Name: Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Lernen Sie Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien ZEM2S und ZFL für ökotoxikologische Studien. Diese Methode ermöglicht tierversuchsfreie Bewertungen akuter chemischer Toxizität.

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In Erinnerung an Dr. Márcio Lorencini, einen Mitautor dieser Arbeit, einen exzellenten Forscher auf dem Gebiet der Kosmetik, der sich der Förderung der kosmetischen Forschung in Brasilien verschrieben hat. Die Autoren danken dem Multi-User-Labor in der Abteilung für Physiologie (UFPR) für die Verfügbarkeit von Geräten und für die finanzielle Unterstützung der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES, Brasilien) (Finanzcode 001) und der Grupo Boticario.

ANMERKUNG: In der Materialtabelle finden Sie die Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und in Tabelle 1 die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Medien.
1. Vorbereitung von ZFL- und ZEM2S-Zellen
<ol><li>Beginnen Sie mit einem T75-Kolben aus ZFL- oder ZEM2S-Zellen mit 80% Konfluenz, kultiviert im jeweiligen vollständigen Medium bei 28 °C ohne CO2.</li>
	<li>Nehmen Sie das Nährmedium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen unter Zugabe von 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,01 M). 3 ml 1x Trypsin (0,05% v/v; 0,5 mM Trypsin-EDTA) in die Kulturkolben geben. Bei 28 °C 3 min inkubieren.</li>
	<li>Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen freizusetzen, und stoppen Sie dann die Trypsinverdauung, indem Sie 3 ml vollständiges Nährmedium in den Kolben geben.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 100 × g zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand, fügen Sie 1 ml vollständiges Medium für ZFL- oder ZEM2S-Zellen hinzu und resuspendieren Sie das Pellet mit einer Mikropipette.</li>
</ol>2. Zellzählung durch Ausschluss von Trypanblau
<ol><li>Geben Sie 10 μl der Zellsuspension und 10 μl Trypanblau-Farbstoff in ein Mikroröhrchen, um die Zellen zu zählen und ihre Lebensfähigkeit zu bewerten. Mischen Sie die Zellsuspension und färben Sie sie mit einer Pipette.</li>
	<li>Übertragen Sie dann 10 μl dieser Mischung (Zellsuspension + Trypanblau) in eine Neubauer-Kammer und zählen Sie die Zellen in den vier großen Quadraten (Quadranten Q), die an den Ecken der Kammer platziert sind, wobei lebensfähige Zellen als solche betrachtet werden, die kein Trypanblau aufnehmen. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Gleichung (1): <img alt="Formel für die Zellzahl: Zellzahl = (ΣQ/4) × 10^4; Mathematische Gleichung zur Quantifizierung." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> Bewertungen (1)</li>
	<li>Berechnen Sie die endgültige Zellzahl in der Zellsuspension, indem Sie die mit Gleichung (1) ermittelte Zellzahl mit zwei multiplizieren (der Verdünnungsfaktor aufgrund der Verwendung von Trypanblau). HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes Zellzählsystem (z. B. ein Zytomer mit Zellzähl- und Viabilitätsfunktion) verwendet werden.</li>
</ol>3. Zellplattierung in 96-Well-Platten
<ol><li>Berechnen Sie das Zellsuspensionsvolumen, das benötigt wird, um die Anzahl der Zellen zu erhalten, die zur Durchführung der Zytotoxizitätstests erforderlich sind. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen für jede Zelllinie ist unten angegeben:<ol><li>Platte 60.000 lebensfähige ZEM2S-Zellen pro Well; Verwenden Sie daher für die gesamte Platte sechs Millionen Zellen in 20 ml vollständigem Medium (200 μl/Well, 96-Well-Platte).</li>
		<li>Platte 40.000 lebensfähige ZFL-Zellen pro Well; Verwenden Sie daher für die gesamte Platte vier Millionen Zellen in 20 ml vollständigem Medium (200 μl/Well, 96-Well-Platte).</li>
	</ol></li>
