Name: Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken als Werkzeug zur Untersuchung der Transplantation von Eierstockgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Erfahren Sie das CAM-Xenotransplantationsmodell bei Küken zur Untersuchung menschlichen Eierstockgewebes. Diese Methode ermöglicht die Analyse früher Vaskularisation und Follikelüberlebensraten in vivo.

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Die Autoren danken Mira Hryniuk, BA, für die Durchsicht der englischen Sprache des Artikels.

Die Verwendung von menschlichem Gewebe wurde vom Institutional Review Board der Katholischen Universität Löwen genehmigt. Die Patientinnen gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihres Eierstockgewebes zu Forschungszwecken.
1. Bestellung von Eizellen vom Tag 0, bei denen die Wahrscheinlichkeit hoch ist, dass sie embryoniert werden
<ol><li>Finden Sie einen zertifizierten, von Lohman ausgewählten Lieferanten von weißen Leghorn-Eiern in Laborqualität, der eine hohe Rate an embryonierten Eiern meldet, die in erster Linie vom Alter der Küken abhängt.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Eier für die Bebrütung
<ol><li>Vor der Ankunft der Eier den Eierbrutkasten zusammenbauen und auf 37 °C bei 40%-60% relativer Luftfeuchtigkeit ausbalancieren. Überwachen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit, indem Sie ein Thermometer und ein Hygrometer in den Inkubator einführen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel des Inkubators mit einem Glasfenster ausgestattet ist, damit die internen Parameter des Inkubators überprüft werden können, ohne ihn öffnen zu müssen (Abbildung 1).</li>
	<li>Nachdem Sie die Tag-0-Eier von von Lohman ausgewählten weißen Leghorn-Küken von einem zertifizierten Eierlieferanten in Laborqualität erhalten haben, reinigen Sie die Oberfläche der Schalen mit befeuchtetem Papier und trocknen Sie sie sofort. HINWEIS: Da die Eierschalenmembran porös ist, kann autoklaviertes Wasser verwendet werden, um die Eieroberflächen zu reinigen und die Luftfeuchtigkeit im Inkubator zu kontrollieren, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren.</li>
	<li>Beschriften Sie die Eier mit einem Marker (z. B. Datum und Einummer).</li>
	<li>Bebrüten Sie die Eier mit dem spitzen Ende nach unten und drehen Sie sie, damit sich das CAM entwickeln kann. Drehen Sie die Eier zwei- bis dreimal täglich manuell um 180° oder verwenden Sie einen automatischen Rotator. HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Eier tatsächlich gedreht werden, kann die Eierschale mit einem Bleistift oder Marker auf den beiden gegenüberliegenden Seitenseiten mit einem "X" und einem "O" markiert werden. Das Glasfenster im Deckel des Inkubators ermöglicht es, die Rotation der Eier zu überprüfen, ohne das Gerät zu öffnen.</li>
</ol>3. Öffnen der Eierschale am 3. Tag der ED
HINWEIS: Ein rechteckiges Fenster wird am Tag 3 der ED in die Eierschale gegossen.
<ol><li>Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube so vor, dass sie unter sterilen Bedingungen arbeiten kann. Platzieren Sie die folgenden Instrumente unter der Haube und desinfizieren Sie sie in 70%igem Ethanol (falls nicht bereits sterilisiert): -Eierregal -Eierkerze oder fokale Kaltlichtquelle -Markierung -Steriler gerader Stift -Sterile 19 G Nadel -5 ml sterile Spritze -Dekupiersägeblatt -Sterile Pinzette -Klebeband</li>
	<li>Legen Sie ein Ei aus dem Brutkasten in das Eierregal unter der Haube und schalten Sie den Eierrotator aus.</li>
	<li>Identifiziere im Dunkeln die Lufteinschlüsse des Eies, indem du den Eierkerzenkerl (oder die Brennlichtquelle) an die Eierschale legst. Die Lufttasche befindet sich am stumpfen Ende des Eies. Verwende einen Marker, um die Mitte der Lufttasche auf der Eierschale zu lokalisieren.</li>
	<li>Schalten Sie das Licht ein. Mache ein kleines Loch in die Eierschale, wo sie durch leichtes Drehen eines sterilen geraden Stecknadels markiert wird. Eine winzige Öffnung von etwa 1 mm Durchmesser ist in der Regel ausreichend. HINWEIS: Achten Sie darauf, den Stift nicht ganz durch das Ei zu drücken. In diesem Fall das Ei wegwerfen.</li>
