Name: Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Erfahren Sie die impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyse zur Überwachung morphologischer Veränderungen in HUVECs nach Virusinfektion. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die kontinuierliche Erfassung transienter Effekte wie Zellablösung und Gefäßleckage.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde vom malaysischen Ministerium für Hochschulbildung im Rahmen des Programms Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) und im Rahmen des Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) unterstützt.

1. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Vorbereitung von HUVECs<ol><li>Züchten Sie 7,5 x 105 HUVEC-Zellen/ml in einer 75 cm2 (beschichtet mit 20 μg/ml Kollagen Typ 1) Zellkulturflasche, die 12 ml Endothelzellmedium (ECM) enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 0,01 % Endothelzellwachstumsergänzung (EKG), die Wachstumsfaktoren, Hormone und Proteine enthält, die für die Kultur von HUVECs erforderlich sind. und 0,01% Penicillin-Streptomycin (P/S). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 (Abbildung 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aufbau des RTCA-Experiments
<ol><li>Widerstandsverifizierung auf RTCA<ol><li>Doppelklicken Sie auf das Symbol der RTCA-Software auf dem Desktop, um die Anwendung zu starten. Ein Anmeldefenster wird angezeigt, geben Sie den Benutzernamen und das Passwort ein, um sich anzumelden.</li>
		<li>Platzieren Sie eine 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.</li>
		<li>Geben Sie auf der Registerkarte "Exp Notes " der RTCA-Software den Namen des Experiments, die SN des Geräts und den Gerätetyp (QC-Platte) ein.</li>
		<li>Markieren Sie auf der Registerkarte "Layout " unter der Registerkarte "Zelle " der RTCA-Software alle Wells und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert (ausgegraut) sind.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte Zeitplan der RTCA-Software auf Step_1. Geben Sie Sweeps: 10 und Intervall: 30 s ein. Klicken Sie auf Übernehmen. Klicken Sie in der oberen linken Ecke der Software auf Start/Fortfahren , um den Verifizierungslauf zu starten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Anschluss der Wells an die RTCA-Station in Ordnung ist, indem Sie "Plate Scanned. Verbindungen OK" am Ende der Seite.</li>
	</ol></li>
	<li>Widerstandsverifizierungslauf zur Datenanalyse<ol><li>Überprüfen Sie auf der Registerkarte Zellenindex die Daten nach Abschluss der Ausführung. Alle CI-Werte sollten kleiner als 0,063 sein.</li>
		<li>Überprüfen Sie im unteren Teil der Registerkarte Zellenindex die Rohdaten des Scans. Die Rohscandaten sollten wiederholte Wertemuster von 40,0 ± 2,0 (Zeilen A und H), 67,5 ± 2,5 (Zeilen B und G), 93,6 ± 2,9 (Zeilen C und F) und 117,6 ± 3,2 (Zeilen D und E) aufweisen.</li>
		<li>Um den Überprüfungslauf zu beenden, klicken Sie auf Platte > Trennplatte. Die 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte kann nun aus der RTCA-Station entfernt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Einholung von Hintergrundinformationen zu RTCA<ol><li>Waschen Sie die mit Kollagen Typ 1 beschichtete spezielle Gold-Mikroelektrodenplatte (beschichtet mit 20 μg/ml Kollagen Typ 1) mit 60 μl/well Hank's ausgewogener Salzlösung (HBSS; mit Natriumbicarbonat, ohne Calciumchlorid und Magnesiumsulfat) 2x.</li>
		<li>Verwerfen Sie das verbleibende HBSS und fügen Sie 50 μl/Well ECM hinzu. Platzieren Sie die spezielle Gold-Mikroelektrodenplatte, die die EZM enthält, mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.</li>
		<li>Geben Sie auf der Registerkarte "Exp Notes " der RTCA-Software den Namen des Experiments, die Geräte-SN und den Gerätetyp (96-Well-Format) ein.</li>
		<li>Markieren Sie auf der Registerkarte "Layout " unter der Registerkarte "Zelle " der RTCA-Software die Wells, die verwendet werden sollen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert (ausgegraut) sind.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte "Zeitplan " der RTCA-Software auf Step_1 und dann auf "Start/Fortfahren " in der oberen linken Ecke der Software, um eine Hintergrundanzeige zu erhalten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Anschluss der Vertiefungen korrekt ist, indem Sie "Plate Scanned. Verbindungen OK" am Ende der Seite.</li>
