Name: Netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung des Wirkungsmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Erfahren Sie die netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung des Wirkungsmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome. Diese Methode nutzt den PI3K/AKT-Signalweg.

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Diese Studie wurde durch das Innovation Training Program der Beijing University of Chinese Medicine (Nr.: 202110026036) unterstützt.

Alle netzwerkpharmakologischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für netzwerkpharmakologische Bewertungsmethoden18 durchgeführt. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Labormanagementvorschriften der Pekinger Universität für Chinesische Medizin durchgeführt.
1. Pharmakologische Vorhersage des Netzwerks
<ol><li>Auswahl der aktiven Komponenten<ol><li>Öffnen Sie die HERB-Datenbank (http://herb.ac.cn)19 und verwenden Sie "Gualou" (der chinesische Name für Trichosanthes kirilowii Maxim) und "Zhebeimu" (der chinesische Name für Bulbus Fritillariae thunbergii) als Schlüsselwörter, um die Bestandteile der beiden Arzneimittel zu erhalten. Laden Sie die Liste und die kanonischen SMILES-Strukturen der verwandten Komponenten der beiden Medikamente herunter.</li>
		<li>Bestimmen Sie, ob es sich bei der erhaltenen Komponente um die aktive Komponente handelt.<ol><li>Nehmen Sie als aktive Komponenten diejenigen auf, die orale Bioverfügbarkeitswerte (OB) und medikamentenähnliche (DL) Werte in der HERB-Gruppendatenbank aufweisen (d. h. Komponenten mit OB-≥ 30 % und DL-≥ 0,18)20,21.</li>
			<li>Wenn die Komponente keine OB- und DL-Werte aufweist, geben Sie die Komponente in die Schweizer ADME-Datenbank (http://www.swissadme.ch/index.php)22 ein, um die Informationen zu jeder Komponente zu erhalten. Nehmen Sie Komponenten mit "hoher" GI-Absorption und mindestens zwei "Ja"-DL-Werten als aktive Komponenten auf.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Zielvorhersage der aktiven Komponenten<ol><li>Öffnen Sie die HERB-Datenbank (http://herb.ac.cn). Suchen und kopieren Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten.</li>
		<li>Öffnen Sie die SEA-Datenbank (Similarity Ensemble Approach, http://sea.bkslab.org)23. Fügen Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten in das Suchfeld ein und klicken Sie auf SEA testen , um den Zielschlüssel, den Zielnamen, den p-Wert und die MaxTC jeder aktiven Komponente zu erhalten.</li>
		<li>Kopieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation und verwenden Sie die Filterfunktion der Tabellenkalkulationsdatei, um die Ziele der aktiven Komponenten nach Zieltaste (Mensch, P < 0,05 und MaxTC > 0,5) zu filtern.</li>
		<li>Kopieren Sie alle Ziele in eine Tabelle und entfernen Sie die Duplikate, um die Drogenziele zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorhersage von Krankheitszielen<ol><li>Öffnen Sie die GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org)24 und die Online-Datenbank Mendelian Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 und verwenden Sie Lungenadenokarzinom als Schlüsselwort, um die Krankheitsziele des Lungenadenokarzinoms zu erhalten.</li>
		<li>Laden Sie die Tabellen der Krankheitsziele herunter. Löschen Sie die wiederholten Ziele, um die LUAD-Ziele zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbau eines Drug-Component-Disease-Target-Netzwerks<ol><li>Kopieren Sie die LUAD-bezogenen Ziel- und Arzneimittelziele in dieselbe Spalte in einer neuen Tabelle. Verwenden Sie die Funktion Daten - Duplikate identifizieren in der Symbolleiste, um Schnittziele der LUAD-bezogenen Ziele und der aktiven Komponentenziele von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii zu erhalten.</li>
		<li>Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0. Klicken Sie in der Menüleiste auf Datei und wählen Sie dann > Netzwerk aus Datei importieren, um die Tabellenkalkulationsdatei zu importieren. Optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung.</li>
		<li>Verwenden Sie die Funktion Netzwerk analysieren für die Analyse der Netzwerktopologie. Klicken Sie in der Menüleiste auf Extras , und wählen Sie dann Netzwerk analysieren aus. Klicken Sie im Bereich Tabelle in der Titelleiste auf Grad, um die Komponenten nach Grad in absteigender Reihenfolge anzuordnen. Nehmen Sie die zehn wichtigsten Komponenten und Ziele als die wichtigsten aktiven Komponenten und Kernziele.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbau des PPI-Netzwerks und Screening der Kernproteine<ol><li>Öffnen Sie die STRING-Datenbank (https://cn.string-db.org/)26. Fügen Sie die Liste der potentiellen Ziele von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen LUAD im Textformat in das Dialogfeld Namensliste ein. Wählen Sie Homo sapiens in Organismen aus und klicken Sie auf die Schaltflächen SUCHEN > WEITER .</li>