	<li>Danach wird das jeweilige Volumen der Zellsuspension in ein Reagenzreservoir (steril) überführt und mit dem kompletten Nährmedium für ZFL oder ZEM2S auf 20 ml aufgefüllt. Mischen Sie die Lösung mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig auf und ab. HINWEIS: Achten Sie darauf, keinen Schaum oder Blasen zu bilden.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl der Zellsuspension mit der Mehrkanal-Mikropipette in jede Vertiefung einer transparenten Polystyrol-96-Well-Platte. Die Platten werden 24 h lang bei 28 °C inkubiert. HINWEIS: Die Platte muss mindestens drei Vertiefungen ohne Zellen für die Blindkontrolle aufweisen, und diesen Vertiefungen sollten nur vollständige Medien zugesetzt werden. Der Randeffekt (verursacht durch eine höhere Verdunstung in den Randvertiefungen) tritt häufig bei 96-Well-Plattenassays auf und kann die Lebensfähigkeit der Zellen in den Randvertiefungen der Platte28 beeinträchtigen. Dieser Effekt kann je nach Marke und Design der 96-Well-Platte höher oder niedriger sein28. Obwohl wir in den Randvertiefungen keine Störung des Zellwachstums/der Lebensfähigkeit von ZFL und ZEM2S festgestellt haben, empfehlen wir, die Platte mit Parafilm oder Klebesiegelfolie zu versiegeln, um diesen Effekt zu verhindern, oder die Zellen nur in den 60 Innenvertiefungen zu kultivieren und die Randvertiefungen mit PBS zu füllen.</li>
</ol>4. Exposition von Zellen gegenüber Prüfchemikalien
<ol><li>Entsorgen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig mit einer Mehrkanal-Mikropipette aus den Vertiefungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen Testchemikalien in unterschiedlichen Konzentrationen aus. Bereiten Sie die Lösungen der Prüfchemikalienkonzentrationen in den Nährmedien für ZFL oder ZEM2S ohne fötales Rinderserum (FBS) (Expositionsmedien) vor. Fügen Sie dann 100 μl dieser Lösungen pro Vertiefung in technischer Verdreifachung hinzu (d. h. drei Vertiefungen/Testchemikalienkonzentration).</li>
	<li>Für Kontrollen werden die Kontrollgruppen in technischen Dreifachteilen (drei Vertiefungen/Kontrollgruppe) auf die gleiche Platte wie die Prüfchemikalie gelegt. So werden für die Blindkontrolle (B) 100 μl des Belichtungsmediums in die zellfreien Vertiefungen gegeben, für die Negativkontrolle (NC) 100 μl des Belichtungsmediums in Vertiefungen mit Zellen gegeben und für die Positivkontrolle (PC) die Zellen einer Lösung von 1% Triton X-100 ausgesetzt, die in den Belichtungsmedien hergestellt wurde. In einigen Fällen sollte eine Lösungsmittelkontrolle (SC) in die Platte aufgenommen werden, wobei eine eindeutig nicht-zytotoxische Konzentration als endgültige Lösungsmittelkonzentration berücksichtigt wird. HINWEIS: Es wird empfohlen, 0,5% DMSO als Lösungsmittel zu verwenden; DMSO kann in diesen Zelllinien bis zu 1% als Lösungsmittel verwendet werden, ohne die Zytotoxizitätsschwelle von 10% in Bezug auf die Negativkontrolle zu überschreiten.</li>
	<li>Die Platten werden 24 h lang bei 28 °C inkubiert. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm oder selbstklebender Siegelfolie, um die Verdunstung des Nährmediums zu verhindern. ANMERKUNG: Bestimmte Chemikalien können eine intrinsische Hintergrundabsorption oder Fluoreszenz aufweisen, die die Absorption oder Fluoreszenz des/der Indikatorfarbstoff(e) beeinträchtigen kann (z. B. können Verbindungen mit Farbe die Absorption, das Serumalbumin29 und Verbindungen, die die Reduktionsenzymestören 30,31). In diesem Fall muss die Platte eine zusätzliche Kontrolle enthalten, indem Testchemikalienlösungen in die Vertiefungen ohne Zellen gegeben werden. Damit soll die mögliche Interferenz der chemischen Autoabsorption/Autofluoreszenz mit den Farbstoffen überprüft werden. Wenn eine Interferenz festgestellt wird, sollte bewertet werden, ob sie ausgeschlossen werden kann, um eine korrekte Vorhersage der Zytotoxizität zu erhalten.</li>
</ol>5. Zytotoxizitäts-Assays
HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen gemäß Tabelle 1 vor. Alle unten beschriebenen Schritte (Abbildung 1) werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Verwendung einer Pipette zum Verwerfen des Expositionsmediums wird nicht empfohlen, da sich die Zellen nach einer chemischen Behandlung leicht von den Vertiefungen lösen können.