		<li>Sobald die Hintergrundmessung erfolgt ist, ist die spezielle Gold-Mikroelektroden-Platte nun bereit für die Zellaussaat und kann von der RTCA-Station entfernt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>HUVEC-Präparation in der spezialisierten Gold-Mikroelektroden-Platte<ol><li>Säen Sie die HUVECs in die spezielle Gold-Mikroelektroden-Platte mit 50 μl/Well konditioniertem Medium, 1 x 104 Zellen/Well (konditioniertes Medium: ECM ergänzt mit 10 % FBS, 0,01 % EKGs und 0,01 % P/S). Legen Sie die Platte mit der Vertiefung A1 nach innen zurück in die RTCA-Station, um sie über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 zu inkubieren. HINWEIS: Die Zellsuspension wurde mit einem Verdünnungsfaktor von zwei mit einem Hämozytometer gezählt.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte Zeitplan in der oberen linken Ecke auf Schritt hinzufügen . Klicken Sie auf Step_2 und ändern Sie die Sweeps: 601 und Intervall: 2 Minuten. Klicken Sie auf Übernehmen. Klicken Sie auf Step_2 und klicken Sie auf Start/Weiter in der oberen linken Ecke der Software.</li>
		<li>Nach 20 Stunden Inkubation und wenn die CI-Werte auf der Registerkarte "Well Graph " ein Plateau zeigen, ist die Platte bereit für die Infektion. Klicken Sie auf der Registerkarte "Zeitplan " der RTCA-Software auf "Schritt abbrechen".</li>
		<li>Die spezielle Gold-Mikroelektroden-Platte kann nun für die nächsten Schritte aus der RTCA-Station entfernt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Virusinfektion bei HUVECs
<ol><li>Verdünnung des Virus<ol><li>Die ZIKV-Stammkultur wird bei -80 °C gehalten. Für diese Studie wird der in den kryogenen Fläschchen aufbewahrte Virusvorrat entfernt und der ZIKV-Stamm mit serumfreier ECM in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen verdünnt, um eine Vielzahl von Infektionen (MOIs) von 0,1 und 1 zu erreichen. HINWEIS: Der ZIKV-Stamm wurde zuvor durch die Vermehrung in Vero-Zellen und die Ernte des ZIKV-Überstandes34 hergestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Infektion der Zellmonoschicht<ol><li>Entfernen und entsorgen Sie das konditionierte Medium (ECM ergänzt mit 10 % FBS, 0,01 % EKGS und 0,01 % P/S) aus jeder Vertiefung. Spülen Sie jede Vertiefung 2x mit 60 μl HBSS aus. Setzen Sie das HBSS mit Hilfe der Seite der Vertiefung ein; Schießen Sie nicht auf die Zellmonoschicht.</li>
		<li>Von der höchsten bis zur niedrigsten Verdünnung 40 μl jeder verdünnten Virusprobe in serumfreier ECM in die Vertiefung geben. Verdreifachen Sie die Vertiefung für jede Verdünnung und halten Sie sechs Vertiefungen ohne Infektion (Negativkontrolle und Positivkontrolle Thrombin). Schießen Sie nicht auf die Zellmonoschicht; Geben Sie stattdessen das verdünnte Virus mit Hilfe der Seite der Vertiefung hinzu. Verwenden Sie für jedes Einführen eine frische Pipettenspitze. HINWEIS: Thrombin wurde als Positivkontrolle gewählt, da es die endotheliale Permeabilität von HUVECs schnell erhöhen kann.</li>
		<li>Die Platte wird in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubiert, um eine Virusadsorption zu ermöglichen. Schwenken Sie die Platte 5x alle 15 Minuten, um die Adsorption des Virus in der gesamten Zellmonoschicht zu ermöglichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zugabe des Overlay-Zellkulturmediums<ol><li>Nach 1 Stunde Inkubation wird die Virussuspension von der niedrigsten zur höchsten Konzentration entfernt und verworfen.</li>
		<li>Waschen Sie die infizierten Zellen 2x mit 60 μl HBSS. Überlagern Sie die Bohrung mit ECM, ergänzt mit 2 % FBS. Für die Positivkontrollvertiefungen wird das Thrombin auf 20 U/ml mit ECM verdünnt, das mit 2 % FBS ergänzt wurde, und die Vertiefungen mit thrombinhaltigem ECM-Medium überlagert. Schießen Sie nicht auf die Zellmonoschicht; Fügen Sie stattdessen Overlay-Medien mit Hilfe der Seite des Wells hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>Einsetzen der infizierten spezialisierten Gold-Mikroelektroden-Platte zurück in die RTCA-Station<ol><li>Klicken Sie auf der Registerkarte Zeitplan in der oberen linken Ecke auf Schritt hinzufügen . Klicken Sie auf Step_3 und ändern Sie die Sweeps: 3.601 und Intervall: 2 min. Klicken Sie auf Übernehmen.</li>
		<li>Klicken Sie im angezeigten Popup-Fenster auf OK . Legen Sie die infizierte spezialisierte Gold-Mikroelektroden-Platte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.</li>
