Name: Echtzeit-Quantifizierung der Auswirkungen von IS200/IS605-Familien-assoziiertem TnpB auf die Transposonaktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie TnpB die Transposonaktivität in lebenden Escherichia coli-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie verstärkt. Diese Methode quantifiziert Einzelzell-Exzisionsstatistiken und liefert Einblicke in genetische Dynamiken.

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Finanzielle Unterstützung für diese Forschung wurde durch Startkapital der University of California bereitgestellt.

1. Vorbereitung von Bakterienkulturen
<ol><li>E. coli-Stamm MG1655 mit Plasmidtransposon-Konstrukten (zuvor beschrieben in Kim et al.8) über Nacht in LB mit den entsprechenden Antibiotika (25 μg/ml Kanamycin, siehe Materialtabelle) bei 37 °C züchten. HINWEIS: Die Sequenzen der verwendeten Konstrukte und die zugehörigen Sequenzen sind als GenBank20-Zugangsnummern OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 und OP717085 verfügbar.</li>
	<li>Um ein exponentielles Wachstum im stationären Zustand zu erreichen, verdünnen Sie Kulturen ≥100-fach in das M63-Medium (100 mMKH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg / ml Thiamin [Vitamin B1]), ergänzt mit einer Kohlenstoffquelle (0,5% w/v Glukose hier) und geeigneten Antibiotika (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Züchten Sie Kulturen bei 37 °C, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD600) ~0,2 erreicht. Die Kulturen sind einsatzbereit.</li>
</ol>2. Objektträgervorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie M63 mit 0,5% w/v Glucose und 1,5% w/v Agarose in der Mikrowelle kochen, um die Agarose zu schmelzen und sicherzustellen, dass sie vollständig geschmolzen und gut gemischt ist.</li>
	<li>Lassen Sie die Mischung auf ~55 °C abkühlen, bevor Sie Antibiotika und Induktoren (25 μg/ml Kanamycin und 10 ng/μL Anhydrotetracyclin [aTc], siehe Materialtabelle) hinzufügen.</li>
	<li>Legen Sie einen Objektträger auf die Werkbank. Stapeln Sie zwei weitere Folien senkrecht zur ersten und legen Sie eine weitere oben parallel zur unteren Folie auf. Stellen Sie sicher, dass zwischen den unteren und oberen Folien ein Spalt vorhanden ist, der einer Objektträgerstärke entspricht. Pipettieren Sie ~1 mL der M63-Agarosemischung langsam in diesen Spalt zwischen den Objektträgern, um ein kleines Gelquadrat zu erzeugen.</li>
	<li>Sobald das Gel erstarrt ist (~10-15 min), schieben Sie den oberen Objektträger, um ihn zu entfernen. Schneiden Sie das Agarosettenkissen mit einer Rasierklinge oder einem Messer ab. Dann pipetten Sie 2,5 μL der Kultur (Schritt 1.3) und legen Sie das Deckglas darauf.</li>
	<li>Verschließen Sie den Raum zwischen Objektträger und Deckglas mit Epoxidharz (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Epoxidharz trocknen und die Zellen setzen sich mindestens 1 h bei 37 °C auf dem Agarosepad ab.</li>
</ol>3. Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Die vorbereitete Probe (Schritt 1.3) wird auf ein Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) in einer auf 37 °C erhitzten und gehaltenen Umgebung gelegt.<ol><li>Stellen Sie die Belichtungszeiten entsprechend der Kamera ein, die für die Bildaufnahme verwendet wird. Stellen Sie die Beleuchtungsintensität ein, um das Photobleichen zu minimieren. HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde eine Expositionszeit von 2 s für jede Wellenlänge verwendet.</li>
		<li>Suchen Sie für jede Wellenlänge ein Sichtfeld (FOV) mit minimaler Fluoreszenz. Erfassen Sie Bilder, die während der Analyse für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden sollen.</li>
	</ol></li>
	<li>Richten Sie ein Protokoll ein, um Bilder in einem Raster bei verschiedenen Wellenlängen und in regelmäßigen Zeitintervallen zu erfassen.<ol><li>Kodieren Sie Zeitrafferaufnahmen in das Protokoll. Stellen Sie die Erfassungsfrequenz auf das gewünschte Zeitintervall (hier 20 min) und die gesamte Zeitrafferdauer auf die gewünschte Länge (24 h) ein.</li>
		<li>Kodieren Sie geeignete Wellenlängen in das Protokoll (abhängig vom verwendeten Konstrukt). HINWEIS: Der mCherry-Anregungspeak liegt bei 587 nm und der Emissionspeak bei 610 nm21; mVenus liegt bei 515 nm und 527 nm12, während mCerulean3 bei 433 nm und 475 nm11 liegt.</li>
		<li>Legen Sie die Rastergröße fest, die zwischen der gewünschten Anzahl von FOVs erfasst werden soll. HINWEIS: Die hier gezeigten repräsentativen Daten verwendeten 8 x 8 FOVs.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Bildanalyse
<ol><li>Führen Sie die Hintergrundsubtraktion für jeden Farbkanal durch, indem Sie die entsprechenden Hintergrundbilder verwenden, die in Schritt 3.1.2 erfasst wurden. Für alle Analyseschritte verwenden wir Standardmodule der Open-Source-Plattform Fiji22 (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Nähern Sie sich der Gesamtpopulation zu jedem Zeitpunkt an, indem Sie den mCerulean-Kanal schwellieren und den Schwellenwertbereich durch die durchschnittliche Zellfläche dividieren.</li>