<ol><li>AB- und CFDA-AM-Assays<ol><li>Entsorgen Sie das Expositionsmedium nach 24 Stunden Exposition gegenüber der Prüfchemikalie vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.</li>
		<li>Waschen Sie den Teller mit 200 μl PBS. Entfernen Sie das PBS vorsichtig, indem Sie es in eine Auffangschale gießen, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μl AB/CFDA-AM-Lösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln bei 28 °C.</li>
		<li>Messen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenzplatten-Reader bei 530 nm (Anregung) und 595 nm (Emission) für AB und bei 493 nm (Anregung) und 541 nm (Emission) für CFDA-AM.</li>
	</ol></li>
	<li>NR-Assay ANMERKUNG: Die Schritte für den NR-Assay werden unmittelbar nach den AB- und CFDA-AM-Assays durchgeführt (Abbildung 1).<ol><li>Zentrifugieren Sie die NR-Arbeitslösung (40 μg/ml) bei 600 × g für 10 min. HINWEIS: Die Ausfällung von NR im Röhrchen darf nicht auf die Platten übertragen werden. Sammeln Sie daher nach dem Zentrifugieren der NR-Arbeitslösung den Überstand mit einer Pipette, ohne die NR-Ausfällungen abzusaugen. Übertragen Sie den Überstand in ein Reagenzreservoir.</li>
		<li>Entfernen Sie die AB/CFDA-AM-Lösung vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.</li>
		<li>100 μl der NR-Arbeitslösung pro Well mit einer Mehrkanal-Mikropipette zugeben. Die Platte wird 3 h bei 28 °C inkubiert. HINWEIS: Beobachten Sie nach der 3-stündigen Inkubation mit einem Mikroskop, ob in den Platten NR-Niederschlag aufgetreten ist. NR-Ausfällungen können die Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen und sollten daher nicht vorhanden sein.</li>
		<li>Entfernen Sie die NR-Lösung vorsichtig, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen. Waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie 150 μl PBS pro Vertiefung hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 150 μl der NR-Extraktionslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Tellerschüttler zum sanften Schütteln. Messen Sie die Absorption bei 540 nm in einem Plattenleser. HINWEIS: Eine zweite Anzeige bei 690 nm sollte durchgeführt werden, um eine Absorption von Fingerabdrücken im Hintergrund in der Platte auszuschließen.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT-Assay ANMERKUNG: Der MTT-Test muss getrennt von den oben beschriebenen Assays (in einer neuen Platte) durchgeführt werden (Abbildung 2).<ol><li>Entfernen Sie das Belichtungsmedium vorsichtig, indem Sie den Inhalt in ein Auffangfach gießen.</li>
		<li>100 μl MTT-Arbeitslösung pro Well mit einer Mehrkanal-Mikropipette zugeben. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 4 h.</li>
		<li>Entsorgen Sie die MTT-Lösung, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μl DMSO pro Vertiefung hinzu, um die Formazankristalle zu extrahieren, und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Tellerschüttler. Messen Sie die Absorption bei 570 nm mit einem Plattenleser. HINWEIS: Eine zweite Anzeige bei 690 nm sollte durchgeführt werden, um eine Absorption von Fingerabdrücken im Hintergrund in der Platte auszuschließen. Es ist wichtig zu beachten, dass Prüfchemikalien die MTT stören können, die bewertet werden muss, um die Qualität der erzeugten Datenzu gewährleisten 32. Dazu sollten zellfreie Vertiefungen, die die Testkonzentrationen und MTT (0,5 mg/ml) enthalten, exponiert werden, gefolgt von einer Inkubation, um jede Farbveränderung in den Vertiefungen zu beobachten, die die Absorption erhöhen und zu falschen Viabilitätsergebnissen führen kann. Chemikalien, die mit MTT interagieren, müssen bei diesem Test vermieden werden.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Berechnung der Zelllebensfähigkeit/Zytotoxizität
ANMERKUNG: Die erfasste Rohabsorption oder -fluoreszenz wird verwendet, um die Zellviabilität als Prozentsatz in Bezug auf die Negativkontrolle (für Prüfchemikalien, die direkt in Expositionsmedien hergestellt werden) oder die Lösungsmittelkontrolle (für Prüfchemikalien, die mit Lösungsmitteln hergestellt werden, wie z. B. DMSO) zu berechnen. Vor dem Bestimmen des Prozentsatzes der Zellviabilität müssen die Rohdaten durch das leere Steuerelement normalisiert werden.