	<li>Schließen Sie eine sterile 19-g-Nadel an eine sterile 5-ml-Spritze an.</li>
	<li>Lokalisieren Sie im Dunkeln den Dottersack mit dem Eierkerzen (oder der Brennlichtquelle) und stechen Sie das Ei durch das in Schritt 3.4 entstandene Loch mit der sterilen 19-G-Nadel, die in einem Winkel von 45° zum Boden des Eies geneigt ist. Achten Sie darauf, den Dottersack nicht zu stören. Saugen Sie zwischen 1,5 und 2 ml Eiweiß an, um das CAM von der Hülle zu lösen, und verschließen Sie das Loch dann mit einem Stück Klebeband. HINWEIS: Wenn der Dottersack während der Aspiration unterbrochen wird, ist die angesaugte Flüssigkeit in der Spritze gelb und nicht transparent (Eiweiß). Tauschen Sie in diesem Fall die Nadel und die Spritze aus. Wenn eine relativ große Menge Eigelb aufgesaugt wird, kann dies die Lebensfähigkeit des Embryos gefährden.</li>
	<li>Schalten Sie das Licht ein. Lege das Ei waagerecht hin und zeichne mit einem Filzstift ein rechteckiges Fenster mit den Maßen 1 cm x 1,5 cm. Machen Sie das Fenster nicht größer als die übliche Breite von Standardklebeband.</li>
	<li>Halten Sie das Ei in einer Hand und sägen Sie das zuvor gezeichnete Fenster vorsichtig mit einem Dekupiersägeblatt in die Eierschale. Achten Sie darauf, dass die Schale nicht reißt und schneiden Sie nicht bis zum gedrückten CAM ein. Blasen Sie regelmäßig, um Schalenstaub und Schmutz zu entfernen.</li>
	<li>Schieben Sie die sterile Pinzette unter das rechteckige Stück der gesägten Schale und fassen Sie sie geschickt an, um es sauber zu entfernen, ohne das CAM zu beschädigen. Werfen Sie zusätzlich die weiße äußere Schalenmembran ab, um den Embryo und seine CAM sehen zu können. HINWEIS: Wenn Eierschalenstaub oder Schmutz auf das CAM fällt, kann es mit einer sterilen Pinzette entfernt werden, wobei sehr darauf zu achten ist, dass das CAM nicht zerreißt.</li>
	<li>Identifizierung lebensfähiger embryonierter Eizellen. Sie sind an ihrem klaren Eiweiß und dem Gefäßring um den Embryo zu erkennen, wo manchmal sogar in diesem Stadium (Tag 3 der ED) ein schlagendes Herz festgestellt werden kann. Nicht befruchtete oder tote Embryonen verwerfen.</li>
	<li>Kleben Sie Klebeband über das neu geschaffene Fenster, um ein Austrocknen zu vermeiden. Achte darauf, dass du ein Ende über dich selbst klappst, um das Entfernen zu erleichtern.</li>
	<li>Legen Sie das Ei mit dem geöffneten Fenster nach oben zurück in den Inkubator, ohne dass das Klebeband das CAM berührt. Verwende ein gefaltetes Stück Papier oder einen Teil des Eierrosts, um zu verhindern, dass das Ei rollt. Vergewissern Sie sich, dass das Drehfach ausgeschaltet ist.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.12, um die restlichen Eier zu öffnen.</li>
</ol>4. Transplantation von gefrorenem und aufgetautem menschlichem Eierstockgewebe in die CAM
HINWEIS: Die Transplantation in das CAM sollte idealerweise zwischen dem 7. und 10. Tag der ED eingeleitet werden.
<ol><li>Kryokonservierte kortikale Streifen der Eierstöcke unter der Laminar-Flow-Haube nach dem an anderer Stelle beschriebenen Protokoll30 auftauen.</li>
	<li>Schneiden Sie die kortikalen Streifen in drei Fragmente von 4 mm x 2 mm x 1 mm. Verwenden Sie ein Stück als nicht transplantierte Kontrolle und die anderen beiden für die Xenotransplantation für 1 Tag oder 6 Tage. HINWEIS: Wenn genügend Gewebe vorhanden ist, in doppelter Ausführung arbeiten.</li>
	<li>Geben Sie ein Ei aus dem Brutkasten in das Eierregal, das sich unter der Haube befindet, mit dem Fenster nach oben.</li>
	<li>Ziehen Sie das Klebeband vom Fenster ab und stellen Sie sicher, dass der Embryo lebensfähig ist. In diesem Stadium zeichnen sich lebensfähige Embryonen durch ein ausgedehntes Gefäßsystem, ein klares Eiweiß, einen sichtbaren Herzschlag und eine gewisse Bewegung des Embryos aus.</li>
