Protokolls in Aiptasia ist der erste Schritt zur Untersuchung der epigenetischen Orientierungspunkte bei symbiotischen Nesseltieren und wie diese die Interaktion eines Organismus mit seiner Umwelt regulieren können. Das Protokoll ist optimiert, um herausfordernde Nesseltiermerkmale wie eine hohe Schleimproduktion und ein hohes Wasser-Gewebe-Verhältnis zu berücksichtigen, indem die Vernetzungszeit erhöht und der Gewebeverlust minimiert wird. Sammeln Sie die Anemonen in einem 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie am Boden des Röhrchens absetzen.Alternativ können Sie sie in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur einige Sekunden lang auf 3.500 g schleudern. Entfernen Sie dann das überschüssige Meerwasser mit einer Vakuumpumpe. Waschen Sie die Anemonen, indem Sie sie in DPBS aufhängen.Und entfernen Sie das DPBS nach dem Waschen. Übertragen Sie die Anemonen mit einer Pinzette oder einem Plastikspatel ohne den überflüssigen Puffer in den 0,5%-Vernetzungspuffer. Inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf einem Rotator bei einer Geschwindigkeit von 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius.Entfernen Sie nach der Inkubation den 0,5%igen Vernetzungspuffer aus dem Röhrchen mit den Anemonen. Füllen Sie die Tube mit dem 1%-Vernetzungspuffer auf. Und inkubieren Sie es über Nacht auf einem Rotator bei 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius.Am nächsten Tag nach Entfernen des 1%-Vernetzungspuffers die Vernetzungsreaktion abschrecken, indem die Anemonen im Quenchpuffer suspendiert und die Suspension auf einem Rotator 20 Minuten lang bei 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius inkubiert wird. Entfernen Sie dann den Quenching-Puffer und waschen Sie die Anemonen zweimal in DPBS. Dekantieren Sie den DPBS.Und leeren Sie die Anemonen auf ein Papiertaschentuch, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Gießen Sie etwas flüssigen Stickstoff in den Mörser und übertragen Sie die Anemonen mit einer Pinzette. Beginnen Sie mit dem Stößel damit, das Gewebe vorsichtig aufzubrechen.Füllen Sie bei Bedarf immer wieder flüssigen Stickstoff nach, um ein Auftauen zu verhindern. Mahlen Sie weiter, bis die Probe zu einem feinen Pulver wird. Entnehmen Sie die Probe mit einem Spatel und überführen Sie sie in den Lysepuffer, wobei Sie sicherstellen, dass sich die Probe im Puffer auflöst.Lassen Sie die Probe eine Minute lang auf Eis ruhen, bevor Sie sie durch Inversion mischen. Nachdem Sie eine Dounce-Gewebemühle mit Lysepuffer gewaschen haben, übertragen Sie die Probe und tupfen Sie sie 20 bis 30 Mal mit einem festen Stößel aus. Übertragen Sie die Probe zurück in das Röhrchen.Und inkubieren Sie es über Nacht auf einem Rotator bei 14 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius. Legen Sie die Probe mit der Nadel einen Zentimeter über dem Boden des Röhrchens in den Sonciator und berühren Sie nicht die Wände. Starten Sie den Sonciator und stellen Sie sicher, dass in der Probe kein Schaum entsteht.Erhöhen Sie die Ausgangsleistung langsam auf zwei und beschallen Sie weitere zwei Minuten. Schalten Sie danach den Sonciator aus, stellen Sie die Ausgangsleistung wieder auf Null und lassen Sie die Probe zwei Minuten ruhen und abkühlen. Abhängig vom Probenvolumen und der Anzahl der geplanten Immunpräzipitationen (IPs) erhöhen Sie das Gesamtprobenvolumen, indem Sie 10 % Triton X-100 und 100X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) zu Endkonzentrationen von 1 % bzw. 1X hinzufügen.Übertragen Sie das Volumen für jede IP in ein separates 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Retention für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR oder qPCR. Geben Sie das entsprechende Volumen der Probe in ein weiteres 1,5-Milliliter-Röhrchen als Scheinkontrolle. Nehmen Sie 10% der Lautstärke der IPs als Eingangsregler und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.Fügen Sie vier Mikrogramm Antikörper Histon-3-Lysin-4-Trimethylierung oder H3K4-Trimethylierung zu jedem IP hinzu, jedoch nicht zum Mock. Inkubieren Sie die IP-Reaktionen und den Mock über Nacht auf dem Röhrenrotator bei 12 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius. Schneide die Spitze einer Pipettenspitze ab, um ihren Durchmesser zu vergrößern.Und übertragen Sie 50 Mikroliter magnetische Kügelchen in separate Röhrchen, ein Röhrchen pro IP und eines für den Mock. Geben Sie einen Milliliter Verstopfungslösung in jedes Röhrchen. Und inkubieren Sie sie wie zuvor 30 Minuten lang auf einem Rotator.Entfernen und entsorgen Sie mit einer Pipette den Überstand der Blockierungslösung und spülen Sie die Kügelchen mit der IP- oder Scheinreaktion von der Wand. Geben Sie die Mischung zurück in die entsprechenden Röhrchen mit geringer Retention, die die Proben enthalten. Inkubieren Sie alle Röhrchen wie zuvor drei Stunden lang.Platzieren Sie nach der Inkubation die IPs und das Mock auf dem Magnetgestell und warten Sie etwa 10 bis 20 Sekunden, bis sich die Magnete getrennt haben. