Name: Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie die Z-REX-Methode reaktive Signalmoleküle in Zebrafischlarven mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision analysiert. Diese Technik verknüpft spezifische Liganden-Ziel-Interaktionen mit phänotypischen Veränderungen und liefert wertvolle Erkenntnisse für die Krebsforschung sowie die Entwicklung gezielter Therapien.

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Finanzierung: Novartis FreeNovation, NFS und EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Isoform-spezifische niedermolekulare Kinase-Inhibitoren, deren Entdeckung durch REX-Technologien ermöglicht wurde, wurden zum Patent angemeldet

Z-REX, das in diesem Protokoll beschrieben wird, demonstriert eine robuste Strategie für die Untersuchung von Elektrophil-Target-Paaren und die Entfaltung von Signalwegen in lebenden Fischen. Die näherungsgerichtete Abgabe ermöglicht die Dosierung und räumliche Kontrolle der elektrophilen Substanzbehandlung. Im Gegensatz zu herkömmlichen Bolusdosierungsmethoden, bei denen die supraphysiologischen Konzentrationen des eingesetzten Elektrophils oft zu Off-Target-Problemen führen, macht die relativ geringe Menge an Elektrophil, die an das System abgegeben wird, Z-REX weitgehend nicht-invasiv. Wir haben 0,1-6 μM Ht-PreHNE (Alkin) in Zebrafischembryonen verwendet, und die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung der Embryonalentwicklung nicht abträglich ist11.
Das Z-REX-Verfahren ist im Allgemeinen länger als das T-REX-Verfahren, eine Technik zum Screenen/Untersuchen elektrophiler Sensorproteine in kultivierten Zellen. Angenommen, der Zweck des Experiments besteht darin, nach Wechselwirkungen zwischen Elektrophilen und Zielmolekülen zu suchen. Wir empfehlen, zunächst ein umfangreiches Screening mit T-REX in kultivierten Zellen durchzuführen und Z-REX für die In-vivo-Validierung und die phänotypische/Signalweganalyse zu verwenden. Im Vergleich zur Zellkultur sind die Voraussetzungen für die Durchführung von Z-REX neben den für T-REX erforderlichen biochemischen Versuchsfähigkeiten grundlegende Fischhaltungstechniken. Ein typischer Zeitrahmen für Z-REX (von der Fischkreuzung bis zur lichtinduzierbaren elektrophilen Abgabe) beträgt 2-3 Tage, was nicht mehr als 1 Tag länger ist als die typische Zeit für ein T-REX-Experiment an transfizierten lebenden Zellen. Die Live-Bildgebung für die phänotypische Analyse kann 2-10 h nach der Beleuchtung des Lichts durchgeführt werden. Die Klick-Kopplung mit Biotin-Azid für den Pull-Down-Assay dauert 3 Tage; Die qRT-PCR zur Bestimmung des transkriptionellen Ansprechens dauert 3 Tage; Die IF-Färbung dauert 5 Tage. Diese Schritte ähneln in etwa ihren Zellkultur-Äquivalenten, obwohl die Interpretation der Daten ein Verständnis der Fischphysiologie und der Reporterstämme erfordert.
Da es sich um ein Multiple-Variablen-Verfahren12 handelt, sind für Z-REX mehrere Kontrollgruppen notwendig, um Unsicherheiten in den Ergebnissen auszuschließen (Abbildung 1D). Gängige Kontrollgruppen sind: (1) nur DMSO/Fahrzeugbehandlung; (2) Sondenbehandlung, jedoch ohne Lichtbeleuchtung; (3) Lichtbeleuchtung, jedoch ohne Sondenbehandlung; (4) P2A-Split-Konstrukt, in dem Halo und der POI separat ausgedrückt werden, so dass die Proximity-Lieferung abgetragen wird; und (5) hypomorphe Mutanten, deren elektrophil-sensible(r) Rest(e) mutiert ist/sind, wie z.B. Akt3 (C119S)6 und Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, die wir in früheren Studien verwendet haben.
Wenn nachgelagerte Analysen eine Western-Blot-Analyse beinhalten, muss vor der Ernte eine Deyolking durchgeführt werden. Die Dotterproteine verringern die Genauigkeit der Beurteilung der Lysatkonzentration und können unspezifisch an Antikörper binden. Bei der Bildgebung lebender Fische oder der IF-Färbung im Whole-Mount haben wir auch unspezifische Fluoreszenzsignale im Dottersack beobachtet, die wahrscheinlich auf autofluoreszierende Proteine im Dottersack oder eine unspezifische Bindung der Antikörper selbst zurückzuführen sind. Wenn das Autofluoreszenzsignal das Signal stört, empfehlen wir, den Dottersack von der Quantifizierung auszuschließen oder verschiedene Regionen separat zu quantifizieren. Die Dechorinierung ist für die Bildgebung lebender Fische und den Whole-Mount-IF-Färbetest erforderlich. Das Chorion kann die Bildgebung und später die Quantifizierung/Zellzählung beeinträchtigen. Die Dechorinierung ist jedoch nur bei Embryonen anwendbar, die älter als 1 dpf sind. Jüngere Embryonen in Blastulations-/Gastrulations-/Segmentierungsstadien sind zu zerbrechlich, um dechorioniert zu werden.