	<li>Bereiten Sie die Transplantationsstelle vor, indem Sie einen kleinen Bereich des CAM sanft traumatisieren, indem Sie einen 1 cm2 langen Streifen sterilen, etherextrahierten Linsenpapiers auf die Epitheloberfläche legen und sofort entfernen. HINWEIS: Die CAM ist eine undurchdringliche Barriere, es sei denn, die Membran wurde durch die Entfernung des oberen peridermalen Teils der Doppelepithelschicht traumatisiert, wobei die Basalschicht intakt bleibt. Diese Technik verbessert auch den Revaskularisierungsprozess, indem sie die Wundheilung aktiviert. Wenn das sterile, aus Ether extrahierte Linsenpapier zu lange auf dem CAM verbleibt, kann die Membran am Linsenpapier haften bleiben und reißen. In diesem Fall das Ei wegwerfen.</li>
	<li>Fassen Sie einen gefroren-aufgetauten kortikalen Streifen der Ovarialrinde (4 mm x 2 mm x 1 mm) mit einer mikrochirurgischen Pinzette und legen Sie ihn mit der medullären Seite gegen das CAM auf das traumatisierte CAM. Transplantieren Sie ein Gewebestück pro Eizelle.</li>
	<li>Decken Sie das Fenster mit Klebeband ab und legen Sie das Ei vorsichtig in den Brutkasten zurück. Achten Sie darauf, dass die Eierschalenöffnung aufrecht sitzt und das Ei sicher sitzt.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7 für die Transplantation aller verbleibenden Gewebe. HINWEIS: Die Implantate sollten an jedem Transplantationstag überprüft werden, um die Lebensfähigkeit des Embryos zu beurteilen und Veränderungen im Gefäßsystem zu überwachen.</li>
</ol>5. Entnahme der Transplantate
HINWEIS: Xenotransplantate sollten spätestens am 17. Tag der ED entnommen werden, da das Immunsystem des Embryos ab dem 18. Tag reif und kompetent ist.
<ol><li>Legen Sie das Ei auf ein Gestell und vergrößern Sie das Fenster in der Eierschale, um eine bessere Visualisierung des Transplantats und eine einfachere Handhabung zu ermöglichen.</li>
	<li>Beurteilen Sie das Transplantat makroskopisch und achten Sie besonders auf die vaskuläre Reaktion des CAM auf das Transplantat. Nehmen Sie digitale Fotos oder Videos für die Aufzeichnung auf.</li>
	<li>Fassen Sie das Gewebe oder das umgebende CAM mit einer Pinzette an und verwenden Sie eine Schere oder ein Skalpell, um das Transplantat vorsichtig aus dem CAM zu entfernen. HINWEIS: Die Transplantate werden etwa am 3. Tag der Transplantation mit einer zweiten CAM-Schicht bedeckt und schließlich eingekapselt. Es kann auch sein, dass sie sich am 6. Tag in das Ei bewegt haben, was es in einigen Fällen schwierig macht, sie zu finden.</li>
	<li>Analysieren Sie das herausgeschnittene Gewebe mit einer Methode, die für das jeweilige Experiment geeignet ist. In der vorliegenden Studie wurden Gewebestücke in Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, wobei die folgenden Schritte befolgt wurden:<ol><li>Die Fragmente werden 24 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert und mit einer automatischen Einbettvorrichtung in Paraffin eingebettet, wobei die in Tabelle 1 genannten Schritte ausgeführt werden.</li>
		<li>Lassen Sie die in Paraffin eingebetteten Blöcke über Nacht bei 4 °C stehen, bevor Sie sie mit einem Mikrotom in 5 μm dicke Abschnitte schneiden.</li>
		<li>Die Gewebeschnitte auf einem Objektträger auf einer heißen Platte (30 °C) verteilen und 2 h trocknen lassen, gefolgt von 24 h im Ofen bei 37 °C.</li>
		<li>Anschließend färben Sie die Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin nach einem an anderer Stelle beschriebenen Protokoll31. Anschließend digitalisieren Sie die Proben mit einem Objektträgerscanner und analysieren sie mit einer Bildanalysesoftware.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der schwierigste Teil des hier beschriebenen Protokolls besteht darin, das kleine Loch zu bohren, das zum Absaugen des Eiweißes erforderlich ist, um das CAM von der Eierschale zu lösen, bevor ein Fenster entsteht. Zu viel Druck kann zu einer übermäßigen Penetration führen oder sogar die Eizelle zerbrechen und zerstören, was zu einer unwiderruflichen Schädigung des CAM und seines Gefäßsystems führt. Um Fehler bei den ersten Versuchen, das CAM zu trennen, auf ein Minimum zu reduzieren, wird dringend empfohlen, das Bohren k...