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer mit wenig Salz hinzu. Nachdem Sie die Röhrchen wie zuvor fünf Minuten lang inkubiert haben, legen Sie sie wieder auf das Magnetgestell.Entfernen Sie den salzarmen Waschpuffer. Fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer mit hohem Salzgehalt hinzu und inkubieren Sie weitere fünf Minuten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie ihn mit einem Milliliter TE-Salzpuffer.Wiederholen Sie den Waschgang noch einmal und spülen Sie alle Perlen aus dem Tubendeckel aus. Nach dem Verwerfen der zweiten TE-Salzpufferwäsche fügen Sie jeder Reaktion 210 Mikroliter Elutionspuffer hinzu. Suspendieren Sie die magnetischen Kügelchen und eluieren Sie bei 65 Grad Celsius und schütteln Sie 15 Minuten lang mit 700 Umdrehungen pro Minute.Legen Sie die Reaktionen auf das Magnetgestell, sammeln Sie das Eluent und geben Sie es in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie als Nächstes den Eingang aus dem Gefrierschrank und fügen Sie Elutionspuffer zu einem Gesamtvolumen von 420 Mikrolitern hinzu. Vernetzen Sie alle Eluenten und den Input, indem Sie sie über Nacht bei 65 Grad Celsius und 700 Umdrehungen pro Minute inkubieren.Für den RNA-Verdau 10 Mikroliter RNase Cocktail hinzufügen und 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius und 700 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Für die Proteinverdauung fügen Sie acht Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius und 700 Umdrehungen pro Minute. Geben Sie unter einem Abzug eine Probe und das gleiche Volumen eines Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches in jedes Phasenschloss-Gelröhrchen.Schütteln Sie die Röhren kräftig und wirbeln Sie sie kurz, bis sie eine schaumige weiße Schicht bilden. 10 Minuten bei vier Grad Celsius und 20.000 g schleudern. Prüfen Sie, ob die wässrige Phase klar ist.Die wässrige Phase mit einer Pipette in ein frisches Röhrchen überführen. Fügen Sie 100 % Ethanol hinzu, was dem Doppelten des Probenvolumens entspricht, und schütteln Sie. Inkubieren Sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius oder 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius.Pelletieren Sie die DNA, indem Sie die Proben 30 Minuten lang bei 15.000 g drehen. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie die Pellets mit einem Milliliter 70%igem Ethanol. Schleudern Sie fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius.Dekantieren Sie vorsichtig, bevor Sie das gesamte Ethanol durch Pipettieren entfernen. Resuspendieren Sie die Pellets in 30 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Die Trimethylierung der DNA, die mit der Trimethylierung von Histon 3 Lysin 4 oder H3K4 assoziiert ist, wurde immunpräzipitiert, und die Gewebeschnitte von E.diaphana wurden durch Immunfluoreszenzfärbung gefärbt.Die gewonnenen DNA-Fragmente wurden mittels Sequenzierung und qPCR analysiert. Die modellbasierte Analyse der ChIP-seq-Daten identifizierte 19.107 Peaks. Wie für die H3K4-Trimethylierung erwartet, befanden sich die meisten Peaks in der Nähe der transkriptionellen Startstelle (TSS), und die Häufigkeit der Peakzählung nahm auf beiden Seiten des TSS stark ab, insbesondere in Richtung des Genkörpers.qPCR-Primer wurden so konzipiert, dass sie auf mehrere Loci in der Nähe des jeweiligen TSS von drei Genen abzielen. Es wurde eine hohe Anreicherung der H3K4-Trimethylierung im Vergleich zu den Eingangs- und Mock-Kontrollen beobachtet. Der Prozentsatz des Inputs variierte zwischen 2,7 und 10,7 %, wobei sich die Anreicherung je nach Gen und den Loci innerhalb desselben Gens unterschied.Es bleibt zu hoffen, dass ein Verständnis der epigenetischen Regulation von Nesseltieren als Reaktion auf Umweltveränderungen, die durch die Klimakrise verursacht werden, in die Bemühungen zum Schutz und zur Wiederherstellung von Korallenriffen einfließen könnte.

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Forschung

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Genetik

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Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

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