Das hier beschriebene Z-REX-Protokoll basiert auf der mRNA-gesteuerten ektopischen POI-Expression. Das Verfahren ist im Vergleich zur Verwendung/Erzeugung transgener Fischlinien schnell. Die mRNA-gesteuerte Expression ist ubiquitär und vorübergehend und hält für mRNAs, die in diesem Protokoll verwendet werden, mindestens 2 Tage an. Die Dauer der Expression kann jedoch in anderen Fällen variieren. Somit bietet dieser Ansatz ein schnelles und globaleres Untersuchungsfenster für die Auswirkungen eines bestimmten elektrophilen Markierungsereignisses, das mit mehreren Hochdurchsatz-/High-Content-Assays kompatibel ist. Transgene Linien mit stabiler Halo-POI-Expression in bestimmten Geweben sind ebenfalls mit Z-REX11 kompatibel. Solche Zeilen werden am besten verwendet, wenn eine genauere Frage gestellt werden muss, z. B. wenn ein Phänotyp in einem bestimmten Organ aus Zellkulturdaten vorhergesagt wird oder wenn das Screening aus mRNA-Injektionsexperimenten vorhersagt, dass ein bestimmtes Organ empfindlich auf ein elektrophiles Markierungsereignis reagiert. In unserer vorherigen Publikation11 wurde eine herzspezifische Induktion einer antioxidativen Reaktion durch Z-REX anhand von Tg(gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1)-Fischen demonstriert. Möglicherweise ist es auch möglich, Z-REX bei transgenen Fischen durchzuführen, die älter als 2 dpf sind.

Eine Vielzahl von zellulären Signalereignissen umfasst Reaktionen zwischen kleinen reaktiven Molekülen (endogen in der Zelle produziert oder Xenobiotika/Xenometaboliten, wie z. B. Medikamente) und ihrem Proteinziel. In vielen Fällen kann ein substöchiometrisches Niveau solcher kovalenten Bindungsereignisse zelluläre Reaktionen auslösen, die zu Veränderungen z. B. in der Entwicklung, im Stoffwechsel, in der Apoptose und/oder in der Immunantwort führen1. Die Dekonstruktion der Wirkungsweise (MOA) durch die Verknüpfung spezifischer Bindungsereignisse mit ihren phänotypischen Konsequenzen hat sich jedoch als schwierig erwiesen. Herkömmliche Bolusdosierungsmethoden, bei denen hohe Konzentrationen der reaktiven Spezies eingebracht werden, führen häufig zu einer Vielzahl von Proteinen, die modifiziert werden, sowie zu einer übermäßigen Toxizität für den Modellorganismus2. Solche Bedingungen sind alles andere als ideal. Es wurde eine Methode entwickelt, um diese Probleme in der Zellkultur zu lösen, indem eine präzise lokalisierte elektrophile Verabreichung in einem nativen zellulären Kontext verwendet wird, genannt T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. In der Zwischenzeit hat sich der Fokus auf Experimente an ganzen Organismen verlagert, die die Möglichkeit bieten, Proteine in bestimmten zellulären Kontexten in nicht transformierten Zellen zu untersuchen. Daher haben wir die Technik so erweitert, dass sie mit mehreren Modellen kompatibel ist, einschließlich Danio-Rerio-Embryomodellen . In dieser Arbeit stellen wir Z-REX (Zebrafische gegen reaktive Elektrophile und Oxidationsmittel) vor (Abbildung 1).