		<li>Klicken Sie auf Step_3 und klicken Sie auf Start/Weiter in der oberen linken Ecke der Software.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenanalyse und Datenexport
<ol><li>Hinzufügung von experimentellen Informationen zu jeder Bohrung<ol><li>Klicken Sie auf der Registerkarte Layout auf die Registerkarte Zelle (Abbildung 2A). Um die Zielzelleninformationen einzugeben und den Well-Typ für jede Well-Position zu bestimmen, markieren Sie die Well-Markierung und geben Sie den Namen, die Nummer und die Farbe der Zielzelle am unteren Rand der Software ein. Klicken Sie auf Übernehmen (Abbildung 2B).</li>
		<li>Um den Well-Typ für jedes Well auf der Registerkarte "Zelle " auszuwählen und zu bestimmen, markieren Sie das Well, wählen Sie den Well-Typ (Probe, Positivkontrolle oder Negativkontrolle) aus und klicken Sie auf Festlegen.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte "Layout " auf die Registerkarte "Behandlung " (Abbildung 2C). Um Behandlungsinformationen einzugeben, markieren Sie die Vertiefung und geben Sie den Behandlungsnamen, die Konzentration der Behandlung, die Einheit und die Farbe ein. Klicken Sie auf Übernehmen (Abbildung 2D).</li>
		<li>Um den Well-Typ für jedes Well auf der Registerkarte Behandlung auszuwählen und zu bestimmen, markieren Sie das Well, wählen Sie den Well-Typ (Probe, Positivkontrolle oder Negativkontrolle) aus, und klicken Sie auf Festlegen. HINWEIS: Für jede Auswahl können mehrere Wells gleichzeitig hervorgehoben werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalisierung des CI-Wertes<ol><li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die rechte Seite der Registerkarte Datenanalyse, und wählen Sie im Dropdown-Feld Y-Achse die Option Normalisierter Zellenindex aus (Abbildung 3A). Wählen Sie im Abschnitt X-Achse unten die normalisierte Zeit als den letzten gemessenen Zeitpunkt aus, an dem die spezialisierte Gold-Mikroelektroden-Platte wegen Infektion entfernt wurde (Abbildung 3B). HINWEIS: Der von der Software durchgeführte Normalisierungsprozess beseitigt den größten Teil der Variabilität aufgrund der Unterschiede bei der Aussaat und Bindung von Bohrlöchern, solange der gewählte Normalisierungspunkt vor der Zugabe des Virus und/oder der Behandlung liegt. Daher sollte der optimale Zeitpunkt für die Normalisierung der letzte Zeitpunkt vor der Virus- und/oder Behandlungszugabe sein. Der Zeitpunkt für die Normalisierung kann auf der Registerkarte Zeitplan unter Step_2 überprüft werden. Die angegebene Gesamtzeit ist der Zeitpunkt für die Normalisierung (Abbildung 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Darstellen der erhaltenen Daten mit RTCA-Software<ol><li>Wählen Sie auf der Registerkarte Datenanalyse die Wells aus, die dem Diagramm hinzugefügt werden sollen, indem Sie die Wells markieren und auf << Hinzufügen klicken. Der normalisierte Zellenindex für das Zeitdiagramm kann nun kopiert und exportiert werden. Stellen Sie sicher, dass Sie das Kontrollkästchen Durchschnitt aktivieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Exportieren von Daten mit RTCA-Software<ol><li>Klicken Sie in der oberen linken Ecke der RTCA-Software auf Plate > Export Experiment Info.... Aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um die zu exportierenden Daten auszuwählen. Klicken Sie auf OK. HINWEIS: Rohdaten (CI-Rohwerte) können exportiert werden, wenn Zellenindex > Alle aktiviert ist.</li>
		<li>Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Exportdatei gespeichert werden soll. Klicken Sie auf SPEICHERN. Es erscheint ein Pop-up-Fenster, das den Export von experimentellen Informationen anzeigt. Sobald der Export abgeschlossen ist, wird ein weiteres Fenster angezeigt, in dem die exportierten Experimentinformationen angezeigt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Eine zytozide Virusinfektion in permissiven Zellen ist in der Regel mit erheblichen Veränderungen der Zellmorphologie und Biosynthese verbunden36. Die virusinduzierten zellulären morphologischen Veränderungen, wie Zellschrumpfung, Zellvergrößerung und/oder Synzytienbildung, werden auch als zytopathische Effekte (CPEs) bezeichnet, die für bestimmte Virusinfektionen charakteristisch sind37. In ECs wurde das CPE als die Zerstörung von Zellen und den Zusammenbruch der Tight Jun...