		<li>Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf Einstellungen und aktivieren Sie Hohe Konfidenz (0,700) in den Grundeinstellungen > Mindestens erforderliche Interaktionsbewertung. Setzen Sie ein Häkchen bei Getrennte Knoten im Netzwerk ausblenden in den erweiterten Einstellungen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche AKTUALISIEREN .</li>
		<li>Klicken Sie in der Titelleiste auf Exporte und laden Sie den kurzen Tabellentext der PPI-Beziehung im TSV-Format herunter.</li>
		<li>Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0. Klicken Sie auf Datei > > Netzwerk aus Datei importieren, um die Datei im TSV-Format für die visuelle Analyse zu importieren.</li>
		<li>Verwenden Sie die Funktion Netzwerkanalysator , um die topologische Analyse durchzuführen. Optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der KEGG-Anreicherung<ol><li>Öffnen Sie die Metascape (https://metascape.org/)27-Plattform. Fügen Sie die Liste der potenziellen therapeutischen Ziele im Textformat in das Dialogfeld ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Senden. Kreuzen Sie H. sapiens sowohl in der Eingabe als Art als auch in der Analyse als Art an und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Benutzerdefinierte Analyse. Wählen Sie Anreicherung, markieren Sie nur den KEGG-Pfad und klicken Sie dann auf Anreicherungsanalyse. Nachdem der Fortschrittsbalken 100 % erreicht hat, klicken Sie auf die orangefarbene Schaltfläche Analyseberichtsseite, um die Anreicherungsergebnisse anzuzeigen.</li>
		<li>Klicken Sie auf All in One Zip File , um das Anreicherungsergebnis herunterzuladen, und öffnen Sie dann die Datei _ FINAL_GO.csv im Ordner Enrichment_GO , um das Ergebnis zu erhalten.</li>
		<li>Öffnen Sie die R-Software (https://cran.r-project.org/). Geben Sie install.package (" ggplot2") und library (ggplot2) in R ein, um das Paket ggplot2 R zu installieren. Drücken Sie die Eingabetaste , um das KEGG-Visualisierungsprogramm auszuführen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Experimentelle Verifizierung
<ol><li>Herstellung von Medikamenten HINWEIS: Fritillaria thunbergii Miq und Trichosanthes kirilowii Maxim wurden vom Dongzhimen Hospital gekauft, das der Pekinger Universität für Chinesische Medizin angegliedert ist.<ol><li>Mischen Sie 50 g Fritillaria thunbergii Miq und 50 g Trichosanthes kirilowii Maxim. Die Mischung 20 Minuten in 1 l destilliertem Wasser einweichen und dann 1 Stunde lang bei 100 °C unter Normaldruck abkochen.</li>
		<li>Filtern Sie den Sud, um ein Filtrat mit einer doppelten Schicht steriler medizinischer Gaze zu erhalten, und verwenden Sie dann 80 μm Filterpapier, um den Extrakt weiter zu filtern. Wiederholen Sie den obigen Vorgang dreimal.</li>
		<li>Mischen Sie das Filtrat zusammen, um eine Abkochung von ca. 1,2 l zu erhalten. Geben Sie die Lösung in den Kolben eines Rotationsverdampfers. Stellen Sie die Drehzahl auf 50 U/min bei einer Temperatur von 37 °C ein. Mischen und kondensieren Sie die Abkochungen 6 h lang im Rotationsverdampfer zu einem Extrakt, um eine viskose Flüssigkeit zu erhalten.</li>
		<li>Schalten Sie den Vakuum-Gefriertrocknungsmechanismus ein, um die Temperatur auf −40 °C vorzukühlen. Geben Sie den erhaltenen Extrakt in die Materialschale und legen Sie ihn zum Einfrieren in die Kühlfalle.</li>
		<li>Wenn die Kühlfallentemperatur −50 °C erreicht und das Material 2 Stunden lang gefroren war, geben Sie das gefrorene Material auf einen Trockengestell, der in der Kühlfalle platziert ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Gefriertrocknungsprozess zu starten. Nehmen Sie das gefriergetrocknete Pulver heraus und lagern Sie es für die spätere Verwendung im Kühlschrank bei −20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Zellkultivierung<ol><li>Konfigurieren Sie das DMEM-Komplettmedium mit 89 % DMEM-Basismedium, 10 % fetalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin.</li>
		<li>Nachdem Sie die A549-Zellen aus flüssigem Stickstoff entfernt haben, inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad und rühren Sie, bis das Medium in der Durchstechflasche schmilzt.</li>
