Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen

Viele Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die sich an den Enden von auditorischen und vestibulären afferenten Neuronen befinden, befinden sich auch in ihren Zellkörpern. Kulturen von isolierten Zellkörpern können in vitro untersucht werden, um zu verstehen, wie diese Ionenkanäle und Rezeptoren die Reaktionen der Neuronen beeinflussen. Die kompakte Morphologie der Zellkörper ermöglicht qualitativ hochwertige elektrische Ableitungen, um die spannungsabhängigen Eigenschaften der Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren zu charakterisieren.

Darüber hinaus ermöglicht der einfache Zugang zu einer Vielzahl von Zelltypen einen hohen Durchsatz durch eine physikalische Analyse der Zelldiversität. Die Verfahren werden von der Doktorandin Katherine Regalado zusammen mit den Postdoktoranden Dr. Daniel Bronson und Nathaniel Nowak aus meinem Labor demonstriert. Halten Sie zunächst eine gläserne Weidepipette an die Flamme eines Bunsenbrenners, um die Tritrationspipetten für die Zelldissoziation vorzubereiten.

Sobald die Glasspitze zu schmelzen beginnt, dehnen Sie das Glas auf den gewünschten Spitzendurchmesser aus. Ziehen Sie ein Ende der Pipette von der Flamme weg, um eine kleine Biegung zu erzeugen. Legen Sie die gebogene Pipette unter ein Mikroskop.

Ritzen und zerbrechen Sie das Glas mit einer Ritzfliese im gewünschten Durchmesser. Führen Sie die Pipettenspitze über die Brennerflamme. Dadurch werden die rauen Kanten in der Nähe der Spitze schnell poliert.

Schöpfen Sie das Gehirn der euthanasierten Maus mit einer geschlossenen chirurgischen Schere aus. Durchtrennen und entfernen Sie den Hirnnerv, um das Gehirn vollständig vom Schädel zu lösen. Beginnen Sie am Hinterkopf, ziehen Sie das durchsichtige membranöse Material mit einer Pinzette ab und schneiden Sie dann die Oberseite des Schädels mit einer chirurgischen Schere heraus.

Entfernen Sie das überschüssige Gewebe von Hinterkopf und Nacken, um den Sezierbereich und die otische Kapsel sauberer und leichter zugänglich zu machen. Übertragen Sie das Gewebe in eine zweite Petrischale mit frischer L-15-Lösung. Lokalisieren Sie dann die otische Kapsel und den Hörnerv, den Nervus auditori, den Nervus vestibularis superior und den Nervus vestibularis inferior.

Trennen Sie die oberen und unteren Ganglien mit einer kleinen Federschere und schneiden Sie den Hörnerv ab. Rasieren Sie mit einem Skalpell vorsichtig den knöchernen Kamm ab, um den knöchernen Bereich zu schwächen, unter dem der Nerv in die knöcherne Kapsel eintaucht. Entfernen Sie die Ablagerungen vorsichtig mit einem Skalpell und legen Sie den gesamten geschwollenen Teil des Ganglions frei.

Verwenden Sie die feine Federschere, um das Ganglion von dem peripheren Nervenast zu trennen, der in Richtung Utriculus taucht. Entfernen Sie das obere Ganglion mit einer feinen Pinzette und geben Sie es in eine 35-Millimeter-Petrischale mit frischer L-15-Lösung. Nach dem Vorwärmen der Enzymlösung die Enzymmischung in eine 35-Millimeter-Petrischale geben und für 10 bis 15 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator geben.

Reinigen Sie das Ganglion mit einer feinen Pinzette und einer kleinen Federschere, indem Sie Knochen, überschüssiges Gewebe, Nervenfasern und andere überflüssige Strukturen entfernen. Achten Sie darauf, die Entfernung von Gangliengewebe zu minimieren. Die gereinigten Ganglien werden in die vorgewärmte Enzymlösung gegeben und für 10 bis 40 Minuten wieder in den Inkubator gelegt.

Anschließend werden die Ganglien in die 35-Millimeter-Petrischale mit frischer L-15-Lösung überführt. Nach zwei bis drei Minuten werden die Ganglien in eine andere 35-Millimeter-Petrischale überführt, die mit gefilterten Nährmedien gefüllt ist. Geben Sie ca. 150 Mikroliter gefiltertes Nährmedium auf eine beschichtete Glasbodenschale.

Übertragen Sie dann die gewünschte Anzahl von Ganglien auf das Deckglas. Ziehen Sie eine kleine Menge Nährmedien aus der Kulturschale und spülen Sie die Tritrierpipette mit Medium ab, um zu verhindern, dass das Gewebe an den Seiten der Glaspipette klebt. Trituieren Sie, indem Sie das Gewebe vorsichtig und wiederholt durch die Pipette führen, bis die Ganglien ausreichend dissoziiert sind.

Prüfen Sie nach fünf Minuten unter dem Lichtmikroskop, ob sich die Zellen auf dem Deckglas abgesetzt haben. Stellen Sie eine Kulturschale vorsichtig für 12 bis 24 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Als nächstes lokalisierst du die optische Kapsel, nachdem du den Kopf halbiert hast, und entfernst sie aus dem Schädel, indem du die Ränder mit einer Pinzette abschneidest.