Endothelzellen (ECs) kleiden die innere Oberfläche aller Blut- und Lymphgefäße aus. Sie sind durch Adhären, enge Gap Junctions, verbunden, die eine semipermeable Barriere zwischen Blut oder Lymphe und dem umgebenden Gewebe bilden 1,2. Die intakten endothelialen Zell-Zell-Verbindungen sind entscheidend für die Regulierung des Transports von Makromolekülen, gelösten Stoffen und Flüssigkeiten, die für die physiologischen Aktivitäten der entsprechenden Gewebe und Organe entscheidend sind3. Die Endothelbarriere ist dynamisch und wird durch spezifische Stimuli moduliert4. Die Störung oder der Verlust der endothelialen Barrierefunktion ist ein Kennzeichen der Pathophysiologie der Krankheit bei akuten und chronischen Entzündungen in der Pathogenese vieler Krankheiten 5,6,7, einschließlich Virusinfektionen 8,9,10,11. Für Flaviviren wurde festgestellt, dass das Nicht-Strukturprotein NS1 die endotheliale Permeabilität verändern kann, z. B. durch eine Störung der endothelialen Glykokalyx-ähnlichen Schicht als Folge einer erhöhten Expression und Aktivierung von Cathepsin L, Sialidasen und Endoglycosidase-Heparinase9. Im Krankheitszustand ist die Integrität der endothelialen Monoschicht beeinträchtigt und die Zell-Zell-Verbindungen sind gestört, was zu endothelialen Verletzungen und Funktionsstörungen führen kann12 und schließlich zu weit verbreiteten pathologischen Manifestationen in mehreren Organsystemen13,14. Eine Virusinfektion von ECs führt zu Veränderungen der zellulären Signalwege und des zellulären Genexpressionsprofils, die die Flüssigkeitsbarrierefunktionen beeinträchtigen, eine Störung der ECs verursachen und Gefäßleckagen induzieren können10,15. Es wurde festgestellt, dass eine Infektion von ECs mit dem Zika-Virus (ZIKV) die Integrität der Verbindung stört, was zu Veränderungen der Gefäßpermeabilität führt und zu einer Dysfunktion der endothelialen Barriere führt, was zu Gefäßleckagen führt10,15. Studien haben gezeigt, dass das ZIKV mit schweren Geburtsfehlern in Verbindung gebracht wird; Über den genauen Mechanismus, durch den dies geschieht, ist jedoch nicht viel bekannt16,17. Das Verständnis der Veränderungen der endothelialen Barriere während einer Infektion ist daher entscheidend, um den Krankheitsmechanismus zu verstehen.
ECs werden derzeit als wichtiges experimentelles in vitro vaskuläres Modellsystem für verschiedene physiologische und pathologische Prozesse verwendet 18,19,20,21. Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wurden in großem Umfang als primäres, nicht immortalisiertes Zellsystem verwendet, um das vaskuläre Endothel und die Gefäßbiologie in vitro zu untersuchen 22,23,24,25. HUVECs wurden erstmals in den frühen 1970er Jahren für die In-vitro-Kultur aus der Nabelvene der menschlichen Nabelschnur isoliert26. HUVECs haben eine kopfsteinpflasterartige Morphologie, die sich im Labor leicht vermehren lässt. Aufgrund der Scherspannung nach längerer Verharrung im konfluenten Zustand wird eine Dehnung der Zellform beobachtet. HUVECs können durch das Vorhandensein von Weibel- und Palade-Körperchen (WPB), pinozytären Vesikel, kleinen Mengen von Fibrillen in der Nähe des Zellkerns, Mitochondrien mit röhrenförmigen Formen, die selten Verästelungen zeigen, einem ellipsoiden Kern mit einem feinkörnigen Muster aus kondensiertem Chromatin und ein bis drei Nukleolen in jedem Kern charakterisiertwerden 27. Obwohl HUVECs zahlreiche morphologische Merkmale aufweisen, kann die Identifizierung von HUVECs nicht allein durch optische Untersuchung erreicht werden. Assays, wie z. B. die Immunfluoreszenzfärbung von vaskulärem endothelialem (VE)-Cadherin, werden häufig zur Überwachung der vaskulären Integrität in HUVECs verwendet 28,29,30,31.
Diese Studie beschreibt das Echtzeit-Zellanalyseprotokoll (RTCA) der Infektion von HUVECs. Das RTCA-System verwendet spezielle goldbeschichtete Platten mit Mikroelektroden, die eine leitfähige Oberfläche für die Zellbefestigung bieten. Wenn sich die Zellen an die Mikroelektrodenoberfläche anheften, bildet sich eine Barriere, die den Elektronenfluss durch die Mikroelektroden behindert. Die Messung der von Mikroelektroden erzeugten Impedanz kann verwendet werden, um Informationen über einige zelluläre Prozesse zu gewinnen, einschließlich Zellanhaftungen, Proliferation und Migration32. Bei dem vorgestellten Assay handelt es sich um einen impedanzbasierten zellulären Assay, der in Verbindung mit einem Echtzeit-Zellanalysator eine kontinuierliche Messung der Proliferation lebender Zellen, morphologischer Veränderungen (z. B. Zellschrumpfung) und der Zelladhäsionsqualität auf nichtinvasive und markierungsfreie Weise ermöglicht. In dieser Studie wird der Echtzeit-Zellanalysator verwendet, um die endotheliale Integrität und morphologische Veränderungen von HUVECs während der ZIKV-Infektion zu überwachen. Kurz gesagt, das Gerät misst den Elektronenfluss, der in speziellen Gold-Mikroelektroden-beschichteten Mikrotiterplatten in Gegenwart eines Nährmediums (elektrisch leitfähige Lösung) übertragen wird. Zelladhärenz oder Änderungen der Zellzahl und -morphologie stören den Elektronenfluss und verursachen Impedanzschwankungen, die vom Gerät erfasst werden können (ergänzende Abbildung 1). Die Differenz zwischen HUVEC-Wachstum, -Proliferation und -Adhärenz vor und nach der ZIKV-Infektion wird in Echtzeit durch ein elektrisches Impedanzsignal aufgezeichnet und dann in den Zellindex (CI) übersetzt. Der CI-Wert aus der Vorinfektion wird als Ausgangswert für die Normalisierung des CI-Werts verwendet. Die Veränderungen der CI-Werte spiegeln zellmorphologische Veränderungen oder den Verlust der Zelladhärenz bei der Infektionwider 33. Die Studienergebnisse zeigen, dass das RTCA-Protokoll den Nachweis von transienten Effekten oder zellmorphologischen Veränderungen während der Virusinfektion im Vergleich zu einem Endpunkt-Assay, wie z.B. der Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin, ermöglicht. Die RTCA-Methode könnte nützlich sein, um die Veränderungen der vaskulären Integrität von HUVEC bei einer Infektion mit anderen Viren zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Nest</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 > C Inkubator mit 5% CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekulturflasche&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikalösung Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank, Klasse II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ 1</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen (EKGS)</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellmedium (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-Platte 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232368001</tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Laboroptik LTD</td><td>Neubauer verbessert</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellen (HUVECs)</td><td>Sciencell</td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520 Laptop</td><td>Dell</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanal-Mikropipette (10 - 100 & Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanal-Mikropipette (30 - 300 & Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzienhalter</td><td>Tarsons</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>RTCA-Widerstandsplatte 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232350001</tr><tr><td>RTCA Software Pro (Version 2.6.1)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>5454433001</tr><tr><td>Einkanalpipetten (10 - 100 & Mikropipetten; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Einkanalpipetten (100 - 1000 & Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Einkanalpipetten (20 - 200 & Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Echtzeit-Zellanalysator SP (Modell: W380)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