		<li>Geben Sie ein vierfaches Volumen DMEM-Komplettmedium in die geschmolzenen Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellen (4 °C, 679 x g, 5 min) und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die ausgefällten Zellen mit 6 mL DMEM-Komplettmedium, legen Sie sie in einen T25-Kulturkolben und inkubieren Sie den Kolben in einem Zellinkubator bei 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachweis der Zellviabilität<ol><li>Die logarithmischen A549-Zellen der Wachstumsphase werden mit 1 ml 0,25%igem Trypsin für 1 min bei 37°C aufgeschlossen. Fügen Sie 1 ml DMEM-Komplettmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und blasen Sie es vorsichtig, um die Zellablösung zu fördern. Zentrifugieren Sie die Mischung, um das Zellpellet zu erhalten (4 °C, 192 x g, 5 min). Resuspendieren Sie die erhaltenen Zellen mit DMEM-Komplettmedium.</li>
		<li>Geben Sie die Zellsuspension in ein Hämozytometer und zählen Sie mit einem automatisierten Zellzähler. Verdünnen Sie es auf 5 x 104 Zellen/ml mit DMEM-Komplettmedium.</li>
		<li>Lösen Sie 1 g Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-Wasserextrakt in 10 ml PBS-Lösung auf und filtern Sie ihn durch einen 0,22-μm-Filter. Verdünnen Sie die Mischung mit PBS auf 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml und 10 mg/ml.</li>
		<li>Die verdünnten Zellen werden auf 96-Well-Platten mit 100 μL pro Well plattiert. Nach der Zelladhärenz fügen Sie 1 μl Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Wasserextrakte in verschiedenen Konzentrationen hinzu, um die Konzentration jeder Vertiefung auf 900 μg/ml, 800 μg/ml, 700 μg/ml, 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/ml, 200 μg/ml und 100 μg/ml einzustellen.</li>
		<li>Das ursprüngliche Medium wird nach 24 h Kultur verworfen und 100 μl DMEM-Basismedium für die weitere Inkubation von 2 h bei 37 °C, 5 % CO2, hinzugefügt.</li>
		<li>Nach der oben genannten Behandlung fügen Sie 20 μl MTS-Lösung hinzu (Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie die Zellen für weitere 1 Stunde bei 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Übertragen Sie die inkubierte Mischung auf einen anderen Teller. Messen Sie die Absorption (OD) bei einer Wellenlänge von 490 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Berechnen Sie die Zellviabilität mit der folgenden Formel: Viabilität (%) = 100 × (OD der behandelten Probe − OD des Mediums)/(OD der Kontrollprobe − OD des Mediums). Anmerkungen: Eine Mindestkonzentration in der Nähe von IC50 ist als hohe Dosis definiert. Die Konzentration, bei der die Zellproliferation gehemmt wird, wird als niedrig dosierte Konzentration und der Zwischenwert als mittlere Dosiskonzentration für nachfolgende experimentelle Studien definiert. In dieser Studie wurden 400 μg/ml, 600 μg/ml und 800 μg/ml als niedrige, mittlere und hohe Dosen verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Drogenintervention und Probenentnahme HINWEIS: Das Zellwachstum wurde gegen die Zeit aufgetragen, um die logarithmische Phase zu bestimmen.<ol><li>Die logarithmischen A549-Zellen der Wachstumsphase werden auf 5 x 105 Zellen/ml verdünnt. Geben Sie 2 ml der Zellsuspension in eine 6-Well-Platte und züchten Sie sie 12 Stunden lang.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.3, um 80 mg/ml, 60 mg/ml und 40 mg/ml PBS-Verdünnungen von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-Wasserextrakt zu erhalten. Fügen Sie 20 μl der PBS-Lösung, 20 μl des 40 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-Wasserextrakts, 20 μl des 60 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-Wasserextrakts und 20 μl des 80 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-Wasserextrakts in die Blindkontrollgruppe, die Gruppe mit niedriger Konzentration, die Gruppe mit mittlerer Konzentration und die Gruppe mit hoher Konzentration hinzu. beziehungsweise. Verwerfen Sie den Überstand nach 24 Stunden des Eingriffs und reinigen Sie die Zellen dreimal mit PBS. HINWEIS: Die Konzentrationen der Blindkontrollgruppe, der Gruppe mit niedriger Konzentration, der Gruppe mit mittlerer Konzentration und der Gruppe mit hoher Konzentration von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Wasserextrakt betrugen 0 μg/ml, 400 μg/ml, 600 μg/ml bzw. 800 μg/ml.</li>
		<li>Geben Sie 250 μl RIPA-Puffer (enthält 1 % PMSF und 1 % Phosphatase-Hemmer) in jede Vertiefung und lysieren Sie die Zellen 30 Minuten lang. Sammeln Sie das Lysat für die Zentrifugation (4 °C, 6,714 x g, 10 min) und erhalten Sie den Überstand.</li>
	</ol></li>
	<li>Western-Blotting<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Proben mit der BCA-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie RIPA-Puffer, um die Konzentration jeder Probe so einzustellen, dass sie konsistent ist.</li>