Um Z-REX zu verstehen, werden in diesem Artikel zunächst REX-Technologien und die ihnen zugrunde liegenden Konzepte vorgestellt. Im Kern modellieren diese Techniken die Signalübertragung endogener physiologischer reaktiver elektrophiler Spezies (RES), indem sie nachahmen, wie natürliche Elektrophile lokal in vivo mit raumzeitlicher Präzision produziert werden. Das interessierende Protein (POI) wird als Fusionskonstrukt zu Halo exprimiert; Letzteres verankert die gewebedurchlässige und inerte Sonde, die das photocaged RES trägt, in einer 1:1-Stöchiometrie. Ein solches endogenes RES ist 4-Hydroxynonenal (im Folgenden HNE), das in der Sonde Ht-PreHNE photocaged ist. In vielen Fällen verwenden wir eine alkinfunktionalisierte Version von HNE [d.h. HNE(alkin)], die im Wesentlichen identische biologische Eigenschaften wie HNE hat, aber durch Click-Chemie markiert werden kann. Die Sonde, die ebenfalls mit einem Chloralkan für die Reaktivität mit Halo funktionalisiert ist, wird als Ht-PreHNE (Alkin) bezeichnet. Der Komplex der Halo-POI-Fusion und der so gebildeten Sonde ermöglicht die proximale Abgabe von RES an den fusionierten POI bei Bestrahlung mit UV-Licht. Reagiert der POI schnell mit dem freigesetzten RES, ermöglicht die daraus resultierende kovalente Markierung des POI mit RES die Identifizierung kinetisch privilegierter Cysteine.
Z-REX nutzt die oben genannten Vorteile der REX-Technologien und wendet sie breit an, um spezifische Signalwege in lebenden Fischen zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde für Zebrafische (D. rerio) optimiert, da es sich um genetisch handhabbare Wirbeltierorganismen handelt, die während der Entwicklung transparent sind und sich daher ideal für optochemische/-genetische Techniken wie REX-Technologien eignen. Nichtsdestotrotz dürfte eine ähnliche Strategie auch bei anderen genetisch beherrschbaren Fischarten gut funktionieren, da die breite Anwendbarkeit der Methode auf den pseudo-intramolekularen Mechanismus der Lipid-abgeleiteten elektrophilen (LDE) Verabreichung zurückzuführen ist. In der Tat ist das Verfahren sehr biokompatibel, da Fische mindestens 48 Stunden lang mit dem photokäfig-elektrophilen Z-REX [z. B. Ht-PreHNE(alkin)] behandelt werden können, ohne dass die Entwicklung spürbar beeinträchtigt wird. Ein ähnliches Protokoll funktioniert in C. elegans 4,5.
Das Protokoll beschreibt zunächst die Verwendung der mRNA-Injektion zur Erzeugung einer transienten Expression eines nicht-nativen Halo-POI-Fusionskonstrukts in embryonalen Zebrafischmodellen, 1-1,5 Tage nach der Befruchtung (dpf). Dies führt dazu, dass das ektopische Protein in den meisten Zellen innerhalb des Fisches (im Folgenden als "ubiquitär" bezeichnet) und nicht in bestimmten Geweben oder Lokalitäten exprimiert wird. Die Daten zeigen jedoch, dass in bestimmten Fällen zellspezifische Effekte beobachtet werden können. Nach der Injektion werden die Embryonen mit einer niedrigen Konzentration [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alkin)] der Sonde bis zu 30,5 h nach der Befruchtung (hpf) inkubiert. Dann, zu einer vom Benutzer vorgeschriebenen Zeit, wird die Abgabe des RES an den POI innerhalb des Fisches durch Photouncaging für 2-5 Minuten erreicht. Nach dem Photouncaging des RES kann in den nächsten 2-10 Stunden eine Vielzahl von nachgeschalteten phänotypischen Assays durchgeführt werden: 1) Live-Bildgebung von Reporterlinien (Abbildung 2A); 2) Bewertung der Zielkennzeichnung durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 3); 3) transkriptomische Analyse (Abbildung 4); oder 4) Whole-Mount-Immunfluoreszenz (Abbildung 5).