	<li>Um die eindeutigen Exzisionsereignisse zu zählen, nehmen Sie die Zeitableitung des mCerulean3-Kanals. Tun Sie dies, indem Sie aufeinanderfolgende Bilder im mCerulean3-Kanal subtrahieren. Die Exzisionsereignisse werden in der Zeitableitung als heller Fluoreszenzblitz detektiert.<ol><li>Schwelle des Stapels von Exzisionsereignissen, um unerwünschte Fluoreszenz zu eliminieren. Beachten Sie, dass dieser Prozess Teile der Exzisionen selbst ausschließt. Um dies zu beheben, erweitern Sie die Bilder, um die Exzisionen auf ihre ursprüngliche Größe wiederherzustellen. HINWEIS: Analysen mit ähnlichen Schwellenwert- und Bildanalysetechniken können auch an den anderen Fluoreszenzkanälen durchgeführt werden (z. B. Korrelation von Exzisionsereignissen mit Transposase-TnpA [gelbe Venusfluoreszenz] und TnpB [rote mCherry-Fluoreszenz].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
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<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
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<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
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<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
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<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die hier vorgestellte einzigartige Methode zur Echtzeit-Bildgebung der Aktivität transponierbarer Elemente in lebenden Zellen ist ein empfindlicher Assay, der die Transposition in lebenden Zellen und in Echtzeit direkt nachweisen und diese Aktivität mit der Expression akzessorischer Proteine korrelieren kann. Während der Durchsatz geringer ist, als dies mit Massenmethoden erreicht werden kann, erreicht diese Methode detaillierte Messungen der TE-Aktivität und Proteinexpression in einzelnen lebenden Zellen.
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Transposable Elements (TEs) sind genetische Elemente, die innerhalb ihres Wirtsgenoms durch Exzision mobilisieren oder kopieren und anschließend genomische Reintegration katalysieren. TEs existieren in allen Lebensbereichen, und die Transposition strukturiert das Wirtsgenom um und mutiert kodierende und Kontrollregionen1. Dies erzeugt Mutationen und Diversität, die eine wichtige Rolle in der Evolution2,3, der Entwicklung4,5 und mehreren menschlichen Krankheiten6, einschließlich Krebs7, spielen.
Unter Verwendung neuartiger genetischer Konstrukte, die Aspekte der Transpositionsaktivität an fluoreszierende Reporter koppeln, beschrieben unsere früheren Arbeiten die Entwicklung eines experimentellen Systems basierend auf dem bakteriellen TE IS608, einem Vertreter der weit verbreiteten IS200/IS605-Familie von TEs, das die Echtzeitvisualisierung der Transposition in einzelnen lebenden Zellen ermöglicht8 (Abbildung 1). Das TE-System ist in Abbildung 1A dargestellt. Die TE umfasst die Transposase-kodierende Sequenz, tnpA, flankiert von Left End (LE) und Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IPs), die die Erkennungs- und Exzisionsstellen für TnpA sind. tnpA wird unter Verwendung des Promotors PLTetO1 exprimiert, der durch den Tet-Repressor unterdrückt wird und mit Anhydrotetracyclin (aTc)9 induzierbar ist. Der TE teilt die -10- und -35-Sequenzen eines konstitutiven PlacI Q1-Promotors10 für den blauen Reporter mCerulean3 11 auf. Wie in Abbildung 1C gezeigt, kann der TE herausgeschnitten werden, wenn die Produktion von tnpA induziert wird, was zu einer Rekonstitution des Promotors führt. Die produzierte Zelle exprimiert mCerulean3 und fluoresziert blau. Der N-Terminus von TnpA ist mit dem gelben Reporter Venus12 verschmolzen, was die Messung der TnpA-Spiegel durch gelbe Fluoreszenz ermöglicht.
IS608 und andere Mitglieder der IS200/IS605-Familie von Transposons kodieren typischerweise auch für ein zweites Gen der bisher unbekannten Funktion, tnpB13. Die TnpB-Proteine sind eine enorm häufige, aber unvollkommen charakterisierte Familie von Nukleasen, die von mehreren bakteriellen und archaealen TEs14,15 kodiert werden, die oft nur aus tnpB16 bestehen. Darüber hinaus haben neuere Studien das Interesse an TnpB erneuert, indem sie festgestellt haben, dass TnpB als CRISPR / Cas-ähnliche programmierbare RNA-gesteuerte Endonuklease fungiert, die unter verschiedenen Bedingungen entweder dsDNA- oder ssDNA-Brüche erzeugt17,18. Es bleibt jedoch unklar, welche Rolle TnpB bei der Regulierung der Umsetzung spielen könnte. Um die Auswirkungen von TnpB auf die IS608-Transposition in Echtzeit zu visualisieren, wurde eine Version des Transposons, einschließlich der kodierenden Region von TnpB mit einer N-terminalen Fusion zum rot fluoreszierenden Protein mCherry, erstellt.
Ergänzend zu detaillierteren Bulk-Level-Studien, die vom Kuhlman-Labor19 durchgeführt wurden, wird hier gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung der Transposonaktivität den Einfluss von TnpB oder anderen akzessorischen Proteinen auf die Transpositionsdynamik quantitativ aufdecken kann. Durch die Fusion von TnpB zu mCherry werden die einzelnen transpositionalen Ereignisse durch blaue Fluoreszenz identifiziert und mit Expressionsniveaus von TnpA (gelbe Fluoreszenz) und TnpB (rote Fluoreszenz) korreliert.