Die Nachfrage nach Fertilitätserhalt bei onkologischen und gutartigen Indikationen sowie aus sozialen Gründen ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch gestiegen. Verschiedene Behandlungen, die zur Heilung von bösartigen und nicht-bösartigen Erkrankungen eingesetzt werden, sind jedoch hochtoxisch für die Keimdrüsen und können zu einer iatrogenen vorzeitigen Ovarialinsuffizienz führen, die letztendlich zu Unfruchtbarkeit führt1. Zu den etablierten Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit gehören die Kryokonservierung von Embryonen, die Vitrifikation unreifer oder reifer Eizellen und die Kryokonservierung von Eierstockgewebe 2,3,4. Das Einfrieren von Eierstockgewebe ist die einzige verfügbare Option zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei präpubertären Mädchen oder Frauen, die eine sofortige Krebstherapie benötigen. Die Wiederherstellung der endokrinen Funktion nach einer Transplantation von Eierstockgewebe tritt bei über 95 % der Patientinnen auf, wobei die Lebendgeburtenraten zwischen 18 % und 42 % liegen5,6,7,8,9.
Obwohl sich die Transplantation von gefrorenem und aufgetautem Eierstockgewebe bewährt hat, gibt es noch Raum für Verbesserungen. Da die kortikalen Fragmente der Eierstöcke ohne vaskuläre Anastomose transplantiert werden, erleben sie eine Phase der Hypoxie, in der die Revaskularisierung des Transplantats stattfindet 10,11,12. Die überwiegende Mehrheit der Studien, die die Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe untersuchen, haben ein Xenografting-Modell verwendet, bei dem Eierstockgewebe an immundefiziente Mäuse transplantiert wird. Die vollständige Revaskularisation der Xenotransplantate dauert etwa 10 Tage, wobei sowohl die Wirts- als auch die Transplantatgefäße zur Bildung funktioneller Gefäße beitragen 12,13,14. Etwa 50%-90% der Follikelreserve gehen während dieses hypoxischen Fensters vor Abschluss der Revaskularisation des Transplantats verloren 10,15,16. Es wurde stark vermutet, dass dieser massive Follikelverlust sowohl durch den direkten Follikeltod, wie er sich in einer Abnahme der absoluten Follikelzahl nach der Transplantation zeigt, als auch durch die Aktivierung des primordialen Follikelwachstums auftritt, was durch Veränderungen der Follikelproportionen in Richtung erhöhter Wachstumsraten der Follikel angezeigt wird17,18.
Interessanterweise haben frühere Forschungsarbeiten mit verschiedenen tierischen Eierstockgeweben, die auf die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens transplantiert wurden, die eine Konstitution hat, die die typische Transplantationsstelle des Peritoneums nachahmt, über die Hemmung der spontanen Follikelaktivierung berichtet, wobei die primordiale Follikelreserve bis zu 10 Tage intakt bleibt 19,20,21,22. Unser Team hat bereits gezeigt, dass die Transplantation von gefrorenem und aufgetautem menschlichem Ovarialgewebe in CAM einen zuverlässigen Ansatz für die Untersuchung der Transplantation von menschlichem Eierstockgewebe in ihren ersten ischämischen Stadien darstellt23 und kürzlich gezeigt, dass diese Transplantationsmethode in der Lage ist, der Follikelaktivierung entgegenzuwirken24.
Das CAM-Modell ist besonders attraktiv, nicht nur, weil Eizellen viel billiger sind als Mäuse, sondern auch wegen der stark vaskularisierten Natur der CAM, die es ermöglicht, den Zusammenhang zwischen Follikelaktivierung und Revaskularisierung des Eierstocktransplantats zu untersuchen. Das Vogelsystem ist in der Tat eine der gebräuchlichsten und vielseitigsten Methoden zur Untersuchung der Angiogenese25. Die Entwicklung des Kükenembryos (ED) dauert 21 Tage bis zum Schlüpfen, und das CAM wird innerhalb der ersten 4-5 Tage durch die Verschmelzung von Allantois und Chorion26 gebildet. Bemerkenswert ist, dass der Kükenembryo bis zum 17. Tag der ED ein von Natur aus immundefizienter Wirt ist, so dass Xenografting-Experimente ohne das Risiko einer Transplantatabstoßung durchgeführt werden können27,28. Darüber hinaus wirft der CAM-Modellansatz keine ethischen oder rechtlichen Bedenken im Sinne des europäischen Rechtsauf 29 und ist damit eine attraktive Alternative zu anderen Tiermodellen. In Bezug auf die Zuchtbedingungen benötigen Kükenembryonen nur einen auf 37 °C eingestellten Inkubator mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40%-60%. Diese begrenzten Versuchsanforderungen reduzieren die Forschungskosten im Vergleich zur Verwendung von immundefizienten Mäusen erheblich.
