Netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung des Wirkungsmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome

Traditionelle Chinesische Medizin, Wir werden über die Eigenschaften der Mehrkomponentenkomponente des Ziels sprechen. Das ist die grundlegende Box für Netzwerk- und biologische Forschung. Wir haben eine Demonstration der Technologie durchgeführt, die die Schwelle senken wird.

Network Pharmacological ist eine systematische analytische Technologie, die die Werkzeuge der Interaktionsnetzwerkarbeit von Multifaktoren aufbaut. Die Daten von Network Pharmacological stammen aus der Datenbank, obwohl sie die Beziehung zu Medikamenten und Proteinen nicht vorhersagen können, und dies muss noch durch nachfolgende Experimente überprüft werden. Öffnen Sie zunächst die HERB-Datenbank und verwenden Sie Gua Liu und Zhebimu als Schlüsselwörter, um die Bestandteile der beiden Medikamente zu erhalten.

Laden Sie die Liste und die kanonische SMILES-Struktur der verwandten Komponenten der beiden Medikamente herunter. Bestimmen Sie nun, ob die erhaltene Komponente aktiv ist, indem Sie Komponenten mit oraler Bioverfügbarkeit und wirkstoffähnlichen Werten in die HERB-Gruppendatenbank aufnehmen. Wenn die Komponente keine orale Bioverfügbarkeit und keine wirkstoffähnlichen Werte aufweist, geben Sie die Komponente in die Schweizer ADME-Datenbank ein, um die Informationen zu jeder Komponente zu erhalten.

Nehmen Sie Komponenten mit hoher GI-Absorption und mindestens zwei ja, wirkstoffähnlichen Werten als Wirkstoffe auf. Um das Ziel der aktiven Komponenten vorherzusagen, öffnen Sie die HERB-Datenbank. Suchen und kopieren Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten.

Öffnen Sie dann den Ähnlichkeits-Ensemble-Ansatz und fügen Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten in das Suchfeld ein. Klicken Sie auf "SEA" ausprobieren, um den Zielschlüssel, den Zielnamen, den P-Wert und die maximale TC jeder aktiven Komponente zu erhalten. Kopieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation und verwenden Sie die Filterfunktion für Tabellenkalkulationsdateien, um die aktiven Komponentenziele nach Zielschlüssel zu filtern.

Kopieren Sie alle Ziele in eine Tabelle und entfernen Sie die Duplikate, um die Wirkstoffziele zu erhalten. Öffnen Sie nun die Genkartendatenbank und die Mendelsche Vererbung beim Menschen, um Krankheitsziele vorherzusagen. Verwenden Sie Lungenadenokarzinom'als Schlüsselwort, um die Krankheitsziele des Lungenadenokarzinoms zu erhalten.

Laden Sie die Tabellen der Krankheitsziele herunter und löschen Sie die wiederholten Ziele, um die Ziele für das Lungenadenokarzinom zu erhalten. Konstruieren Sie ein Zielnetzwerk für Arzneimittelkomponentenkrankheiten, indem Sie die Zielmoleküle für Lungenadenokarzinome und Arzneimittelziele in dieselbe Spalte in einer neuen Tabelle kopieren. Verwenden Sie die Funktion zur Identifizierung von Datenduplikaten in der Symbolleiste, um Schnittpunkte der Ziele für Lungenadenokarzinome und der aktiven Komponenten von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia zu erhalten.

Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0. Klicken Sie in der Menüleiste auf Datei und wählen Sie Importieren. Gefolgt von Netzwerk aus Datei.

Um die Tabellenkalkulationsdatei zu importieren, optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung. Verwenden Sie die Funktion "Netzwerk analysieren" für die Analyse der Netzwerk-Topologie. Klicken Sie in der Menüleiste auf Extras und wählen Sie Netzwerk analysieren.

Klicken Sie im Tabellenbereich auf den Grad in der Titelleiste, um die Komponenten nach Grad in absteigender Reihenfolge anzuordnen. Nehmen Sie die Top-10-Komponenten und -Ziele als die wichtigsten aktiven Komponenten und Kernziele. Aufbau des PPI-Netzwerks und Screening der Kernproteine.

Öffnen Sie die Zeichenfolgendatenbank und fügen Sie die Liste der potenziellen Ziele von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia gegen Lungenadenokarzinome in das Dialogfeld der Namensliste ein. Dann selektieren Sie Homosapiens in Organismen. Klicken Sie auf "Suchen" und wählen Sie die Schaltflächen "Weiter" aus. Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf "Einstellungen" Und kreuzen Sie hohe Konfidenz 0,700 an In den Grundeinstellungen unter "Mindestens erforderlicher Interaktionswert" aktivieren Sie in den erweiterten Einstellungen die Option "Hohe getrennte Knoten im Netzwerk".

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Aktualisieren. Klicken Sie anschließend in der Titelleiste auf Exporte und laden Sie den kurzen tabellarischen Text der PPI-Beziehung im TSV-Format herunter. Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0.

Klicken Sie auf Datei, auswählen, importieren, gefolgt von Netzwerk aus Datei, um die Datei im TSV-Format für die visuelle Analyse zu importieren. Verwenden Sie die Netzwerkanalysefunktion, um die topologische Analyse durchzuführen. Optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung.

Führen Sie eine KEGG-Anreicherungsanalyse durch, indem Sie die Medscape-Plattform öffnen, die Liste der potenziellen therapeutischen Ziele im Textformat in das Dialogfeld einfügen und dann auf die Schaltfläche "Senden" klicken. Kreuzen Sie Homo sapiens sowohl in der Eingabe als Spezies als auch in der Analyse als Spezies anund klicken Sie dann auf die Schaltfläche Benutzerdefinierte Analyse. Wählen Sie Anreicherung aus.