Als Beispiel für die Live-Bildgebung von Reporterlinien wird Z-REX zusammen mit der Live-Bildgebung von Fischlinien, Tg(lyz:TagRFP) und Tg(mpeg1:eGFP), demonstriert, um zu messen, wie die RES-Modifikation eines bestimmten elektrophilen Sensor-POI (nämlich Keap1) die Neutrophilen- bzw. Makrophagenkonzentration senkt, ohne beobachtbare Auswirkungen auf andere Zellen im Fisch. Wir haben jedoch bereits gezeigt, dass die POI-Markierung und der daraus resultierende Signalweg aus T-REX-Studien mit Hilfe von Z-REX für mehrere Proteine reproduziert werden können: Akt3 6, Keap17 und Ube2v26. Insgesamt können Wissenschaftler mit Z-REX die Konsequenz(en) der kovalenten Modifikation von POIs durch RES im Kontext mehrerer komplexer Redoxwege untersuchen. Diese Technik ist darauf ausgelegt, Targets und ihre funktionellen Reste für das kovalente Wirkstoffdesign und neuartige Wirkstoffmechanismen in einem kontextuell relevanteren Ganztiermodell zu lokalisieren.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Petrischalen</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>30%ige Acrylamid- und Bis-Acrylamid-Lösung</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue Prestained Protein Standards</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-dPEG11-azid</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-freier Proteasehemmer Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ratte-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>ECL-Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>ECL-Plus Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>End-to-End-Rotator</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr> Flammender<tr><td>/Brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette (stumpf)</td><td>selbst hergestellt</td><td></td><td>durch Abstumpfen scharfe Pinzette (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>Pinzette (scharf)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Ladespitze</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Gel-/Blot-Imager</td><td>Vilber</td><td>Fusion FX Imager</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Glastischmikrometer</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Beheiztes Ultraschallbad</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Hohe Kapazität Streptavidin Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE Alkinsonde</td><td>Eigenbau</td><td></td><td>Parvez, S. et al. T-REX On-Demand-Redox-Targeting in lebenden Zellen. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Speicherfolie (10 % HBSS-Puffer, für lebende Embryonen)</td><td></td><td></td><td>Hergestellt aus Petrischale und 2 % Agarose in 10 % HBSS-Puffer</td></tr><tr><td>Speicherfolie (PBS, für formaldehydfixierte Embryonen)</td><td></td><td></td><td>Hergestellt aus Petrischale und 2 % Agarose in PBS-Injektionsplatte</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Hergestellt aus Mikrospritzgussform, Petrischale und 2 % Agarose in 10 % HBSS-Puffer</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo APOBI3331</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospritzgussform</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop für Mikroinjektion</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Lichtquelle</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti- &beta;-actin-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Maus anti-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Multimode</td><td>Reader BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Nukleinsäure-Agarose-Gelelektrophorese-Gerät</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>kundenspezifisch: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>selbstkloniert-Erhältlich</td><td></td> <td>aus der Gruppe von Prof. Yimon AYE an der EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>selbstkloniert-Erhältlich</td><td></td> <td>aus der Gruppe von Prof. Yimon AYE an der EPFL</td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung und Zubehör für die Proteinelektrophorese</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertikale Elektrophorese</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen antiaktiv Caspase-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Ratte anti-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF und WB)</td></tr><tr><td>Ratte anti-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Gekühlte Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap RNA-Dekontaminationslösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelschüttler</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III reverse Transkriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-Butanol</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV Protease (S219V)</td><td>self-made-Parvez</td><td></td><td>, S. et al. T-REX On-Demand-Redox-Targeting in lebenden Zellen. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor aus Glycin max (Sojabohne)</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe mit 365-nm-Licht</td><td>Spektroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>UV-Messgerät</td><td>Spektroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Transfer Ausrüstung und Zubehör</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot oder Criterion Blotter&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zucht- und Zuchtgeräte</td><td></td><td></td> für Zebrafische <td>im Haus</td></tr><tr><td>Zirkonia-Kügelchen</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung von on-target-signalantworten in zebrafischlarven - z-rex entschlüsselt präzise mechanismen elektrophiler wirkstoffe und metaboliten

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reaktive Metaboliten und verwandte elektrophile Wirkstoffe gehören zu den am schwierigsten zu untersuchenden kleinen Molekülen. Konventionelle Ansätze zur Dekonstruktion der Wirkungsweise (MOA) solcher Moleküle nutzen die Massenbehandlung von Versuchsproben mit einem Überschuss an einer bestimmten reaktiven Spezies. Bei diesem Ansatz ermöglicht die hohe Reaktivität von Elektrophilen eine nicht-diskriminierende Markierung des Proteoms in einer zeit- und kontextabhängigen Weise; Auch redoxsensitive Proteine und Prozesse können indirekt und oft irreversibel beeinflusst werden. Vor dem Hintergrund unzähliger potenzieller Targets und indirekter Sekundäreffekte bleibt die Verknüpfung des Phänotyps mit dem spezifischen Target-Engagement eine komplexe Aufgabe. Zebrafische, die auf reaktive Elektrophile und Oxidationsmittel (Z-REX) abzielen - eine On-Demand-Plattform für die reaktiv-elektrophile Verabreichung, die für den Einsatz in Zebrafischlarven geeignet ist - wurde entwickelt, um Elektrophile an ein bestimmtes Protein von Interesse (POI) in ansonsten ungestörten lebenden Fischembryonen zu liefern. Zu den wichtigsten Merkmalen dieser Technik gehören ein geringes Maß an Invasivität sowie eine dosis-, chemotyp- und raumzeitgesteuerte elektrophile Präzisionsabgabe. In Verbindung mit einer einzigartigen Reihe von Kontrollen umgeht diese Technik somit Off-Target-Effekte und systemische Toxizität, die sonst nach unkontrollierter Massenexposition von Tieren gegenüber reaktiven Elektrophilen und pleiotropen elektrophilen Medikamenten beobachtet werden. Mit Hilfe von Z-REX können Forscher verstehen, wie sich individuelle Stressreaktionen und Signalausgänge als Ergebnis einer spezifischen reaktiven Ligandenbindung an einen bestimmten POI unter nahezu physiologischen Bedingungen in intakten lebenden Tieren verändern.