		<li>Mischen Sie 40 μl der Proteinprobe mit 10 μl 5-fachem Beladungspuffer und kochen Sie sie 5 Minuten lang bei 100 °C. Zentrifugieren (4 °C, 6,714 x g, 10 min) der Mischung, um den Überstand für nachfolgende Experimente zu erhalten.</li>
		<li>Isolieren Sie die Proteine durch Gelelektrophorese mit 120 V vertikaler Elektrophorese.</li>
		<li>Bereiten Sie ein elektrisches "Sandwich" vor (Schwamm - Filterpapier - Gel - PVDF-Membran - Filterpapier - Schwamm). Weichen Sie die Transferapparatur in einem Eisbad ein und übertragen Sie das Protein 60 Minuten lang bei 70 V auf PVDF-Membranen.</li>
		<li>Verwenden Sie 100 ml TBST-Lösung (0,05 % [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) und 5 g Magermilchpulver, um 5 % Milch zu konfigurieren. Die AKT- und p-AKT-Antikörper werden mit dem Antikörperverdünnungsmittel im Verhältnis 1:1.000 vorverdünnt.</li>
		<li>Blockieren Sie die PVDF-Membran in 5%igem Magermilchpulver für 1 Stunde unter Schütteln. Nach dem Blocken wird die Blockiermilch verworfen und der verdünnte Primärantikörper zur Inkubation über Nacht bei 4 °C hinzugefügt.</li>
		<li>Nachdem Sie den primären Antikörper entfernt haben, waschen Sie die PVDF-Membran mit TBST-Lösung fünfmal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Den sekundären Antikörper mit dem Antikörperverdünnungsmittel im Verhältnis 1:5.000 vorverdünnen. Fügen Sie den sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie ihn 1,5 h lang bei Raumtemperatur (RT). Nachdem Sie den sekundären Antikörper entfernt haben, waschen Sie die PVDF-Membran mit TBST-Lösung fünfmal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Weisen Sie das Protein mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem nach.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Molekulares Andocken
<ol><li>Öffnen Sie die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org)28. Geben Sie die Zielsymbole in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Schaltfläche SUCHEN . Klicken Sie in der Unterüberschrift Struktur auf Download , um die 3D-Strukturen der Proteintargets anzuzeigen.</li>
	<li>Öffnen Sie die RCSB-PDB-Datenbank (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Geben Sie den Namen der Proteinmakromoleküle in das Suchfeld ein. Laden Sie die Protein-Makromolekülstrukturen im PDB-Format herunter.</li>
	<li>Laden Sie das Installationspaket der UCSF Chimera 1.16-Software (https://vina.scripps.edu/) und AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/) herunter. Installieren und öffnen Sie die UCSF Chimera 1.16-Software. Klicken Sie auf Datei > Öffnen , um das Rezeptorprotein anzuzeigen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Werkzeuge > Strukturbearbeitung > Dock-Vorbereitung und aktivieren Sie im Popover Lösungsmittel löschen, Wasserstoff hinzufügen und Ladungen hinzufügen , um Wasser zu entfernen und Hydrierungs- und Ausgleichsladungen hinzuzufügen. Klicken Sie auf Mol2-Datei schreiben , um das Rezeptorprotein im mol2-Format zu speichern. Führen Sie den gleichen Schritt für den Liganden durch.</li>
	<li>Klicken Sie auf Datei > Öffnen , um den Liganden im mol2-Format in der UCSF Chimera 1.16-Software anzuzeigen. Legen Sie unter Tools > Oberflächen-/Bindungsanalyse > AutoDock Vina den Rezeptorbalken auf den Namen des Rezeptorproteins und den Ligandenbalken auf den Namen des Liganden fest. Geben Sie einen Wert in das Feld hinter Mitte und Größe ein, um den neu entwickelten Raum anzupassen, so dass der Ligand und der Rezeptor vollständig umschlossen werden können.</li>
	<li>Klicken Sie auf OK für das virtuelle Screening des molekularen Dockings, um die optimale Position für die Bindung des Liganden an den Rezeptor zu ermitteln. Notieren Sie den Bindungsenergiewert an der optimalen Position.</li>
</ol>4. Statistische Analyse
<ol><li>Öffnen Sie die Statistiksoftware SPSS 26.0. Klicken Sie auf Datei > Daten importieren , um Daten zu laden.</li>
	<li>Stellen Sie die experimentellen Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dar.</li>
	<li>Vergleichen Sie mehrere Gruppen mit einer einfaktoriellen ANOVA. ANMERKUNG: P < 0,05 wurde in dieser Arbeit als statistisch signifikant angesehen.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Im Allgemeinen umfasst eine vollständige netzwerkpharmakologische Studie die Identifizierung von Wirkstoffen aus Datenbanken, die Erfassung von Zielen, die den Wirkstoffen und Krankheiten entsprechen, den Aufbau eines Netzwerks von Wirkstoffkomponenten-Krankheitszielen und die Vorhersage von Kernzielen und -wegen. Die Assoziation zwischen Wirkstoffen und Kernproteinen (molekulares Docking) wird mit Hilfe von Computertechnik vorläufig vorhergesagt und die abschließende Verifizierung mit einem Experiment durchgeführt.