Überwachung von veränderungen in menschlichen nabelschnurvenen-endothelzellen nach virusinfektion mittels impedanzbasierter echtzeit-zellanalyse

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

Endothelzellen kleiden die innere Oberfläche aller Blut- und Lymphgefäße aus und bilden eine semipermeable Barriere, die den Austausch von Flüssigkeit und gelösten Stoffen zwischen Blut oder Lymphe und dem umgebenden Gewebe reguliert. Die Fähigkeit eines Virus, die Endothelbarriere zu überwinden, ist ein wichtiger Mechanismus, der die Ausbreitung des Virus im menschlichen Körper erleichtert. Es wird berichtet, dass viele Viren die endotheliale Permeabilität verändern und/oder während der Infektion eine Störung der Endothelzellbarriere verursachen, was zu Gefäßleckagen führen kann. Die aktuelle Studie beschreibt ein Echtzeit-Zellanalyseprotokoll (RTCA), bei dem ein kommerzieller Echtzeit-Zellanalysator verwendet wird, um die endotheliale Integrität und Permeabilität während einer Infektion der menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) mit dem Zika-Virus (ZIKV) zu überwachen. Die vor und nach der ZIKV-Infektion aufgezeichneten Impedanzsignale wurden in Zellindexwerte (CI) übersetzt und analysiert. Das RTCA-Protokoll ermöglicht den Nachweis von transienten Effekten in Form von zellmorphologischen Veränderungen während einer Virusinfektion. Dieser Assay könnte auch nützlich sein, um Veränderungen in der vaskulären Integrität von HUVECs in anderen Versuchsanordnungen zu untersuchen.

Vor der ZIKV-Infektion lag das CI für die HUVEC-Monoschicht, die auf einer speziellen Gold-Mikroelektroden-beschichteten Mikrotiterplatte kultiviert wurde, über 8, was auf starke Adhärenzeigenschaften hindeutet. Platten oder Vertiefungen mit einem CI-Index von weniger als 8 sollten verworfen werden. Die HUVECs wurden dann mit ZIKV bei einem MOI von 0,1 und 1 infiziert, und die Zellimpedanz wurde 7 Tage lang aufgezeichnet. Der KI-Wert der mit ZIKV P6-740 infizierten HUVECs bei einem MOI von 0,1 (hellblaue Linie) begann 15...

Die aktuelle Studie beschreibt ein Protokoll zur Überwachung der Veränderungen in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) während einer Virusinfektion mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysesystems (RTCA).

Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse

Endothelial cells line the inner surface of all blood and lymphatic vessels, creating a semi-permeable barrier regulating fluid and solute exchange ...