Live-Bildgebung von Z-REX-behandelten transgenen Neutrophilen/Makrophagen-Reporterfischen, Tg(lyz:TagRFP) und Tg(mpeg1:EGFP). Induktion der Apoptose von Neutrophilen/Makrophagen durch Keap1 HNEylierung. (Siehe auch Abbildung 2). Die Wirkung der elektrophilen Markierung von Keap1 auf die Konzentrationen von Neutrophilen und Makrophagen wurde durch die Injektion heterozygoter transgener Embryonen, die von Tg(lyz:TagRFP) oder Tg(mpeg1:EGFP) abstammen, mit mRNA, die für Halo-Keap1 kodiert, und die anschließende Behandlung mit Ht-PreHNE(alkin) untersucht. Im Anschluss an die Verfahren für Schritt 6.1-Downstream-Assay wurde Option 1-HNE (Alkin) freigesetzt und Keap1 markiert. Die Konzentrationen von Neutrophilen und Makrophagen wurden durch Live-Bildgebung der Reporterlinien Tg(lyz:TagRFP) bzw. Tg(mpeg1:eGFP) bestimmt. Der Spiegel beider Zelltypen sank um 30%-40% nach der Z-REX-Behandlung, bei der HNE an Keap1 abgegeben wurde. Im Gegensatz dazu wurde in den technischen Kontrollgruppen von Z-REX kein Verlust von Neutrophilen oder Makrophagen beobachtet [ohne Licht und Ht-PreHNE (Alkin), Licht allein oder Ht-PreHNE (Alkin) allein] (Abbildung 1D und Abbildung 2A-D).
Die Induktion der Apoptose von Neutrophilen/Makrophagen deutete auf eine erfolgreiche HNE-Abgabe an Keap1 durch Z-REX hin. Details zur Signalwegsanalyse und zum Apoptosemechanismus wurden veröffentlicht5. Um Off-Target-Effekte von HNE (Alkin) zu berücksichtigen, wurden mehrere Kontrollen verwendet. (1) Unter den gleichen experimentellen Bedingungen wurde den Embryonen anstelle von Halo-TeV-Keap1 mRNA Halo-P2A-Keap1 mRNA injiziert. Der P2A-Linker ermöglichte es, die Proteine Halo und Keap1 unabhängig voneinander zu exprimieren. In diesem Szenario konnte HNE(alkin), das von Halo freigesetzt wurde, Keap1 nicht markieren, da es sich nicht mehr proximal zu Halo befand (Abbildung 1D); Der Apoptose-Signalweg wurde also nicht ausgelöst. In dieser Gruppe wurden keine Veränderungen der Makrophagen- oder Neutrophilenkonzentration beobachtet (Abbildung 2A,B). (2) Die gleichen experimentellen Bedingungen wurden mit mRNA durchgeführt, die für Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) kodiert, eine Mutante von Keap1, die nicht auf HNE(Alkin) reagiert (Abbildung 1D). Es wurden keine Veränderungen der Makrophagen- oder Neutrophilenkonzentration beobachtet (Abbildung 2G,H).
Biotin-Azid-Klick-Kopplung und Biotin-Pull-Down-Assay. Bewertung der Zielkennzeichnung. (Siehe auch Abbildung 3). Die Target-Marking-Bewertung wurde mit WT-Embryonen durchgeführt, die mit mRNA injiziert wurden, die entweder für Halo-TeV-Keap1-2xHA (Halo-POI-Fusionskonstrukt) oder Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (P2A-Split-Konstrukt, in dem Halo und Keap1 nicht fusioniert sind; Abbildung 1D). Das markierte Keap1-Protein wurde nur in der Gruppe, die das Fusionsprotein exprimierte, heruntergezogen und mit Z-REX (zweite Spur im oberen Anti-HA-Blot) behandelt, nicht aber in anderen Kontrollgruppen (keine mRNA-Injektion, Fusionskonstrukt ohne Z-REX oder P2A-Split-Konstrukt). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das HNE (Alkin) erfolgreich an Keap1 geliefert wurde, und das modifizierte Keap1 anschließend durch Click-Reaktion mit Biotin konjugiert wurde und das Biotin-markierte Keap1 durch Streptavidinharz nach unten gezogen wurde.