<table><tbody><tr><td>2 Tonnen klares Epoxid</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracyclinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Argon Laser</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Blauer Filter Würfel</td><td>Chroma</td><td>Bsp.: Z457/10X, EM: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Abgekündigt</td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Boxen und Nachfüllfächer, Volumen: 0,1 bis 10 & Mikro; L, Länge: 3,4 cm, 1,33 Zoll, PP (Polypropylen)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Boxen und Nachfüllschalen, Volumen: 50 bis 1000 &Mikro; L, Länge: 7,1 cm, 2,79 Zoll, PP (Polypropylen)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Eisensulfat Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi</td><td></td><td></td><td>Fidschi (imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;LB Brühe, Miller (granuliert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckel</td><td>Slide Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopheizung</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Stufe</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roter Filter Würfel</td><td>Chroma</td><td>Bsp.: ET560/40X, Em: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>Saphir 561 LP Laser</td><td>Coherent</td><td>1170412</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger,</td><td>Mikroskop Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Thiaminhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Laser Launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelbfilter Würfel</td><td>Chroma</td><td>Bsp.: Z514/10X, EM: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-quantifizierung der auswirkungen von is200/is605-familien-assoziiertem tnpb auf die transposonaktivität

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Hier wird ein Protokoll skizziert, um eine Live-Echtzeit-Bildgebung der transponierbaren Elementaktivität in lebenden Bakterienzellen unter Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Reportern durchzuführen, die mit der Transposition gekoppelt sind. Insbesondere wird gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung verwendet werden kann, um die Auswirkungen des akzessorischen Proteins TnpB auf die Aktivität des transponierbaren Elements IS608, einem Mitglied der IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente, zu bewerten. Die IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente sind reichlich vorhandene mobile Elemente, die mit einem der unzähligen Gene in der Natur, tnpB, verbunden sind. Sequenzhomologien deuten darauf hin, dass das TnpB-Protein ein evolutionärer Vorläufer von CRISPR/Cas9-Systemen sein könnte. Darüber hinaus hat TnpB erneut Interesse geweckt, da gezeigt wurde, dass es als Cas-ähnliche RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease wirkt. Die Auswirkungen von TnpB auf die Transpositionsraten von IS608 werden quantifiziert, und es wird gezeigt, dass die Expression von TnpB von IS608 zu ~5x erhöhter Transposonaktivität im Vergleich zu Zellen ohne TnpB-Expression führt.

Diese Methode zur Visualisierung der Transposonaktivität in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht bei geringerem Durchsatz als Massenfluoreszenzmessungen die direkte Visualisierung der Transposonaktivität in einzelnen lebenden Zellen. Transposon-Exzisionsereignisse führen zur Rekonstitution des Promotors für mCerulean3 (Abbildung 1), was die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die Transposonaktivität durch hellblaue Fluoreszenz durchlaufen (Abbildung 2, TnpB+: Supplement...