Dieses Protokoll ermöglichte den kontinuierlichen Nachweis eines vorübergehenden Effekts in Form einiger morphologischer Veränderungen während einer Virusinfektion, wie z. B. Ablösung und Schweben von adhärenten Zellen. Dieses Protokoll ermöglichte einen nicht-invasiven und arbeitsintensiven Ansatz zur kontinuierlichen Überwachung zellulärer morphologischer Veränderungen und zur Erfassung vorübergehender Effekte wie Gefäßleckagen, die durch den Endpunkt-Assay übersehen werden könnten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Veränderungen der vaskulären Integrität anderer Zelllinien in verschiedenen Versuchsanordnungen zu analysieren, wenn es sich bei den Zellen um adhärente Zellen handelt.Nachdem Sie die HUVECs vorbereitet haben, starten Sie die RTCA-Softwareanwendung mit einem Doppelklick auf das Symbol auf dem Desktop. Geben Sie den Benutzernamen und das Passwort in das Anmeldefenster ein. Platzieren Sie eine 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator.Wechseln Sie dann zur Registerkarte "Experimentnotizen" der RTCA-Software, und geben Sie den Namen des Experiments, die Seriennummer des Geräts und den Gerätetyp ein. Markieren Sie auf der Registerkarte "Layout" unter der Registerkarte "Zelle" der RTCA-Software alle Wells und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert sind. Öffnen Sie als Nächstes die Registerkarte "Zeitplan" der RTCA-Software.Klicken Sie auf Step_1, und legen Sie die Sweeps auf 10 und das Intervall auf 30 Sekunden fest. Klicken Sie dann in der oberen linken Ecke der Software auf "Starten", um den Überprüfungslauf zu starten. Öffnen Sie nach der Ausführung die Registerkarte Zellenindex, um die Daten zu überprüfen.Alle Zellindexwerte sollten kleiner als 0,063 sein. Überprüfen Sie dann die Scan-Rohdaten im unteren Teil der Registerkarte "Zellenindex" auf sich wiederholende Wertemuster, wie im Manuskript beschrieben. Um den Überprüfungslauf abzuschließen, klicken Sie auf Platte, und wählen Sie Trennplatte aus.Entferne die 96-Well-RTCA-Widerstandsplatte von der RTCA-Station. Um Hintergrundinformationen zu RTCA zu erhalten, waschen Sie die mit Kollagen Typ eins beschichtete spezielle Gold-Mikroelektrodenplatte zweimal mit 60 Mikrolitern HBSS pro Well. Verwerfen Sie das verbleibende HBSS und fügen Sie 50 Milliliter extrazelluläre Matrix pro Vertiefung hinzu.Legen Sie dann die Platte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator. Geben Sie auf der Registerkarte "Erfahrungsnotizen" der RTCA-Software den Namen des Experiments, die Seriennummer des Geräts und den Gerätetyp ein. Navigieren Sie zur Registerkarte "Zelle" der RTCA-Software und wählen Sie die Registerkarte "Layout" aus.Markieren Sie die Wells, die verwendet werden sollen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierten Wells, um sicherzustellen, dass alle Wells aktiviert sind. Gehen Sie nun auf die Registerkarte "Zeitplan" der RTCA-Software. Klicken Sie auf Step_1 und klicken Sie in der oberen linken Ecke auf Start oder Fortfahren, um eine Hintergrundlesung zu erhalten.Die Platte ist nun bereit für die Zellaussaat und die Entnahme aus der RTCA-Station. Danach werden 10 bis die vierten Zellen pro Vertiefung von HUVECs in die Gold-Mikroelektrodenplatte mit 50 Mikrolitern pro Vertiefung des konditionierten Mediums eingesät. Legen Sie die Platte zurück in die RTCA-Station im Zellkultur-Inkubator, wobei die A1-Vertiefung nach innen zeigt.Klicken Sie dann auf der Registerkarte "Zeitplan" der Software in der oberen linken Ecke auf "Schritt hinzufügen". Klicken Sie auf Step_2. Ändern Sie die Sweeps in 601, das Intervall in zwei Minuten, und