Transkriptionsanalyse. RNA-seq und qRT-PCR. (Siehe auch Abbildung 4). Die transkriptionelle Veränderung nach Z-REX-Behandlung wurde mittels RNA-seq und qRT-PCR untersucht. In RNA-seq wurden mehrere immunrelevante Gene nach Z-REX herunterreguliert. Im Gegensatz dazu waren viele Gene, die mit der antioxidativen Antwort (AR) in Verbindung stehen, nach Z-REX hochreguliert, was aus der Induktion des Keap1-Nrf2-AR-Signalwegs bei HNEylierung auf Keap1resultierte 10 (Abbildung 4A). In der qRT-PCR-Analyse wurden ähnliche Ergebnisse bei der Analyse von drei immunrelevanten Genen (lyz, mpeg1.1 und coro1a) gefunden (Abbildung 4B). Die Hoch- und Herunterregulierung der jeweiligen Gene zeigte die erfolgreiche Induktion von Signalwegen, die durch Keap1 HNEylierung vermittelt werden.
Whole-Mount (Co-)Immunfluoreszenz-Färbe-Assay und Kolokalisationsanalyse. (Siehe auch Abbildung 5). Die exogene Expression von Halo-TeV-Keap1-2xHA und Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA wurde mittels Whole-Mount Immunfluoreszenz (IF) Färbung bestimmt (Abbildung 5A,B). Das P2A-Split-Konstrukt hatte doppelt so viele HA-Tags wie das TeV-Fusions-Konstrukt, was einem doppelt höheren Anti-HA-Signal in der P2A-Split-Construct-mRNA-injizierten Gruppe entspricht als die andere, was darauf hindeutet, dass das Expressionsniveau der beiden Konstrukte ähnlich war (Abbildung 5C). Die Expressionsniveaus von Halo-TeV-Keap1 (wt) und Halo-TeV-Keap1 (C151S,C273W,C288E) waren auch bei der Sondierung mit Anti-Halo ähnlich (Abbildung 5D,E). Die Kolokalisation von neutrophilen Granulozyten und aktiver Caspase 3 in Z-REX-behandelter Tg(lyz:TagRFP) wurde durch Co-Immunfärbung mit Anti-RFP und Anti-Aktiv-Caspase 3 beobachtet (Abbildung 5F). Active Caspase 3 ist ein Indikator für Apoptoseereignisse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> Abbildung 1: Z-REX-Arbeitsablauf. (A,B) Ein Zebrafischembryo im 1-4-Zellstadium wird mit (morpholino und) mRNA injiziert, die für Halo-POI kodiert (z. B. Halo-Keap1). Injizierte Embryonen werden dann mit einer Sonde behandelt, die aus einem HaloTag-Liganden und einem Photokäfig-Elektrophil besteht, an das eine funktionelle Alkingruppe angehängt ist, wie z. B. Ht-PreHNE (Alkin) in B. Nach dem Entfernen der überschüssigen Sondenmenge wird der Embryo Licht ausgesetzt, um das interessierende Elektrophil freizusetzen [z. B. HNE oder sein Analogon HNE (Alkin)]. Die nachgelagerte Analyse wird zu einem gegebenen/benutzerdefinierten Zeitpunkt durchgeführt. (C) Design und Mechanismus der Ht-PreLDE-Sonde, die auf verschiedene Lipid-abgeleitete Elektrophile (LDE) anwendbar ist. (D) Negative/technische Kontrollgruppen für Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> Abbildung 2: Live-Bildgebung von transgenen Neutrophilen/Makrophagen-Reporterfischen, die Z-REX ausgesetzt waren. Z-REX-vermittelte Keap1 HNEylierung induziert Neutrophilen/Makrophagen-Apoptose. (A) Repräsentative Bilder von Tg(lyz:TagRFP)- Fischen, die entweder Halo-TeV-Keap1 (Fusionskonstrukt) oder Halo-P2A-Keap1 (Split-Konstrukt) exprimieren und negativen Kontrollbedingungen ausgesetzt wurden [keine Behandlung, Licht allein oder Ht-PreHNE (Alkin) allein oder Z-REX]. Alter des Embryos: 36 hpf. (B) Quantifizierung der Neutrophilenkonzentration in A. (C) Repräsentative Bilder von Tg(mpeg1:eGFP)- Fischen, die Halo-TeV-Keap1 exprimieren, mit oder ohne Z-REX-Behandlung. Alter der Embryonen: 34 hpf. (D) Quantifizierung der Makrophagenkonzentration in C. (E,F) Zeitverlaufsmessung der (E) Neutrophilen- und (F) Makrophagenspiegel nach Z-REX-Behandlung. (G) Ähnliches Experiment wie in A an Fischen, die entweder Halo-TeV-Keap1 (WT) oder Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) exprimieren, eine Mutante, die keine HNE-Sensorfähigkeit besitzt. (H) Quantifizierung der neutrophilen Granulozyten in G. Maßstabsbalken: 500 μm. Alle Graphen