Es wird ein Protokoll skizziert, um Live-Echtzeit-Bildgebung durchzuführen, um zu quantifizieren, wie das akzessorische Protein TnpB die Dynamik der Transposition in einzelnen lebenden Escherichia coli-Zellen beeinflusst.

Echtzeit-Quantifizierung der Auswirkungen von IS200/IS605-Familien-assoziiertem TnpB auf die Transposonaktivität

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Exzisionsstatistiken auf Einzelzellbasis zu quantifizieren, anstatt das Massenverhalten zu betrachten. Auf dieser Ebene können wir das Verhalten einzelner Zellen im Laufe der Zeit verfolgen, einschließlich ihrer TnpA- und TnpB-Spiegel für Zellen, die ausschneiden, im Vergleich zu Zellen, die dies nicht tun, was es uns beispielsweise ermöglichen kann, die Auswirkungen identifizierter Mutationsereignisse auf die Wachstumsrate zu messen. Diese Methode ist eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, die Dynamik der Mutation lebender Zellen zu messen.Der allgemeine Ansatz ist auf jedes System anwendbar, das eine Lebendzellfluoreszenzbildgebung erfordert. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie M63 mit 0,5% Glucose und 1,5% Agarose in der Mikrowelle kochen, um die Agarose zu schmelzen. Stellen Sie sicher, dass das Medium vollständig aufgeschmolzen und gut durchmischt ist.Lassen Sie die Mischung auf 55 Grad Celsius abkühlen, bevor Sie Antibiotika und Induktoren hinzufügen. Legen Sie einen Objektträger auf die Werkbank. Stapeln Sie eine Folie senkrecht zur ersten.Stellen Sie sicher, dass zwischen dem unteren und oberen Schlitten ein Spalt vorhanden ist, der einer Objektträgerstärke entspricht. Pipettieren Sie einen Milliliter der M63-Agarosemischung langsam in den Spalt zwischen dem Objektträger, um ein kleines Gelquadrat zu erzeugen. Sobald das Gel erstarrt ist, schieben Sie den oberen Objektträger, um ihn zu entfernen.Schneiden Sie das Agarosettenkissen mit einer Rasierklinge oder einem Messer ab. Dann pipetten Sie 2,5 Mikroliter der Bakterienkultur und legen Sie den Deckstreifen darauf. Versiegeln Sie den Raum zwischen dem Objektträger und dem Abdeckglas mit Epoxidharz.Lassen Sie das Epoxidharz trocknen und die Zellen setzen sich eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf dem Agarosepad ab. Legen Sie die vorbereitete Probe auf ein Fluoreszenzmikroskop in einer Umgebung, die auf 37 Grad Celsius erhitzt und gehalten wird. Suchen Sie für jede Wellenlänge das Sichtfeld mit minimaler Fluoreszenz.Richten Sie ein Protokoll ein, um Bilder in einem Raster bei verschiedenen Wellenlängen und in regelmäßigen Zeitintervallen zu erfassen. Transposon-Exzisionsereignisse führen zur Rekonstitution des Promotors für mCerulean3, was die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die Transposonaktivität durch hellblaue Fluoreszenz durchlaufen. TnpB erhöht die Transposon-Exzisionsrate.Zellen, die das akzessorische Protein TnpB exprimieren, erfahren eine vier- bis fünfmal höhere Transposonaktivität als TnpB-negative Zellen. In TnpB-positiven Zellen haben Zellen, die Transposon-Exzisionsereignisse durchlaufen, höhere Expressionsniveaus von mCherry TnpB als die Allgemeinbevölkerung. Darüber hinaus exprimieren TnpB-positive Zellen für Zellen, die Exzisionsereignisse durchlaufen, nur geringfügig höhere Konzentrationen venöser TnpA-Transposase als TnpB-negative Zellen, was höher ist als die gelbe Fluoreszenz der Allgemeinbevölkerung.Der wahrscheinlichste Ort, um zu kämpfen, ist die Vorbereitung der Zellkultur für das Experiment. Sie sollten sicherstellen, dass die Zellen in die exponentielle Phase gezüchtet werden und dass der Objektträger mit einer angemessenen Anzahl von Zellen geimpft ist. Denken Sie daran, beim Versiegeln des Objektträgers auf Blasen zu achten, damit das Agarosegel nicht austrocknet.