<ol><li>Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption oder Fluoreszenz für jede Prüfchemikalienkonzentration und Kontrollgruppe (drei Vertiefungen/Behandlung).</li>
	<li>Um den Prozentsatz der Zellviabilität relativ zur Kontrolle (negativ oder Lösungsmittel) zu bestimmen, verwenden Sie Gleichung (2): <img alt="Formel zur Berechnung der Zellviabilität in der biochemischen Analyse, die den Prozentsatz auf der Grundlage der Absorption anzeigt." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> Bewertungen (2) ANMERKUNG: Die Einheiten Absorption (abs) oder Fluoreszenz (Fluo) stellen den Mittelwert der Absorption oder Fluoreszenz dar, der in den drei Vertiefungen pro Konzentration gemessen wird. blank steht für Vertiefungen ohne Zellen.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Zytotoxizitätstests werden häufig für die In-vitro-Toxizitätsbewertung verwendet, und in diesem Protokollartikel werden vier häufig verwendete Zytotoxizitätstests vorgestellt, die für die Durchführung in Zebrafischzelllinien modifiziert wurden (d. h. Zelldichte für 96-Well-Platten, Inkubationszeit im MTT-Assay, FBS-Erschöpfung während der chemischen Expositionsbedingungen und maximal akzeptable Konzentration für die SC). Da diese Assays die Zytotoxizität anhand verschiedener Endpunkte der Zelllebensfähigkeit (S...

Chemische Stoffe müssen auf ihre Sicherheit für die menschliche Gesundheit und die Umwelt geprüft werden. Molekulare und zelluläre Biomarker werden zunehmend in Sicherheitsbewertungen zur Vorhersage von Auswirkungen auf lebende Organismen durch Regulierungsbehörden und/oder Gesetzgebungen (z. B. REACH, OECD, US-EPA)1,2 berücksichtigt, da sie dem unerwünschten In-vivo-Ergebnis (z. B. endokrine Störung, immunologische Reaktion, akute Toxizität, Phototoxizität) vorausgehen können3,4,5,6,7 . In diesem Zusammenhang wurde die Zytotoxizität als Maß für die Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen herangezogen 5,8; Es kann jedoch viele andere Anwendungen in Ökotoxizitätsstudien haben, wie z. B. die Definition subzytotoxischer Konzentrationen chemischer Substanzen, um ihre unterschiedlichsten Auswirkungen auf Fische zu untersuchen (z. B. endokrine Disruptoren).
In Zellkultursystemen (In-vitro-Systemen ) kann die Zytotoxizität chemischer Substanzen durch Methoden bestimmt werden, die sich in der Art der Endpunkte unterscheiden. Zum Beispiel kann eine Zytotoxizitätsmethode auf einem Endpunkt basieren, der sich auf die spezifische Morphologie bezieht, die während des Zelltodprozesses beobachtet wird, während eine andere die Zytotoxizität durch Messung des Zelltods, der Lebensfähigkeit und Funktionalität, der Morphologie, des Energiestoffwechsels sowie der Zellanhaftung und -proliferation bestimmen kann. Chemische Substanzen können die Zelllebensfähigkeit durch verschiedene Mechanismen beeinflussen, daher ist eine Bewertung der Zytotoxizität erforderlich, die verschiedene Endpunkte der Zelllebensfähigkeit abdeckt, um chemische Wirkungen vorherzusagen9.