klicken Sie auf Anwenden.Klicken Sie auf Step_2 und klicken Sie in der oberen linken Ecke der Software auf Start oder Weiter. Nach 20 Stunden Inkubation, wenn die Zellindexwerte auf der Registerkarte "Well-Diagramm" ein Plateau zeigen, ist die Platte bereit für die Infektion. Klicken Sie auf der Registerkarte "Zeitplan" der RTCA-Software auf Schritt abbrechen.Die Platte kann nun von der RTCA-Station entfernt werden. Um die HUVECs zu infizieren, holen Sie den Zika-Virusvorrat aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Verdünnen Sie den Zika-Virus-Stamm mit serumfreier extrazellulärer Matrix in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um eine Vielzahl von Infektionen von 0,1 und eins zu erreichen.Als Nächstes entsorgen Sie das konditionierte Medium aus jeder Vertiefung und spülen Sie jede Vertiefung mit 60 Mikrolitern HBSS, während Sie die Seite der Vertiefung verwenden. Geben Sie 40 Mikroliter verdünnte Virusprobe in die Vertiefung, beginnend mit der höchsten bis zur niedrigsten Verdünnung, indem Sie die Seite der Vertiefung verwenden. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um die Virusabsorption zu ermöglichen.Schwenken Sie die Platte fünfmal alle 15 Minuten, um die Virusabsorption in der gesamten Zellmonoschicht zu ermöglichen. Nach einer Stunde Inkubation wird die Virussuspension von der niedrigsten zur höchsten Konzentration entfernt und verworfen. Waschen Sie die infizierten Zellen zweimal mit 60 Millilitern HBSS.Überlagern Sie die Vertiefungen mit extrazellulärer Matrix, die mit 2 % FBS ergänzt ist. Für die Positivkontrollvertiefungen wird das Thrombin in 20 Einheiten pro Milliliter mit extrazellulärer Matrix, ergänzt mit 2 % FBS, verdünnt und die Vertiefungen mit thrombinhaltigem extrazellulärem Matrixmedium an der Seite der Vertiefung überlagert. Klicken Sie nun auf die Registerkarte "Zeitplan" und fügen Sie einen Schritt in der oberen linken Ecke hinzu.Navigieren Sie zu Step_3, und ändern Sie die Sweeps in 3, 601 und das Intervall in zwei Minuten. Klicken Sie auf "Übernehmen" und dann im Popup-Fenster auf "OK". Legen Sie die infizierte spezialisierte Gold-Mikroelektrodenplatte mit der A1-Vertiefung nach innen in die RTCA-Station im Kulturinkubator.Klicken Sie abschließend auf Step_3 und klicken Sie in der oberen linken Ecke der Software auf Weiter starten. Der Zellindexwert von HUVECs, die mit dem Zika-Virus P6-740 infiziert waren, begann 15 Stunden nach der Infektion im Vergleich zur negativen Infektionskontrolle zu sinken. Die HUVECs, die mit einer höheren Dosis des Zika-Virus P6-740 infiziert waren, zeigten 11 Stunden nach der Infektion einen Abfall des Zellindex.24 Stunden nach der Infektion gab es einen Rückgang des normalisierten Zellindexwerts um 5 % bzw. 7 %, wenn die Endothelzellen mit einer Infektionsmultiplizität von 0,1 bzw. eins infiziert wurden. Eine 50%ige Reduktion des normalisierten Zellindexwertes wurde 96 Stunden nach der Infektion und 66,75 Stunden nach der Infektion bei einer Infektionsmultiplizität von 0,1 bzw. eins festgestellt. Der normalisierte Zellindexwert erreichte seinen niedrigsten Punkt 107 Stunden nach der Infektion, mit einer Reduktion von 51 % und 60 % bei einer Infektionsmultiplizität von 0,1 bzw. eins.Es wurde festgestellt, dass der normalisierte Zellindexwert von 107 Stunden nach der Infektion bis zum Ende des Experiments 168 Stunden nach der Infektion um 4 % und 13 % anstieg. Vor jedem RTCA-Experiment ist ein Widerstandsverifizierungslauf mit der 96-Well-RTCA-Platte unerlässlich, um sicherzustellen, dass jeder Biosensor gut funktioniert, um zuverlässige Zellindexwerte zu erzeugen.