Das hier vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, die Entwicklung eines CAM-Xenografting-Modells für menschliches Ovarialgewebe zu beschreiben und spezifische Einblicke in die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen der Revaskularisation des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Transplantationszeitraum von 6 Tagen zu geben. Dieses Protokoll könnte von großem Interesse sein, um die Mechanismen hinter dem frühen Follikelverlust nach der Transplantation zu untersuchen und die Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe (Wachstumsfaktoren, Hormone usw.) auf dieses Phänomen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Agani Injektionsnadel, 19 G</td><td>Terumo Europe</td><td>AN*1950R1</td><td>19 G Nadel zum Aspirieren von Albumin</td></tr><tr><td>Terumo Spritze, 5 mL konzentrischer Luer-Lock</td><td>Terumo Europe</td><td>SS*05LE1</td><td>5 ml sterile Spritze</td></tr><tr><td>Caseviewer v2.2</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Merck Chemicals</td><td>603-022-00-4</td><td>Steriler Ether zur Traumatisierung des CAM</td></tr><tr><td>Eosin Y wässrige Lösung 0,5%</td><td>Merck</td><td>1098441000</td><td>Färbelösung</td></tr><tr><td>Formaldehyd 4% wässrige Lösung gepuffert (Formalin 10%)</td><td>VWR</td><td>97139010</td><td>Formaldehyd zur Gewebefixierung</td></tr><tr><td>Kühlschrank</td><td>Liebherr</td><td>7081260</td><td>Kühlschrank bei 4 > C für die Paraffineinbettung</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Schott</td><td>SLK2</td><td>Heizplatte zum Trocknen der Objektträger</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Forma Scientific 3111</td><td>10365156</td><td>Ofen für die Objektträgerinkubation</td></tr><tr><td>Leica CLS 150 XE Mikroskop Kaltlichtquelle</td><td>Leica</td><td>CLS 150 XE</td><td>Brennweite Kaltlichtquelle zum Kerzen der Eier</td></tr><tr><td>Linsenreinigungstuch, Güteklasse 541</td><td>VWR</td><td>111-5003</td><td>Gewebe zum Einweichen in sterilem Äther zur Traumatisierung des CAM</td></tr><tr><td>Mayer's Hämatoxylin</td><td>MERCK</td><td>1092491000</td><td>Färbelösung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td>Methanol</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>ThermoScientific-MICROM</td><td>HM325-2</td><td>Mikrotom</td></tr><tr><td>Pannoramic P250 Flash III</td><td>3DHISTECH</td><td>/</td><td>Slide Scanner bei 20-facher Vergrößerung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1,04,00,51,000</td><td>Paraffin-Einbettlösung</td></tr><tr><td>Paraplast Plus R</td><td>Sigma</td><td>P3683-1KG</td><td>Paraffin-Petrischale</td></tr><tr><td>, 60x15 mm, steril</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>sterile Petrischale</td></tr><tr><td>Pin-Halter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Pin-Halter</td></tr><tr><td>Polyhatch</td><td>Brinsea</td><td>CP01F</td><td>Ei-Inkubator mit automatischem Rotator</td></tr><tr><td>Dekupiersägeblatt, 132 mm</td><td>Sencys</td><td>/</td><td>Sägeblatt zum Erstellen eines Fensters in der Eierschale</td></tr><tr><td>Einsatzstifte aus Edelstahl</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02</td><td>Gerader Stift zum Bohren eines Lochs in die Eierschale</td></tr><tr><td>Steril-Helios&nbsp;</td><td>Angelantoni Industrie</td><td>ST-00275400000</td><td>Laminar-Flow-Haube</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Bords Stab &eacute; s 90°;</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>Objektträger&nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6Al</td><td>Sakura</td><td>60320417-0711 VID6E3-1</td><td>Automatisches Einbettungsgerät</td></tr><tr><td>Titanzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11602-16</td><td>Pinzette für die Entfernung von Eierschalen und die Manipulation von Eierstockgewebe</td></tr><tr><td>Toluol, pa</td><td>VWR</td><td>28701364</td><td>Paraffineinbettlösung</td></tr></tbody></table>

