AMEBaS: Automatische Mittellinienextraktion und Hintergrundsubtraktion von ratiometrischen Fluoreszenz-Zeitraffern polarisierter Einzelzellen

Diese Methode quantifiziert die raumzeitliche Dynamik polarisierter Zellen entlang ihrer Mittellinie, die fluoreszierenden Reporter oder Farbstoff für bestimmte Einheiten von Interesse wie Aktin-, Ionen- oder Vesikeldynamik exprimieren. Die Version der Automatisierung eliminiert Verzerrungen und ermöglicht Skalierbarkeit, insbesondere für Aufgaben, die digital manuell erledigt werden und zeitaufwändig und subjektiv werden können. Öffnen Sie zunächst Jupyter Notebook, und lesen Sie die Zeitrafferdateien, indem Sie entweder auf die Startseite des interaktiven Notebooks von Google CoLab zugreifen oder die AMEBaS_local IP-YNB von GitHub herunterladen und öffnen.

Um die Verzeichniseinrichtung für die Ein- und Ausgabedaten mit der lokalen Version vorzubereiten, legen Sie den Fluoreszenzzeitraffer als TIF- oder DV-Datei in einem Ordner mit dem Namen data ab, der sich im Stammordner des Programms befindet. Erstellen Sie einen Ausgangsordner, um die generierten Daten zu empfangen, und führen Sie dann den Setup-Codeblock aus. Wenn Sie das Notizbuch in Google CoLab verwenden, führen Sie den Setup-Codeblock aus, um automatisch Daten und Ausgangsordner zu generieren, und führen Sie dann den Dateieingabecodeblock aus, um die Zeitrafferdaten zu lesen, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken.

Wenn Sie Google CoLab verwenden, laden Sie die Zeitrafferdatei in den Datenordner hoch, indem Sie auf die Schaltfläche "Datei auswählen" klicken. Wählen Sie als Nächstes aus, ob Sie für jeden Schritt zusätzliche Ausgaben generieren möchten, indem Sie den ausführlichen Parameter auf true oder false setzen. Um die Hauptzelle und das Segment im Hintergrund zu erkennen, führen Sie den Codeblock für die Einzelzellensegmentierung aus, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche klicken, um die gewünschte Zelle automatisch vom Hintergrund zu trennen.

Passen Sie den Sigma-Wert in der Sigma-Variablen an, um die Glätte der Segmentierungsmaske zu optimieren. Der Standardwert ist 2,0. Legen Sie nun die Variablenschätzung auf false fest, um den direkt aus den ISO-Daten geschätzten Schwellenwert zu speichern, oder auf true, um ihn mithilfe der lokalen polynomialen Regression über benachbarte Frames hinweg zu glätten.

Passen Sie die Variable n_points an, um die Funktion mit dem Standardwert 40 zu optimieren. Um die Mittellinie entlang der Zellverlängerung zu verfolgen, führen Sie den Codeblock für die Zellenmittellinienverfolgung aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Wiedergabe" klicken, um die Zelle mit der Lee-Methode zu skelettieren und die Spitze des letzten Skeletts durch lineare Extrapolation zu verlängern. Wählen Sie als Nächstes die Nachzeichnungsoption für die Mittellinie aus, indem Sie das Argument complete_skeletonization so anpassen, dass entweder auf dem letzten Frame oder einmal pro Frame nachgezeichnet wird.

Passen Sie die Variable interpolation_fraction an, um den Anteil der Punkte im Skelett für die Interpolation während der Extrapolation festzulegen. Der Standardwert ist hier 0,25. Ändern Sie als Nächstes die Variable extrapolation_length, um die Länge der Mittellinienextrapolation zu bestimmen.

Der Standardwert ist minus eins, wodurch das Skelett bis zur nächsten Kante verlängert wird. Führen Sie nun den ersten Codeblock für die Datenvisualisierung aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Wiedergabe" klicken, um automatisch Kymographen für beide Kanäle zu generieren. Wählen Sie die Gaußsche Kerngröße für die Glättung aus, indem Sie die Variable kymograph_kernel anpassen.

Um die Intensitäten von nicht verlängerten Skeletten richtig darzustellen, wird eine benutzerdefinierte Farbkarte für ihre gekappten Kymographen benötigt. Passen Sie die Variable shift_fraction an, um den prozentualen Anteil der Intensitäten auszuwählen, die als Hintergrundfarbe Schwarz festgelegt werden. Führen Sie dann den zweiten Codeblock für die Datenvisualisierung aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Wiedergabe" klicken, um automatisch einen Metrik-Kymographen und einen Zeitraffer zu generieren.

Passen Sie die Variable switch_ratio an, um die Reihenfolge der Kanäle zu ändern, die bei Verhältnisberechnungen als Zähler und Nenner verwendet werden, wobei der Standardwert false ist. Überprüfen Sie, ob der Zeitraffer des Verhältnisses eine zusätzliche Glättung mit einem mittleren Filterdurchgang erfordert, indem Sie die smooth_ratio Variable anpassen. Standardmäßig ist dies auf false festgelegt.

Wählen Sie als Nächstes, ob Sie Ausreißer, die sich aus einem niedrigen Signal im Nennerkanal ergeben, entfernen oder beibehalten möchten, indem Sie die Variable reject_outliers anpassen. Ausreißer werden als Werte markiert, die das 1,5-fache des Interquartilsabstands über dem dritten Quartil betragen. Wählen Sie abschließend aus, ob die Ausgabe der Hintergrund- und Verhältnismetrik exportiert werden soll, indem Sie die Variable background_ratio anpassen.

Der Standardwert ist false, um den Hintergrund durch Nullen zu ersetzen. AMEBaS, die an Datensätzen wie Pollenschläuchen, die den Kalziumreporterkameleon exprimieren, Pollenschläuchen, die den pH-Indikator Florin exprimieren, Wurzelhaaren, die den Kalziumreporter NESYC 3.6 exprimieren, getestet wurden, funktionierten trotz Unterschieden in der Wachstumsrichtung, den bildgebenden Verfahren, den Fluoreszenzreportern und den Zelltypen erfolgreich. Denken Sie daran, den Satz von block auszuführen, damit Sie die erforderlichen Pakete installieren können.

Darüber hinaus ist es wichtig, die Sigma-Werte speziell für Ihre Bilder anzupassen, damit Sie genauere Ergebnisse erhalten. Die resultierenden Kymographen können dann verwendet werden, um die raumzeitliche Dynamik des Lösungsinteresses zu analysieren. Darüber hinaus können Sie die Findungsmethode, das Wachstum und die Zeitreihen berechnen, um die richtige Lösung zu analysieren.