MTT und Alamar Blue (AB) sind Assays, die die Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit auf der Grundlage der Zellstoffwechselaktivität bestimmen. Der MTT-Assay bewertet die Aktivität des mitochondrialen Enzyms Succinat-Dehydrogenase10. Die Reduktion von gelblichem 3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazanblau tritt nur in lebensfähigen Zellen auf, und seine optische Dichte ist direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen10. Der AB-Assay ist ein empfindlicher Oxidations-Reduktions-Indikator, der durch mitochondriale Enzyme vermittelt wird, die fluoreszieren und ihre Farbe ändern, wenn Resazurin von lebenden Zellen zu Resorufin reduziertwird 11; aber auch zytosolische und mikrosomale Enzyme tragen zur Reduktion von AB und MTT12 bei. Diese Enzyme können mehrere Reduktasen umfassen, wie z. B. Alkohol- und Aldehydoxidoreduktasen, NAD(P)H: Chinonoxidoreduktase, Flavinreduktase, NADH-Dehydrogenase und Cytochrome11.
Der Neutral Red (NR)-Assay ist ein Zellviabilitätstest, der auf dem Einbau dieses Farbstoffs in die Lysosomen lebensfähiger Zellenbasiert 13. Die Aufnahme von NR hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, pH-Gradienten aufrechtzuerhalten. Der Protonengradient innerhalb der Lysosomen hält einen niedrigeren pH-Wert als das Zytoplasma aufrecht. Bei normalem physiologischen pH-Wert weist der NR eine Nettoladung von ungefähr Null auf, wodurch er die Zellmembranen durchdringen kann. Somit wird der Farbstoff geladen und bleibt in den Lysosomen zurück. Folglich ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen14 umso größer, je größer die Menge an zurückgehaltenem NR ist. Chemische Substanzen, die die Zelloberfläche oder die lysosomalen Membranen schädigen, beeinträchtigen die Aufnahme dieses Farbstoffs.
Der CFDA-AM-Assay ist ein fluorometrischer Zellviabilitätstest, der auf der Retention von 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Acetoxymethylester (CFDA-AM)15 basiert. 5-CFDA-AM, ein Esterasesubstrat, wird in Carboxyfluorescein umgewandelt, eine fluoreszierende Substanz, die polar und durch Membranen lebender Zellen nicht durchlässig ist15; Somit wird es in der Innenseite einer intakten Zellmembran zurückgehalten, was auf lebensfähige Zellen hinweist.
Kürzlich wurden drei Zytotoxizitätstests (CFDA-AM-, NR- und AB-Assays) in einer validierten ISO-Richtlinie (International Organization for Standardization) (ISO 21115:2019)16 und einer OECD-Testmethode (OECD TG 249) kombiniert, um die akute Toxizität von Fischen unter Verwendung der RTgill-W1-Zelllinie (permanente Zelllinie aus der Kieme der Regenbogenforelle [Oncorhynchus mykiss]) in 24-Well-Plattenzu bewerten 17 . Obwohl es eine bestehende zellbasierte Methode zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen gibt, wurden Anstrengungen unternommen, um ähnliche Methoden mit anderen Fischarten zu entwickeln und den Durchsatz der Methode zu erhöhen. Einige Beispiele umfassen die Entwicklung von ZFL-Zelllinien, die mit Reportergenen für spezifische Toxizitätswege18,19 transfiziert wurden, Phototoxizitätstests in der RTgill-W1-Zelllinie 20 und die Verwendung von ZFL- und ZF4-Zelllinien (Zebrafisch-Fibroblasten, die aus 1 Tag alten Embryonen gewonnen wurden) zur Bewertung der Toxizität durch mehrere Zytotoxizitätstests21.