das modell der chorioallantoismembran (cam) von küken als werkzeug zur untersuchung der transplantation von eierstockgewebe

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Die Kryokonservierung und Transplantation von Eierstockgewebe ist eine wirksame Strategie zur Erhaltung der Fruchtbarkeit, hat jedoch einen großen Nachteil, nämlich den massiven Follikelverlust, der kurz nach der Reimplantation aufgrund einer abnormalen Follikelaktivierung und des Todes auftritt. Nagetiere sind Benchmark-Modelle für die Untersuchung der Follikelaktivierung, aber die Kosten, der Zeitaufwand und die ethischen Überlegungen werden immer unerschwinglicher, was die Entwicklung von Alternativen vorantreibt. Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken ist besonders attraktiv, da es kostengünstig ist und die natürliche Immundefizienz bis zum Tag 17 nach der Befruchtung aufrechterhält, was es ideal für die Untersuchung der kurzfristigen Xenotransplantation von menschlichem Eierstockgewebe macht. Das CAM ist auch stark vaskularisiert und wurde häufig als Modell zur Erforschung der Angiogenese verwendet. Dies verschafft ihm einen bemerkenswerten Vorteil gegenüber In-vitro-Modellen und ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen, die den frühen Follikelverlustprozess nach der Transplantation beeinflussen. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, die Entwicklung eines CAM-Xenografting-Modells für menschliches Ovarialgewebe zu beschreiben, mit spezifischen Einblicken in die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Transplantationszeitraum von 6 Tagen.