Kreuzen Sie nur den KEGG-Pfad an und klicken Sie dann auf Anreicherungsanalyse. Sobald der Fortschrittsbalken 100 % erreicht, klicken Sie auf die orangefarbene Schaltfläche der Analyseberichtsseite, um die Anreicherungsergebnisse anzuzeigen. Klicken Sie auf alles in einer Zip-Datei'um das Anreicherungsergebnis herunterzuladen, und öffnen Sie dann die _FINAL_GO'csv-Datei im Ordner Enrichment_GO', um das Ergebnis zu erhalten.

Öffnen Sie die R-Software und geben Sie install package GG plot two' und die Bibliothek GG Plot two'in R ein Für die Installation des GG plot two R-Pakets. Drücken Sie die Eingabetaste, um das KEGG-Visualisierungsprogramm auszuführen. Um die Lebensfähigkeit der Zellen nachzuweisen, verdauen Sie die logarithmische Wachstumsphase A 549 Zellen mit einem Milliliter 0,25%Trypsin für eine Minute bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie einen Milliliter DMEM Complete Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und blasen Sie es sanft, um die Zellablösung zu fördern. Zentrifugieren Sie dann die Mischung, um das Zellpellet zu erhalten, und resuspendieren Sie die erhaltenen Zellen mit DMEM-Komplettmedium. Geben Sie die Zellsuspension in ein Hämozytometer und zählen Sie sie mit einem automatisierten Zellzähler, verdünnen Sie sie auf fünf mal 10 bis vierte Zellen pro Milliliter mit DMEM-Komplettmedium Lösen Sie nun ein Gramm Trichosanthes Fritillaria Thunbergia Wasserextrakt in 10 Millilitern PBS auf und filtern Sie es durch einen 0,22-Mikrometer-Filter.

Verdünnen Sie das Gemisch mit PBS auf unterschiedliche Konzentrationen. 100 Mikroliter der verdünnten Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben. Nach der Zelladhärenz fügen Sie einen Mikroliter Trichosanthes Fritillaria Thunbergia Wasserextrakte in verschiedenen Konzentrationen hinzu, um die Konzentration jeder Vertiefung anzupassen.

Entsorgen Sie das ursprüngliche Medium nach 24 Stunden Kultur und fügen Sie 100 Mikroliter DMEM hinzu. Basismedium für die weitere Inkubation für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Fügen Sie am Ende der Inkubation 20 Mikroliter MTS-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für eine weitere Stunde.

Übertragen Sie die inkubierte Mischung auf einen anderen Teller. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 Nanometern und berechnen Sie die Zellviabilität. Verdünnen Sie die logarithmische Wachstumsphase A 549 Zellen auf fünf mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter.

Gib zwei Milliliter der Zellsuspension auf eine Platte mit sechs Wells und züchte sie 12 Stunden lang. Nachdem Sie verschiedene PBS-Verdünnungen von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Wasserextrakt erhalten haben, wie zuvor gezeigt, werden 20 Mikroliter der PBS-Lösung in die Blindkontrollgruppe und 20 Mikroliter der verschiedenen Verdünnungen von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Wasserextrakt in eine andere Konzentrationsgruppe gegeben. Nach 24 Stunden des Eingriffs wird der Überstand verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gereinigt.

Geben Sie 250 Mikroliter RIPA-Puffer in jede Vertiefung und lysieren Sie die Zellen 30 Minuten lang. Sammeln Sie das Lysat für die Zentrifugalisierung und erhalten Sie den Überstand. Das Interaktionsnetzwerk von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia gegen das Lungenadenokarzinom wird gezeigt.

Im Interaktionsnetzwerk sind die Top 10 der erhaltenen Wirkstoffe die wichtigsten aktiven Komponenten der Wirkung von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms. Das PPI-Netzwerk umfasste 122 funktionelle Proteine und 210 Interaktionsbeziehungen. Die Top-10-Kernproteine sind hauptsächlich an der Neovaskularisation, Zellproliferation, Apoptose und dem Zellmembrantransport beteiligt.

Von den 20 wichtigsten Signalwegen, die von KEGG eingestuft werden, stehen der PI3K-AKT-Signalweg, der Rap1-Signalweg, der Phospholipase-D-Signalweg und der MAPK1-Signalweg in engem Zusammenhang mit Lungenkrebs, wobei der PI3K-AKT-Signalweg den ersten Platz belegte. Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Extrakte in Konzentrationen über 400 Mikrogramm pro Milliliter konnten die Zellproliferation hemmen, und die Hemmwirkung auf A-549-Zellen bei Konzentrationen von bis zu 800 Mikrogramm pro Milliliter lag nahe der Hälfte der hemmenden Konzentration. Die Intervention von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Extrakten führte zu keiner signifikanten Veränderung der AKT-Proteinexpression in jeder Gruppe.

Die Expression von p-AKT Serin-473 war jedoch gehemmt und zeigte einen dosisabhängigen Effekt. Die kritischen Komponenten von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia waren molekular an die Schlüsselproteine des PI3K-AKT-Signalwegs angedockt, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bindungsenergien von Diosmetin und Kaempferol mit AKT1 weniger als minus sieben betrugen, was auf eine starke Bindungsaktivität hindeutet. Das Wichtigste ist, Wirkstoffe auf den Zielen der Traditionellen Chinesischen Medizin erreicht zu haben.

Sowie deren Ziele der Kern von Network Pharmacological.