werden mit Mittelwert ± REM dargestellt. Die p-Werte wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA (blau) und einem zweiseitigen Student-t-Test (schwarz) berechnet. Diese Abbildung wurde von Poganik et al.7 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> Abbildung 3: Biotin-Pull-Down-Assay. WT-Embryonen, die Halo-TeV-Keap1-2XHA oder Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA exprimierten, wurden mit Z-REX oder entsprechenden Negativkontrollbedingungen behandelt (in diesem Fall keine Sondenbehandlung). Nach der Entnahme wurden die Embryonen lysiert und mit TeV-Protease behandelt, bevor der Biotin-Pull-Down-Assay durchgeführt wurde. Die Ergebnisse wurden mittels Western Blot analysiert. Diese Abbildung wurde von Huang et al. Z-REX: Lenkung reaktiver Elektrophile zu spezifischen Proteinen, die entweder gewebespezifisch oder ubiquitär exprimiert werden, und Aufzeichnung der daraus resultierenden funktionellen elektrophil-induzierten Redoxantworten in Fischlarven. Diese Abbildung wurde von Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> Abbildung 4: Transkriptionsanalyse. (A) RNA-seq-Ergebnisse von Z-REX-behandelten und unbehandelten Embryonen. Statistisch signifikante differentiell exprimierte (SDE) Gene werden hervorgehoben. Immunitätsbezogene SDE-Gene sind rot eingefärbt. Gene, die mit der antioxidativen Reaktion (AR) in Verbindung stehen, sind grün eingefärbt. Andere SDE-Gene sind blau gefärbt. Alle p-Werte wurden mit CuffDiff berechnet. (B-D) Drei immunitätsrelevante SDE-Gene aus A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 und (D) coro1a wurden mittels qRT-PCR weiter analysiert, und nur die Z-REX-behandelten Embryonen zeigten die Suppression dieser Transkripte. Alle Graphen werden mit Mittelwert ± REM dargestellt. Die p-Werte wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA (blau) und einem zweiseitigen Student-t-Test (schwarz) berechnet. Diese Abbildung wurde von Poganik et al.7 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> Abbildung 5: Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbeassay. (A,B) Repräsentative Bilder von Embryonen, die entweder (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA oder (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA exprimieren, immungefärbt mit Anti-HA und sekundärem Antikörper, der mit AlexaFluor568 konjugiert ist. mRNA-injizierte Fische wurden mit altersgleichen, nicht injizierten Fischen verglichen. (C) Quantifizierung des Anti-HA-Signals in (A,B). (D) Repräsentative Bilder von Embryonen, die Halo-TeV-Keap1 (WT) oder Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) exprimieren, immungefärbt mit Anti-Halo und sekundären Antikörpern, die mit AlexaFluor647 konjugiert sind. mRNA-injizierte Fische wurden mit altersgleichen, nicht injizierten Fischen verglichen. (E) Quantifizierung des Anti-Halo-Signals in D. p-Werte wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test berechnet. (F) Tg(lyz:TagRFP)-Embryonen, die Z-REX ausgesetzt waren, wurden mit Anti-RFP und antiaktiver Caspase 3 sowie entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern co-immungefärbt. Der weiße Kasten markiert den vergrößerten Bereich. Weiße Pfeile zeigen Kolokalisationen von neutrophilen Granulozyten und aktiver Caspase 3 an. Maßstabsbalken: 500 μm. Alle Graphen werden mit Mittelwert ± REM dargestellt. Diese Abbildung wurde von Poganik et al.7 modifiziert. und Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Liste der in dieser Studie verwendeten Puffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) ist eine auf chemischer Biologie basierende Methode zur Untersuchung reaktiver niedermolekularer Signalwege. Diese Technik kann auf lebende Fische in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden. Hier koppeln wir Standard-Assays im Zebrafisch mit Z-REX für die Analyse des Signalwegs.

Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Mit Hilfe von Z-REX können Forscher untersuchen, wie sich einzelne Signalantworten als Reaktion auf einen bestimmten reaktiven Liganden verändern, der unter physiologischen Bedingungen in Zebrafischlarven mit einem bestimmten Protein interagiert, das für nahe physiologische Bedingungen von Interesse ist. Konventionelle Methoden wie Bulk-Dosen reaktiver kleiner Moleküle, die Targets und Toxizität verursachen und keine Kontrolle über die Spezifität des Liganden-Targets ermöglichen. Z-REX kann ein spezifisches Liganden-Target-Engagement mit einem bestimmten Phänotyp mit hoher räumlich-zeitlicher Präzision verknüpfen.Wir haben kürzlich gezeigt, wie ein reaktiver Metabolit HNE, ein assoziiertes Ziel und ein Signalweg, der von Z-REX entdeckt wurde, die Entwicklung von Präzisionsisoform-spezifischen Kinase-Inhibitoren gegen dreifach negative Brustkrebsarten ermöglicht. Beginnen Sie damit, die Embryonen in den Rillen einer Injektionsplatte auszurichten, die mit frischer 10%Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt ist. Tauchen Sie die Nadelspitze in das Medium und wenden Sie bei Bedarf Injektionsimpulse an, um Luftblasen in der Spitze zu entfernen Um den Embryo zu injizieren, dringen Sie mit einer einzigen Bewegung in das Chorion und den Dottersack ein und setzen Sie einen Injektionsimpuls ein.Nachdem Sie die anderen Embryonen injiziert haben, spülen Sie sie mit einer Spritzflasche in eine neue Petrischale mit frischem HBSS-Medium. Fassen Sie die nicht injizierten Embryonen in einer anderen Platte zusammen. Um eine Analyse der Z-REX-Behandlung durchzuführen, verteilen Sie zunächst die injizierten Embryonen in 10-Zentimeter-Schalen.Ersetzen Sie in einem dunklen Raum mit rotem Licht das Medium durch 30 Milliliter 10%HBSS mit oder ohne ein Mikromolar der REX-Sonde. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius im Dunkeln. Tauschen Sie 30 Stunden nach der Düngung das Medium im Dunkeln aus.Nach zweimaliger Wiederholung der Inkubation und des zweimaligen Austauschs des Mediums werden die Embryonen dem Licht einer vorgewärmten UV-Lampe ausgesetzt, die alle 30 Sekunden wirbelt. Um einen phänotypischen Test durchzuführen, entfernen Sie die unbefruchteten oder toten Embryonen von der Platte, auf der sich die betäubten Embryonen befinden. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette das Chorion der Embryonen.Die Embryonen werden auf eine 2%Agaroseplatte gelegt, die mit 10%HBSS-Medium präpariert wurde, und unter einem Stereomikroskop betrachtet. Verwenden Sie ImageJ, um die Anzahl der Neutrophilen und Makrophagen jedes Fisches zu zählen. Wählen Sie die Freihandauswahl aus, umkreisen Sie den ganzen Fisch und wählen Sie dann die Option Maxima suchen, um die fluoreszierenden Zellen zu zählen In der vorliegenden Studie zeigten Z-REX-behandelte Embryonen einen Verlust von Neutrophilen und Makrophagen.Dieser Effekt fehlte in den unbehandelten Gruppen. Der Apoptose-Signalweg wurde in der Halo-P2A-Keap1-Gruppe nicht ausgelöst, was zu unveränderten Makrophagen- und Neutrophilenspiegeln führte. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Halo-TEV-Keap1-Mutante beobachtet, die nicht auf die HNE reagierte.Transkriptionelle und quantitative real-time PCR-Analysen zeigten eine Herunterregulierung immunrelevanter Gene und eine Hochregulation antioxidativer Gene nach Z-REX. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass das P2A-Split-Konstrukt doppelt so viele HA-Tags aufwies wie das TeV-Fusions-Konstrukt, was auf ähnliche Expressionsniveaus hindeutet. Auch die Expressionsniveaus des Wildtyps und des Mutantentyps Halo-TeV-Keap1 waren ähnlich.In der Z-REX-behandelten transgenen Neutrophilen-Reporterlinie wurde auch eine Kolokalisation von Neutrophilen und aktiver Caspase 3 beobachtet. Das Wichtigste ist, dass Sie Ihre Dokumente richtig eingerichtet haben. Eine Begrenzung wird Ihre Ergebnisse wirklich verbessern.Wir haben Z-REX, eine Idee, in eine Drogenscreening-Plattform namens Localis-REX übernommen. Keine andere Technik war bisher in der Lage, eine solche lokalspezifische und reaktive Liganden- oder Target-Kartierung zu erreichen. Es hat uns geholfen, elektrophile Wirkstoffkandidaten für die Behandlung von Brustkrebs zu entwickeln.Angesichts der wachsenden Bedeutung lokalisierter Signalübertragung in vielen Bereichen, Krebs, Immunologie, Alterung usw., verspricht Z-Rex, das einzige Werkzeug, das in der Lage ist, die lokalisierten reaktiven Liganden-gerichteten Ereignisse zu kartieren, zahlreichen Bereichen zu helfen.

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Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten

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