Überlebensraten von Kükenembryonen Die Überlebensrate des Embryos vom Fenstering (Tag 3 der ED) bis zur Transplantation von Eierstockgewebe (Tag 7 der ED) betrug 79% (33/42). Da der prozentuale Anteil der embryonierten Tag-0-Eier unbekannt ist, wurden überzählige Tag-0-Eier von Lohman-selektierten weißen Leghorn-Hühnern bestellt, um sicherzustellen, dass genügend embryonierte Eizellen für die Transplantation zur Verfügung stehen. Insgesamt wurden 23 lebensfähige Eizellen am Tag 7 für die Transplantati...

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung eines Xenotransplantatmodells für menschliches Ovarialgewebe und demonstrieren die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Zeitraum von 6 Tagen.

Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken als Werkzeug zur Untersuchung der Transplantation von Eierstockgewebe

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

Die Verwendung von CAM zur Beobachtung früher Veränderungen nach einer Transplantation von Eierstockgewebe hat einen erheblichen Vorteil gegenüber In-vitro-Modellen, da sie die Untersuchung von Mechanismen ermöglicht, die den Prozess der frühen Vaskularisierung und des Follikelverlusts beeinflussen. Diese Technik ist kostengünstig und kann in den ersten 17 Tagen ohne das Risiko einer Transplantatabstoßung aufgrund des natürlichen Immundefekts des Embryos durchgeführt werden. Darüber hinaus wirft dieser Ansatz keine ethischen oder rechtlichen Bedenken im Hinblick auf das europäische Recht auf.Die beste Strategie, um die manuellen Fähigkeiten zu entwickeln, die für die Manipulation von Eizellen erforderlich sind, kann durch das Training mit nicht-embryonierten Eizellen vor dem eigentlichen Experiment erreicht werden. Zu Beginn beschriften Sie die Eier des Tages Null, die Sie von Löwen-ausgewählten weißen Leghornküken erhalten haben, mit einem Marker. Bebrüten Sie die Eier in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator, wobei die spitzen Enden nach unten zeigen.Drehen Sie die Eier zwei- bis dreimal täglich manuell um 180 Grad. Stellen Sie im Dunkeln eine Eierkerze an die Eierschale und markieren Sie die Mitte der Lufttasche auf der Eierschale mit einem Filzstift. Schalten Sie das Licht ein und drehen Sie einen sterilen geraden Stift an der markierten Stelle, um eine Öffnung von etwa einem Millimeter zu machen.Finde den Dottersack im Dunkeln mit dem Eierkerl. Stechen Sie das Ei mit einer sterilen 19-Gauge-Nadel ein, die in einem Winkel von 45 Grad zum Boden des Eies geneigt ist, ohne den Dottersack zu beschädigen. Saugen Sie 1,5 bis zwei Milliliter des Albumins an, um das CAM von der Hülle zu lösen.Anschließend das Loch mit Klebeband verschließen. Schalten Sie das Licht ein und zeichnen Sie ein rechteckiges Fenster von einem mal 1,5 Zentimeter auf das horizontal platzierte Ei. Halten Sie das Ei in einer Hand und schneiden Sie mit einem Dekupiersägeblatt vorsichtig ein Fenster in die Eierschale, ohne die Schale zu zerbrechen.Blasen Sie regelmäßig, um Schalenstaub und Schmutz zu entfernen. Schieben Sie die sterile Pinzette unter das rechteckige Stück Schale und entfernen Sie es sauber, ohne das CAM zu beschädigen. Werfen Sie dann die weiße äußere Schalenmembran ab, um den Embryo und das CAM zu sehen.In lebensfähigen embryonierten Eiern sind am dritten Tag der Embryonalentwicklung des Kükens klares Albumin, ein Gefäßring um den Embryo und manchmal ein schlagendes Herz zu sehen. Legen Sie das Ei unter der Laminar-Flow-Haube mit dem Fenster nach oben auf den Eierrost und ziehen Sie das Klebeband ab. Legen Sie vorsichtig einen einen Zentimeter quadratischen Streifen steriles, etherextrahiertes Linsenpapier auf die Epitheloberfläche und entfernen Sie ihn sofort, um einen kleinen Bereich des CAM zu traumatisieren.Fassen Sie dann einen gefrorenen, aufgetauten kortikalen Streifen der Eierstöcke mit einer mikrochirurgischen Zange und legen Sie ihn mit der medullären Seite gegen das CAM auf das traumatisierte CAM. Beurteilen Sie das Transplantat makroskopisch und achten Sie besonders auf die vaskuläre Reaktion des CAM auf das Transplantat, bevor Sie digitale Fotos oder Videos aufnehmen. Wenn Sie fertig sind, entnehmen Sie das Transplantat, indem Sie das Gewebe oder die umgebende CAM mit einer Zange fassen und das Transplantat vorsichtig mit einer Schere aus dem CAM herausschneiden.Die Transplantate waren in 100% der Fälle nach dem ersten Tag der Transplantation lebensfähig. Sie waren bereits teilweise am CAM anhaftend und zeigten das Radspeichenmuster der Blutgefäße, die für ihre Vaskularisierung benötigt werden. Nach sechs Tagen der Transplantation wurden die Implantate auf das CAM geklebt.Etwa am dritten Tag nach der Transplantation wurden die Transplantate mit einer zweiten Schicht CAM bedeckt und verkapselt. Das Transplantat zeigte eine gute Vaskularisation, wobei 80% der Transplantate in die Eizelle eindrangen. Zwei Transplantate hefteten sich nicht an das CAM und nahmen ein nekrotisches Aussehen an, was zu einer Überlebensrate des transplantierten Gewebes von 83 % nach sechs Tagen führte.Bei der histologischen Auswertung des Transplantats wurden zu allen Zeitpunkten gesunde Follikel beobachtet. Nach der Transplantation wurde eine unbedeutende Abnahme der Follikeldichten beobachtet. Die Überlebensraten der Follikel wurden während der Transplantationsphase am ersten Tag bei 95 % und am sechsten Tag bei 83 % gehalten.Die größte Herausforderung besteht darin, das kleine Loch zu bohren, das zum Absaugen des Albumins erforderlich ist, um das CAM von der Eierschale zu lösen, bevor ein Fenster zum Auftragen erstellt wird. Zu viel Druck kann zu einer Überstimulation führen oder sogar die Eizelle zerbrechen und zerstören, was zu einer unwiderruflichen Schädigung des CAM oder seines Gefäßsystems führen kann. Dieses Modell ist ideal, um verschiedene Aspekte der frühen Phase des Eierstockgewebes nach der Transplantation zu testen, einschließlich der Auswirkungen von pro-angiogenetischen Faktoren, schützenden antioxidativen Wirkstoffen, Zytokinen, Hormonen und anderen Faktoren, die die Follikelaktivierung und das frühe Wachstum steuern.Dieses Modell zeigte den Zusammenhang zwischen der frühen Vaskularisierung und der Modulation der Follikelaktivierung, den beiden Hauptereignissen, die zu einer Abnahme der ovariellen Reserve nach einer Transplantation von Eierstockgewebe führen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Küken Chorioallantoismembran (CAM) ist eine einzigartige, natürlich immundefizienten unterstützende Kultur Umwelt, die Angiogenese und Tumorentstehung zu untersuchen. Dieses Video Artikel zeigt die verschiedenen Schritte in...