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Biology

Biologie

Quelle: Kazi, M. I., et. al., Generierung von Transposon-Insertionsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. J. Vis. exp. (2020)Dieses Video zeigt die Selektion, Quantifizierung und Konservierung von Gram-negativen Empfängerbakterien, die Transposon-Insertionen auf der Grundlage von Kanamycin-Resistenz tragen.

Isolierung gramnegativer Bakterien mit genomischen Transposon-Insertionen

Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Mini-himar1 mariner Transposon-vermittelte Mutagenese zur Erzeugung einer hohen Dichte Insertionsmutante Bibliothek-Bildschirm, zu isolieren und zu identifizieren Roman Alginat-Regulatoren in der prototypischen Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1.

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

Präsentiert hier ist eine einfache Methode zum Erstellen einer High-Density Transposon Einfügung Bibliothek in Escherichia coli oder Shigella Flexneri mit bakteriellen Konjugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Sammlung von Hunderten von Tausenden von einzigartigen Mutanten in Bakterien durch die zufällige genomische Einfügung ein Transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Wir beschreiben hier eine Technik, die verbindet Transposon Mutagenese mit Hochdurchsatz-Sequenzierung zu identifizieren und quantifizieren Transposon Leptospiral Mutanten im Gewebe nach einem Zweikampf von Hamstern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bildschirm Mutanten für überleben und Verbreitung bei Tieren und kann auch auf in-vitro- Studien angewendet werden.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um stabile Integration eines Gens von Interesse des menschlichen Genoms durch das transcriptionally regulierte Dornröschen -System zu erreichen. Vorbereitung der Integration von defekten Lentivirale Vektoren, die in-vitro- Transduktion von menschlichen Zellen und molekulare Tests auf Zellen ausgestrahlt werden gemeldet.

Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Dies ist eine angepasste Methode zur Identifizierung von Kandidaten für Insektenbesiedlungsfaktoren in einem Burkholderia-nützlichen Symbionten. Der Käferwirt ist mit einer zufälligen mutanten Bibliothek infiziert, die durch Transposonmutagenese erzeugt wird, und die Bibliothekskomplexität nach der Kolonisation wird mit einer in vitro gezüchtetenKontrolle verglichen.

Transposon-Insertionssequenzierung als Werkzeug zur Aufklärung bakterieller Besiedlungsfaktoren in einem Burkholderia gladioli Symbionten von Lagria villosa Käfern

Erfahren Sie, wie TnpB die Transposonaktivität in lebenden Escherichia coli-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie verstärkt. Diese Methode quantifiziert Einzelzell-Exzisionsstatistiken und liefert Einblicke in genetische Dynamiken.

Echtzeit-Quantifizierung der Auswirkungen von IS200/IS605-Familien-assoziiertem TnpB auf die Transposonaktivität

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