...

Lungenkrebs bezieht sich auf bösartige Tumoren, die von der Bronchialschleimhaut der Lunge ausgehen, einschließlich Plattenepithelkarzinom, Adenokarzinom, großzelligem Karzinom und kleinzelligem Karzinom1. Das Lungenadenokarzinom (LUAD) ist die häufigste Form von Lungenkrebs und macht etwa 40 % aller Lungenkrebsfälleaus 2. Die meisten Patienten werden in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert oder haben Fernmetastasen und verlieren so die Möglichkeit einer Operation3. In der aktuellen klinischen Behandlung ist die gleichzeitige Radiochemotherapie die häufigste Strategie zur Behandlung von LUAD, ihre Anwendung ist jedoch aufgrund schwerwiegender Nebenwirkungen begrenzt4.
Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) kann die klinischen Symptome von LUAD-Patienten wirksam lindern und die durch Strahlen- und Chemotherapie verursachten Nebenwirkungen reduzieren und ist damit zu einem Forschungs-Hotspot geworden 5,6,7. In der traditionellen chinesischen Medizin gehört Lungenkrebs in die Kategorie der "Lungenansammlung" und "Lungensteinwasser". Der Mangel an Qi und das Zusammenspiel von Schleim, Stase und Gift sind wichtig für die Pathogenese von Lungenkrebs. Daher sind die Tonisierung des Qi und die Beseitigung von Schleim und Blutstau die wichtigsten klinischen Behandlungsmethoden8 für Lungenkrebs gemäß der TCM-Theorie9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) und Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) stellen ein häufiges Medikamentenpaar bei der Behandlung von Lungenkrebs dar, und diese Kombination hat die Wirkung, die Hitze zu beseitigen und den Schleim zu reduzieren10,11,12. Der Wirkmechanismus ist jedoch noch unklar, und es muss noch weiter geforscht werden.
Die Netzwerkpharmakologie ist eine umfassende, auf der Theorie der Systembiologie und der multidirektionalen Pharmakologie basierende Methode, die darauf abzielt, komplexe Netzwerkbeziehungen zwischen mehreren Medikamenten und Krankheiten aufzudecken13. Traditionelle chinesische Verschreibungen haben die Eigenschaften, dass sie Mehrkomponenten- und Multi-Target-Verschreibungen sind, was bedeutet, dass sie sich sehr gut für das Studium der Netzwerkpharmakologie eignen14,15. In jüngster Zeit hat sich die Netzwerkpharmakologie zu einem leistungsstarken Ansatz bei der Erforschung von TCM-Rezepturen entwickelt und ist zu einem Forschungs-Hotspot geworden16,17.
Nach unserem besten Wissen werden jedoch alle Forschungen zur Netzwerkpharmakologie als Text dargestellt. Die Präsentation dieser Technologie per Video wird die Lernschwelle erheblich verringern und die Förderung dieser Technologie erleichtern, was einer der Vorteile dieses Artikels ist. In dieser Studie haben wir Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome als Beispiel genommen, um eine netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>A549&nbsp; Zelllinie</td><td>Procell</td><td>CL-0016</td><td></td></tr><tr><td>AKT Antikörper</td><td>CST</td><td>4691S</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Solarbio</td><td>PC0020</td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszenz-Nachweissystem</td><td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td><td>ChemiScope 6100</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Kit für erweiterte Chemilumineszenz (ECL)</td><td>ABklonales</td><td>RM00021</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>ScienCell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>MTS Assay Kit</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT Antikörper</td><td>CST</td><td>6040S</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>C14-15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Solarbio</td><td>P0100</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase-Inhibitor</td><td>Beyotime</td><td>P1081</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010 RIPA-Lyselösung</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Solarbio</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory</td><td>RE52CS-1</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Gefriertrocknungsmechanismus</td><td>Ningbo Scientz Biotechnology</td><td>SCIENTZ-10</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktin-Antikörper</td><td>ABklonal</td><td>AC026</td><td></td></tr></tbody></table>

netzwerkpharmakologische vorhersage und experimentelle validierung des wirkungsmechanismus von trichosanthes-fritillaria thunbergii gegen lungenadenokarzinome