monitoring-changes-human-umbilical-vein-endothelial-cells-upon-viral

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

In diesem Video demonstrieren wir den Prozess der Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse, einschließlich der Proliferation adhärenter Zellen, über einen zellulären Impedanzassay. Dabei wirken die adhärenten Zellen als Isolatoren, die den Stromfluss zwischen den Elektroden begrenzen und die Impedanz erhöhen.

Zelluläre impedanzbasierte Analyse zur Überwachung zellulärer Prozesse in Echtzeit

Dieses Video beschreibt eine zelluläre Impedanz-basierte Technik, um die Überlebenskinetik von Viren zu untersuchen, die zytopathische Effekte induzieren. Die Methode misst die elektrische Impedanz von virusinfizierten adhärenten Zellen, die mit Kochsalzlösung vorbehandelt wurden.

Zellulärer impedanzbasierter Überlebenskinetik-Assay zur Beurteilung des Überlebens von Viren

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Protokolle für die Kultur humaner Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die transiente Transfektion von fluoreszenzmarkierten Markern des Mikrotubuli-Wachstums, die Bildgebung lebender Zellen und die automatisierte Analyse der Wachstumsdynamik von Mikrotubuli zwischen den Phasen werden detailliert beschrieben.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung infektiöser Viruspartikel unter Verwendung der Echtzeitüberwachung der elektrischen Impedanz infizierter Zellen beschrieben. Eine praktische Anwendung dieser Methode wird durch die Quantifizierung des Influenza-A-Virus-Zerfalls unter verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern, die Umweltbedingungen nachahmen, vorgestellt.

Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mithilfe der Echtzeit-Zellanalyse

Hier demonstrieren wir die Verwendung der zellbasierten elektrischen Impedanz (CEI) als eine sehr einfache und unkomplizierte Methode, um die Infektion und Replikation des Zika-Virus in menschlichen Zellen in Echtzeit zu untersuchen. Darüber hinaus ist der CEI-Assay nützlich für die Bewertung antiviraler Verbindungen.

Zellbasierte elektrische Impedanzplattform zur Evaluierung von Zika-Virus-Inhibitoren in Echtzeit

Der hier berichtete TCID50-Test nutzt beschriftungsfreie Echtzeitimpedanzmessungen und das Virologiemodul des Systems, um virusinduzierte zytopathische Effekte (CPE) objektiv in Echtzeit zu überwachen. Dieser optimierte Assay reduziert die praktische Erfahrung erheblich, unterstützt gleichzeitig hochdurchgängige, quantitative kinetische CPE-Messungen und ermöglicht automatisierte, Echtzeit-TCID50-Berechnungen.

Ein stromlinienförmiger, etikettenfreier, Echtzeit-50%-Gewebekultur-Infektionsdosen-Assay (TCID50) unter Verwendung von Impedanz zur automatisierten Quantifizierung viraler Titer-Quantifizierung

Erfahren Sie die impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyse zur Überwachung morphologischer Veränderungen in HUVECs nach Virusinfektion. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die kontinuierliche Erfassung transienter Effekte wie Zellablösung und Gefäßleckage.

Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse (Video) | JoVE Journal

Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse

Weitere Videos entdecken