Danio rerio (Zebrafisch) ist eine der wichtigsten Fischarten, die in aquatischen Toxizitätsstudien verwendet werden. Daher können zellbasierte Methoden mit Zebrafisch-Zelllinien für die Toxizitätsprüfung von Fischen äußerst nützlich sein. Die ZFL-Zelllinie ist eine zebrafischepitheliale Hepatozytenzelllinie, die die Hauptmerkmale von Leberparenchymzellen aufweist und Xenobiotika 7,22,23,24,25 metabolisieren kann. Inzwischen ist die ZEM2S-Zelllinie eine embryonale Zebrafisch-Fibroblasten-Zelllinie, die aus dem Blastula-Stadium stammt und zur Untersuchung von Entwicklungseffekten auf Fische verwendet werden kann26,27. Daher beschreibt dieses Protokoll vier Zytotoxizitäts-Assays (MTT-, AB-, NR- und CFDA-AM-Assays), deren Modifikationen mit ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in 96-Well-Platten durchgeführt werden müssen.

<table><tbody><tr><td>5-CFDA, AM (5-Carboxyfluoresceindiacetat, Acetoxymethylester)</td><td>Invitrogen</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatte, 96-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td>Oberfläche: Standard, flache Basis</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Pulver, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td></tr><tr><td>FBS - Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix, Pulver</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Neutral rot&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4638</td><td>Pulver, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm Rotationsdurchmesser</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10X) mit Calcium und Magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Natriumsalz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>Pulver, BioReagenz, geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Pulver&nbsp; Bioreagenz für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Thiazolylblau, Tetrazoliumbromid&nbsp; 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Diese Zelllinie wurde freundlicherweise von Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)</td></tr><tr><td>ZFL Zelllinie</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr> gespendet</tbody></table>

zytotoxizitäts-assays mit zebrafisch-zelllinien

Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines

Fischzelllinien werden zunehmend in Ökotoxizitätsstudien verwendet, und Zytotoxizitätstests wurden als Methoden zur Vorhersage der akuten Toxizität von Fischen vorgeschlagen. Daher enthält dieses Protokoll Zytotoxizitätsassays, die modifiziert wurden, um die Zelllebensfähigkeit in Zebrafisch- (Danio rerio), Embryo- (ZEM2S) und Leber- (ZFL) Zelllinien in 96-Well-Platten zu bewerten. Die bewerteten Endpunkte der Zytotoxizität sind die mitochondriale Integrität (Alamar Blue [AB]- und MTT-Assays), die Membranintegrität über die Esteraseaktivität (CFDA-AM-Assay) und die lysosomale Membranintegrität (Neutral Red [NR]-Assay). Nach der Exposition der Testsubstanzen in einer 96-Well-Platte werden die Zytotoxizitätstests durchgeführt; Hier werden AB und CFDA-AM gleichzeitig durchgeführt, gefolgt von NR auf derselben Platte, während der MTT-Assay auf einer separaten Platte durchgeführt wird. Die Messwerte für diese Assays werden durch Fluoreszenz für AB und CFDA-AM und Absorption für MTT und NR ermittelt. Die mit diesen Fischzelllinien durchgeführten Zytotoxizitätstests können verwendet werden, um die akute Toxizität chemischer Substanzen an Fischen zu untersuchen.

Abbildung 3 zeigt die Platten der AB-, CFDA-AM-, NR- und MTT-Assays. Für den AB-Assay (Abbildung 3A) zeigen die Blindvertiefungen und Vertiefungen ohne oder mit einer reduzierten Anzahl lebensfähiger Zellen eine blaue Farbe und eine geringe Fluoreszenz, während die Vertiefungen mit einer hohen Anzahl lebensfähiger Zellen rosa sind und aufgrund der Umwandlung von Resazurin (AB) in Resorufin (rosafarbene Substanz) durch die lebensfähigen Zellen hohe Fluoreszenzwer...

Dieses Protokoll enthält häufig verwendete Zytotoxizitätstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM-, Neutral Red- und MTT-Assays), die für die Bewertung der Zytotoxizität in Zebrafischembryo- (ZEM2S) und Leberzelllinien (ZFL) in 96-Well-Platten geeignet sind.