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Die<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom

Die chorioallantoische Membran (CAM) des Kükens ist immundefizient und stark vaskularisiert, was sie zu einem natürlichen in vivo Modell des Tumorwachstums und der Angiogenese macht. In diesem Protokoll beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Züchtung dreidimensionaler, vaskularisierter hepatozellulärer Karzinome (HCC) mit Hilfe des CAM-Assays.

Das<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Chorioallantoismembran (CAM) Assay als effiziente Xenograftmodell des hepatozellulären Karzinoms

Perineurale Invasion ist ein aggressiver Phänotyp für Kopf- und Halsplattenkarzinome und andere Tumoren. Das Küken-Chorioallanto-Membranmodell wurde zur Untersuchung von Angiogenese, Krebsinvasion und Metastasierung verwendet. Hier zeigen wir, wie dieses Modell genutzt werden kann, um die perineurale Invasion in vivo zu bewerten.

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Wir präsentieren das Hähnchenchorioallanto-Membranmodell als alternatives, transplantierbares In-vivo-Modell zur Transplantation gynäkologischer und urologischer Krebszelllinien und von Patienten abgeleiteter Tumoren.

Verwendung des Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Modells zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebsarten

Dieses Protokoll beschreibt drei Methoden zur Gewinnung und Verwendung von 5 bis 8 Tage alten Hühnerembryonen und ihrer Chorioallanto-Membran (CAM) als In-vivo-Modell zur Untersuchung der kontrastverstärkten Ultraschallbildgebung und der Mikroblasen-vermittelten Wirkstoffabgabe.

Die Herstellung von Hühner-Ex-Ovo-Embryonen und chorioallantoischen Membrangefäßen als In-vivo-Modell für kontrastmittelverstärkte Ultraschallbildgebung und Mikroblasen-vermittelte Arzneimittelabgabestudien

Die chorioallantoische Membran (CAM) des Vogelembryos ist ein sehr nützliches und anwendbares Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. Ein spezielles Ex-Ovo-Modell der japanischen Wachtel-CAM eignet sich für die photodynamische Behandlungsuntersuchung.

Wachtel-Chorioallanto-Membran - ein Werkzeug für die photodynamische Diagnose und Therapie

Erfahren Sie das CAM-Xenotransplantationsmodell bei Küken zur Untersuchung menschlichen Eierstockgewebes. Diese Methode ermöglicht die Analyse früher Vaskularisation und Follikelüberlebensraten in vivo.

Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken als Werkzeug zur Untersuchung der Transplantation von Eierstockgewebe

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