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Unser Ziel war es, den Mechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms (LUAD) auf der Grundlage von Netzwerkpharmakologie und experimenteller Verifizierung zu untersuchen. Die wirksamen Komponenten und potentiellen Targets von Trichosanthis und Fritillaria thunbergii wurden mittels Hochdurchsatz-Experiment und referenzgeführter (HERB) Datenbank der Traditionellen Chinesischen Medizin und einer SEA-Datenbank (Similarity Ensemble Approach) gesammelt, und die LUAD-bezogenen Targets wurden von den Datenbanken GeneCards und Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) abgefragt. Ein Drug-Component-Disease-Target-Netzwerk wurde mit der Cytoscape-Software aufgebaut. Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI), Genontologie-Funktionen (GO) und Analysen der Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG)-Signalwege wurden durchgeführt, um Kernziele und Schlüsselsignalwege zu erhalten. Für die anschließende experimentelle Validierung wurden ein wässriger Extrakt aus Trichosanthes-Fritillaria thunbergii und A549-Zellen verwendet. Durch die HERB-Datenbank und die Literaturrecherche wurden 31 wirksame Verbindungen und 157 potenzielle Zielgene von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii untersucht, von denen 144 regulatorische Ziele von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms waren. Die GO-funktionelle Anreicherungsanalyse zeigte, dass der Wirkmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen das Lungenadenokarzinom hauptsächlich in der Proteinphosphorylierung besteht. Die Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs deutete darauf hin, dass die Behandlung des Lungenadenokarzinoms mit Trichosanthes-Fritillaria thunbergii hauptsächlich den PI3K/AKT-Signalweg beinhaltet. Die experimentelle Validierung zeigte, dass ein wässriger Extrakt von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii die Proliferation von A549-Zellen und die Phosphorylierung von AKT hemmen kann. Durch Netzwerkpharmakologie und experimentelle Validierung konnte nachgewiesen werden, dass der PI3K/AKT-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Wirkung von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms spielt.

Insgesamt wurden 31 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-verwandte Wirkstoffe identifiziert, darunter 21 Trichosanthes- und 10 Fritillaria thunbergia-Komponenten, sowie 144 korrespondierende Targets. Insgesamt wurden 9.049 bzw. 67 LUAD-verwandte Gene aus der GeneCards-Datenbank bzw. der OMIM-Datenbank extrahiert. Nach dem Löschen duplizierter Gene konnten 9.057 Gene identifiziert werden, die mit LUAD in Verbindung stehen. Die Überschneidung der LUAD-verwandten Gene und der Trichosanthes-Fr...

Diese Studie enthüllt den Mechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung von Lungenadenokarzinomen auf der Grundlage von Netzwerkpharmakologie und experimenteller Überprüfung. Die Studie zeigt auch, dass der PI3K/AKT-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Wirkung von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms spielt.

Netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung des Wirkungsmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Traditionelle Chinesische Medizin, Wir werden über die Eigenschaften der Mehrkomponentenkomponente des Ziels sprechen. Das ist die grundlegende Box für Netzwerk- und biologische Forschung. Wir haben eine Demonstration der Technologie durchgeführt, die die Schwelle senken wird.Network Pharmacological ist eine systematische analytische Technologie, die die Werkzeuge der Interaktionsnetzwerkarbeit von Multifaktoren aufbaut. Die Daten von Network Pharmacological stammen aus der Datenbank, obwohl sie die Beziehung zu Medikamenten und Proteinen nicht vorhersagen können, und dies muss noch durch nachfolgende Experimente überprüft werden. Öffnen Sie zunächst die HERB-Datenbank und verwenden Sie Gua Liu und Zhebimu als Schlüsselwörter, um die Bestandteile der beiden Medikamente zu erhalten.Laden Sie die Liste und die kanonische SMILES-Struktur der verwandten Komponenten der beiden Medikamente herunter. Bestimmen Sie nun, ob die erhaltene Komponente aktiv ist, indem Sie Komponenten mit oraler Bioverfügbarkeit und wirkstoffähnlichen Werten in die HERB-Gruppendatenbank aufnehmen. Wenn die Komponente keine orale Bioverfügbarkeit und keine wirkstoffähnlichen Werte aufweist, geben Sie die Komponente in die Schweizer ADME-Datenbank ein, um die Informationen zu jeder Komponente zu erhalten.Nehmen Sie Komponenten mit hoher GI-Absorption und mindestens zwei ja, wirkstoffähnlichen Werten als Wirkstoffe auf. Um das Ziel der aktiven Komponenten vorherzusagen, öffnen Sie die HERB-Datenbank. Suchen und kopieren Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten.Öffnen Sie dann den Ähnlichkeits-Ensemble-Ansatz und fügen Sie die kanonischen SMILES-Strukturen der aktiven Komponenten in das Suchfeld ein. Klicken Sie auf "SEA" ausprobieren, um den Zielschlüssel, den Zielnamen, den P-Wert und die maximale TC jeder aktiven Komponente zu erhalten. Kopieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation und verwenden Sie die Filterfunktion für Tabellenkalkulationsdateien, um die aktiven Komponentenziele nach Zielschlüssel zu filtern.Kopieren Sie alle Ziele in eine Tabelle und entfernen Sie die Duplikate, um die Wirkstoffziele zu erhalten. Öffnen Sie nun die Genkartendatenbank und die Mendelsche Vererbung beim Menschen, um Krankheitsziele vorherzusagen. Verwenden Sie Lungenadenokarzinom'als Schlüsselwort, um die Krankheitsziele des Lungenadenokarzinoms zu erhalten.Laden Sie die Tabellen der Krankheitsziele herunter und löschen Sie die wiederholten Ziele, um die Ziele für das Lungenadenokarzinom zu erhalten. Konstruieren Sie ein Zielnetzwerk für Arzneimittelkomponentenkrankheiten, indem Sie die Zielmoleküle für Lungenadenokarzinome und Arzneimittelziele in dieselbe Spalte in einer neuen Tabelle kopieren. Verwenden Sie die Funktion zur Identifizierung von Datenduplikaten in der Symbolleiste, um Schnittpunkte der Ziele für Lungenadenokarzinome und der aktiven Komponenten von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia zu erhalten.Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0. Klicken Sie in der Menüleiste auf Datei und wählen Sie Importieren. Gefolgt von Netzwerk aus Datei.Um die Tabellenkalkulationsdatei zu importieren, optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung. Verwenden Sie die Funktion "Netzwerk analysieren" für die Analyse der Netzwerk-Topologie. Klicken Sie in der Menüleiste auf Extras und wählen Sie Netzwerk analysieren.Klicken Sie im Tabellenbereich auf den Grad in der Titelleiste, um die Komponenten nach Grad in absteigender Reihenfolge anzuordnen. Nehmen Sie die Top-10-Komponenten und -Ziele als die wichtigsten aktiven Komponenten und Kernziele. Aufbau des PPI-Netzwerks und Screening der Kernproteine.Öffnen Sie die Zeichenfolgendatenbank und fügen Sie die Liste der potenziellen Ziele von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia gegen Lungenadenokarzinome in das Dialogfeld der Namensliste ein. Dann selektieren Sie Homosapiens in Organismen. Klicken Sie auf "Suchen" und wählen Sie die Schaltflächen "Weiter" aus. Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf "Einstellungen" Und kreuzen Sie hohe Konfidenz 0,700 an In den Grundeinstellungen unter "Mindestens erforderlicher Interaktionswert" aktivieren Sie in den erweiterten Einstellungen die Option "Hohe getrennte Knoten im Netzwerk".Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Aktualisieren. Klicken Sie anschließend in der Titelleiste auf Exporte und laden Sie den kurzen tabellarischen Text der PPI-Beziehung im TSV-Format herunter. Öffnen Sie Cytoscape 3.8.0.Klicken Sie auf Datei, auswählen, importieren, gefolgt von Netzwerk aus Datei, um die Datei im TSV-Format für die visuelle Analyse zu importieren. Verwenden Sie die Netzwerkanalysefunktion, um die topologische Analyse durchzuführen. Optimieren Sie die Größe und Farbe der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der linken Systemsteuerung.Führen Sie eine KEGG-Anreicherungsanalyse durch, indem Sie die Medscape-Plattform öffnen, die Liste der potenziellen therapeutischen Ziele im Textformat in das Dialogfeld einfügen und dann auf die Schaltfläche "Senden" klicken. Kreuzen Sie Homo sapiens sowohl in der Eingabe als Spezies als auch in der Analyse als Spezies anund klicken Sie dann auf die Schaltfläche Benutzerdefinierte Analyse. Wählen Sie Anreicherung aus.Kreuzen Sie nur den KEGG-Pfad an und klicken Sie dann auf Anreicherungsanalyse. Sobald der Fortschrittsbalken 100 % erreicht, klicken Sie auf die orangefarbene Schaltfläche der Analyseberichtsseite, um die Anreicherungsergebnisse anzuzeigen. Klicken Sie auf alles in einer Zip-Datei'um das Anreicherungsergebnis herunterzuladen, und öffnen Sie dann die _FINAL_GO'csv-Datei im Ordner Enrichment_GO', um das Ergebnis zu erhalten.