Zytotoxizitäts-Assays mit Zebrafisch-Zelllinien

Fish cell lines have become increasingly used in ecotoxicity studies, and cytotoxicity assays have been proposed as methods to predict fish acute ...

Das Zytotoxizitäts-Assay-Protokoll unter Verwendung von Zebrafisch-Zelllinien kann Fragen zur akuten Toxizität von Chemikalien bei Fischen beantworten oder helfen, die geeigneten Testkonzentrationen für andere alternative Fisch-Assays zu definieren. Der Hauptvorteil dieses 96-Well-Plattentests besteht darin, verschiedene Viabilitätsendpunkte zu kombinieren, um die Zytotoxizität für Zebrafischzellen zu bestimmen, die eine wichtige Fischart in Ökotoxizitätsstudien sind. Das Protokoll ist sehr einfach.Wenn Sie alle beschriebenen Schritte korrekt ausführen, sollte kein Problem auftreten. Dieses Protokoll trägt dazu bei, keine tierbasierten Ökotoxizitätsstudien durchzuführen, in denen die Auswirkungen von Fischzelllinien aus verschiedenen Organen oder Lebensstadien wie Hepatozyten in embryonalen Zellen bewertet werden. Um mit der Beschichtung der ZEM2S- oder ZFL-Zellen zu beginnen, berechnen Sie das Volumen der jeweiligen Zellsuspensionen, die benötigt werden, um die gewünschte Anzahl von Zellen für Assays zu erhalten.Füllen Sie ein steriles Reagenzreservoir mit dem kompletten Nährmedium für die entsprechende Zelllinie und überführen Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension in das Reservoir für ein Gesamtvolumen von 20 Millilitern. Mischen Sie die Lösung mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig auf und ab, ohne Schaum oder Blasen zu bilden. Geben Sie dann mit der Mehrkanal-Mikropipette 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer transparenten Polystyrol-96-Well-Platte, um eine lebensfähige Zellzahl von 60.000 Zellen pro Vertiefung für die ZEM2S-Zellen und 40.000 Zellen pro Vertiefung für die ZFL-Zellen zu erhalten.Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Um einen der beiden Zelltypen unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfchemikalien auszusetzen, wird die gewünschte Konzentration der Prüfchemikalienlösungen in den Nährmedien für die interessierende Zelllinie ohne fötales Rinderserum oder FBS hergestellt. Nach der 24-stündigen Inkubation entsorgen Sie die verbrauchten Medien vorsichtig mit einer Mehrkanal-Mikropipette aus den Vertiefungen.Fügen Sie dann 100 Mikroliter einer bestimmten Prüfchemikalienlösung pro Vertiefung in technischen Dreifachteilen hinzu, d. h. drei Vertiefungen für jede Prüfchemikalienkonzentration. Die Kontrollgruppen werden in technischen Dreifachraten auf die gleiche Platte wie die Prüfchemikalien gelegt. Für die Blindkontrolle werden 100 Mikroliter des Belichtungsmediums in drei zellfreie Vertiefungen gegeben.Für die Negativkontrolle werden 100 Mikroliter des Belichtungsmediums in drei Vertiefungen mit Zellen gegeben. Für die Positivkontrolle werden drei Vertiefungen, die Zellen enthalten, einer 1%igen Triton X-100-Lösung ausgesetzt, die in den Expositionsmedien hergestellt wurde. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm oder klebender Siegelfolie, um die Verdunstung des Nährmediums zu verhindern, und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.Nach 24 Stunden Exposition gegenüber der Prüfchemikalie entsorgen Sie die Expositionsmedien vorsichtig aus den Vertiefungen, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen und jede Vertiefung mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Um das PBS zu entfernen, ohne Zellen zu verlieren, gießen Sie es vorsichtig in eine Auffangschale. Um die Alamar Blue- oder AB- und CFDA-AM-Assays durchzuführen, fügen Sie 100 Mikroliter der jeweiligen Lösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln bei 28 Grad Celsius.Als nächstes messen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenzplatten-Reader bei den im Text genannten geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen. Um den neutralen Rot- oder NR-Test durchzuführen, nehmen Sie die NR-Arbeitslösung mit einer Konzentration von 40 Mikrogramm pro Milliliter und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 600 G. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die zuvor hinzugefügten AB- und CFDA-AM-Lösungen aus den Vertiefungen, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.Fügen Sie mit einer Mehrkanal-Mikropipette 100 Mikroliter der NR-Arbeitslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Sobald die Inkubation beendet ist, gießen Sie die NR-Lösung vorsichtig von der Platte in eine Auffangschale und waschen Sie die Vertiefungen mit 150 Mikrolitern PBS pro Vertiefung. Fügen Sie nach dem Waschen 150 Mikroliter der NR-Extraktionslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte, indem Sie sie 10 Minuten lang vorsichtig auf einem Plattenschüttler schütteln, bevor Sie die Absorption bei 540 Nanometern mit einem Plattenleser messen.Um den MTT-Assay durchzuführen, entfernen Sie nach der 24-stündigen Exposition gegenüber der Testchemikalie vorsichtig das Expositionsmedium, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen und mit einer Mehrkanal-Mikropipette 100 Mikroliter MTT-Arbeitslösung pro Vertiefung im Dunkeln hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius vier Stunden lang im Dunkeln. Entsorgen Sie dann die MTT-Lösung, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen und 100 Mikroliter DMSO in jede Vertiefung geben, um die Formazankristalle zu extrahieren.Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Plattenschüttler, bevor Sie die Absorption bei 517 Nanometern mit einem Plattenleser messen. Für den AP-Assay zeigten die Vertiefungen, die den Blind-, Positivkontroll- und hochzytotoxischen Konzentrationen von Testchemikalien entsprachen, eine blaue Farbe und eine geringe Fluoreszenz, was entweder auf das Fehlen oder eine Verringerung lebensfähiger Zellen hinweist. Im Gegensatz dazu wandelten die Vertiefungen, die niedrigen zytotoxischen Konzentrationen der Prüfchemikalie und der Negativkontrolle entsprachen und eine hohe Anzahl lebensfähiger Zellen enthielten, das Resazurin in rosa Resorufin mit höherer Fluoreszenz um.Für den NR-Assay sind die hochzytotoxischen Konzentrationen der Testchemikalien und die Positivkontrolle transparent oder blassrosa mit geringer Absorption, während Vertiefungen, die lebensfähige Zellen enthielten, die den NR-Farbstoff zurückhielten, eine dunkelrosa Farbe und eine hohe Absorption aufwiesen. In ähnlicher Weise sind für den MTT-Assay Vertiefungen ohne lebensfähige Zellen transparent, während diejenigen, die lebensfähige Zellen enthalten, MTT in violett gefärbtes Formazan umwandeln. Basierend auf den berechneten Zellviabilitätsprozentsätzen wurde die halbmaximale Inhibitorkonzentration oder der IC50-Wert für die verschiedenen Testchemikalien in ZFL- und ZEM2S-Zelllinien geschätzt.Für Kulturen mit und ohne FBS wurde kein signifikanter Unterschied in der Zellviabilität beobachtet, was auf die Eignung von Nährmedien hinweist, denen FBS für die chemische Expositionsdauer von 24 Stunden entzogen wurde. MTT- und NR-Assays zeigten keinen signifikanten Einfluss unterschiedlicher DMSO-Konzentrationen von 0,1 % bis 1 % auf die Zellviabilität, was darauf hindeutet, dass diese Zelllinien die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel bis zu 1 % unterstützen. Achten Sie beim Umgang mit plattierten Zellen besonders darauf, eine Selbstablösung während des gesamten Verfahrens zu vermeiden, und bereiten Sie die neutrale rote Arbeitslösung sorgfältig vor, um eine Ausfällung des Farbstoffs zu vermeiden. Dieses Verfahren kann auf Studien angewendet werden, die sich mit verschiedenen Aspekten der chemischen Auswirkungen auf Fische unter Verwendung von In-vitro-Modellen befassen, und trägt dazu bei, dass keine tierbasierten Ökotoxizitätsstudien durchgeführt werden.

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Umwelt

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