Öffnen Sie die R-Software und geben Sie install package GG plot two' und die Bibliothek GG Plot two'in R ein Für die Installation des GG plot two R-Pakets. Drücken Sie die Eingabetaste, um das KEGG-Visualisierungsprogramm auszuführen. Um die Lebensfähigkeit der Zellen nachzuweisen, verdauen Sie die logarithmische Wachstumsphase A 549 Zellen mit einem Milliliter 0,25%Trypsin für eine Minute bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie einen Milliliter DMEM Complete Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und blasen Sie es sanft, um die Zellablösung zu fördern. Zentrifugieren Sie dann die Mischung, um das Zellpellet zu erhalten, und resuspendieren Sie die erhaltenen Zellen mit DMEM-Komplettmedium. Geben Sie die Zellsuspension in ein Hämozytometer und zählen Sie sie mit einem automatisierten Zellzähler, verdünnen Sie sie auf fünf mal 10 bis vierte Zellen pro Milliliter mit DMEM-Komplettmedium Lösen Sie nun ein Gramm Trichosanthes Fritillaria Thunbergia Wasserextrakt in 10 Millilitern PBS auf und filtern Sie es durch einen 0,22-Mikrometer-Filter.Verdünnen Sie das Gemisch mit PBS auf unterschiedliche Konzentrationen. 100 Mikroliter der verdünnten Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben. Nach der Zelladhärenz fügen Sie einen Mikroliter Trichosanthes Fritillaria Thunbergia Wasserextrakte in verschiedenen Konzentrationen hinzu, um die Konzentration jeder Vertiefung anzupassen.Entsorgen Sie das ursprüngliche Medium nach 24 Stunden Kultur und fügen Sie 100 Mikroliter DMEM hinzu. Basismedium für die weitere Inkubation für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Fügen Sie am Ende der Inkubation 20 Mikroliter MTS-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für eine weitere Stunde.Übertragen Sie die inkubierte Mischung auf einen anderen Teller. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 Nanometern und berechnen Sie die Zellviabilität. Verdünnen Sie die logarithmische Wachstumsphase A 549 Zellen auf fünf mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter.Gib zwei Milliliter der Zellsuspension auf eine Platte mit sechs Wells und züchte sie 12 Stunden lang. Nachdem Sie verschiedene PBS-Verdünnungen von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Wasserextrakt erhalten haben, wie zuvor gezeigt, werden 20 Mikroliter der PBS-Lösung in die Blindkontrollgruppe und 20 Mikroliter der verschiedenen Verdünnungen von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Wasserextrakt in eine andere Konzentrationsgruppe gegeben. Nach 24 Stunden des Eingriffs wird der Überstand verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gereinigt.Geben Sie 250 Mikroliter RIPA-Puffer in jede Vertiefung und lysieren Sie die Zellen 30 Minuten lang. Sammeln Sie das Lysat für die Zentrifugalisierung und erhalten Sie den Überstand. Das Interaktionsnetzwerk von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia gegen das Lungenadenokarzinom wird gezeigt.Im Interaktionsnetzwerk sind die Top 10 der erhaltenen Wirkstoffe die wichtigsten aktiven Komponenten der Wirkung von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia bei der Behandlung des Lungenadenokarzinoms. Das PPI-Netzwerk umfasste 122 funktionelle Proteine und 210 Interaktionsbeziehungen. Die Top-10-Kernproteine sind hauptsächlich an der Neovaskularisation, Zellproliferation, Apoptose und dem Zellmembrantransport beteiligt.Von den 20 wichtigsten Signalwegen, die von KEGG eingestuft werden, stehen der PI3K-AKT-Signalweg, der Rap1-Signalweg, der Phospholipase-D-Signalweg und der MAPK1-Signalweg in engem Zusammenhang mit Lungenkrebs, wobei der PI3K-AKT-Signalweg den ersten Platz belegte. Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Extrakte in Konzentrationen über 400 Mikrogramm pro Milliliter konnten die Zellproliferation hemmen, und die Hemmwirkung auf A-549-Zellen bei Konzentrationen von bis zu 800 Mikrogramm pro Milliliter lag nahe der Hälfte der hemmenden Konzentration. Die Intervention von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia-Extrakten führte zu keiner signifikanten Veränderung der AKT-Proteinexpression in jeder Gruppe.Die Expression von p-AKT Serin-473 war jedoch gehemmt und zeigte einen dosisabhängigen Effekt. Die kritischen Komponenten von Trichosanthes Fritillaria Thunbergia waren molekular an die Schlüsselproteine des PI3K-AKT-Signalwegs angedockt, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bindungsenergien von Diosmetin und Kaempferol mit AKT1 weniger als minus sieben betrugen, was auf eine starke Bindungsaktivität hindeutet. Das Wichtigste ist, Wirkstoffe auf den Zielen der Traditionellen Chinesischen Medizin erreicht zu haben.Sowie deren Ziele der Kern von Network Pharmacological.

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Netzwerkpharmakologische Vorhersage und experimentelle Validierung des Wirkungsmechanismus von Trichosanthes-Fritillaria thunbergii gegen Lungenadenokarzinome

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