Der spiralförmige Teil der otischen Kapsel beherbergt die Cochlea mit dem Corti-Organ. Schlagen Sie den Knochen ab, indem Sie die Cochlea-Drehungen mit einer feinen Pinzette parallel zur Krümmung des Knochens überlagern. Verwenden Sie eine kleine Federschere, um das Modiolus an der Basis der Cochlea zu durchtrennen, um es vom Rest der otischen Kapsel zu befreien.

Schneiden Sie das Corti-Organ mit einer kleinen Federschere in zwei oder drei Windungen, so dass es flach liegt, und schneiden Sie den Modiolus aus jeder Umdrehung heraus. Entfernen Sie die Stria vascularis, indem Sie die Stria an der Basis mit einer feinen Pinzette zusammendrücken. Wickeln Sie sich um die Spirale herum und bis zum Scheitelpunkt ab, um sie vom Corti-Organ zu lösen.

Entfernen Sie das Spiralganglion, indem Sie an der Kante schneiden, an der die Spiralganglion-Neuronenfaserbahnen in Richtung der Haarzellen ragen, und reinigen Sie dann das Ganglion wie zuvor gezeigt. Nach enzymatischer Behandlung des Ganglions wird das Ganglion spiralförmig in dem mit N2 und B27 ergänzten Nährmedium tritriert. Stellen Sie die Kulturschale mit den dissoziierten Ganglien für 12 bis 24 Stunden in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Tauchen Sie die Spitze der Pipette in die saubere Lösung der Kulturschale, um sie mit einer sauberen Lösung zu füllen, die kein Amphotericin enthält. Füllen Sie die Rückseite der Pipette mit der internen Lösung, die Amphotericin enthält. Tauchen Sie die Spitze der Pipette wieder in die saubere Lösung der Kulturschale, während das Amphotericin langsam von der Rückseite der Pipette in die Spitze eindringt.

Als nächstes füllen Sie die Pipette zu zwei Dritteln der Pipette mit der Amphotericinlösung. Senken Sie die Pipette in das Bad der Aufnahmekammer und platzieren Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Sichtfeldes. Stellen Sie sicher, dass die Spitze frei von Luftblasen oder anderen Ablagerungen ist.

Positionieren Sie die Pipette in der Nähe der Membran und landen Sie fest in der Mitte der Zelle. Üben Sie Unterdruck oder Absaugung mit einer Spritze oder Mundpipette aus. Schalten Sie das Haltepotential von minus 60 Millivolt ein.

Der Dichtungswiderstand sollte erhöht werden, bis er ein Gigaohm überschreitet. Sobald sich eine Giga-Ohm-Dichtung gebildet hat, lassen Sie den Unterdruck ab. Bevor Tyrosin zu wirken beginnt, nimmt der Eingangswiderstand langsam ab, und der Strom, der als Reaktion auf den Spannungsschritt von fünf Millivolt fließt, steigt allmählich an, wenn das Amphotericin in die Membran eintritt.

Die repräsentativen Beispiele für Ganzzellströme, die von einem vestibulären Ganglienneuron hervorgerufen werden, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die nach innen gerichteten Natriumströme werden hier durch ihre transiente Aktivierung und Inaktivierung identifiziert. Die nach außen gerichteten Nettoströme werden größtenteils von Kaliumionen getragen und haben eine viel langsamere Aktivierungs- und Inaktivierungskinetik als Natriumströme.

Die durch Hyperpolarisation aktivierten zyklischen Nukleotid-Gated-Ströme oder HCN-Ströme werden durch eine Familie von langanhaltenden hyperpolarisierenden Spannungen aktiviert. Die Stabilität der Ionenkanalcharakterisierung im perforierten Patch zu verschiedenen Zeitpunkten während der Aufnahme ist in dieser Abbildung dargestellt. Die spannungsabhängigen Aktivierungskurven der HCN-Ströme wurden in einer perforierten Patch-Konfiguration gemessen.

Die Kurve hat eine sigmoidale Form und war während einer langen Aufnahme stabil. Die relative Instabilität des Ruptured-Patch-Modus wird durch nicht-überlappende sigmoidale Kurven von verschiedenen Zeitpunkten veranschaulicht. Hier sind die Aktivierungskurven von HCN-Strömen während einer gerissenen Patch-Konfiguration dargestellt.

Hier sind die Feuermuster in fünf vestibulären Ganglien-Somara, fünf Spiralganglien-Neuronen und die entsprechenden aktuellen Schritte dargestellt. Diese Heterogenität der Feuermuster spiegelt eine grundlegende Vielfalt in der Zusammensetzung der zugrunde liegenden Natrium- und Kaliumkanäle sowohl in vestibulären Ganglienneuronen als auch in spiralförmigen Ganglienneuronen wider. Um das Überleben der Zellen während dieses Verfahrens zu maximieren, vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, überlasten Sie das Gewebe nicht und lassen Sie die Zellen sich absetzen, bevor Sie die Proben in den Inkubator geben.

Die perforierte Patchklemme ermöglicht die Untersuchung von Ionenkanälen, die durch zytosolische Botenstoffe moduliert werden, was für die Untersuchung der Auswirkungen von efferenten Neurotransmittern auf Ganglienneuronen von entscheidender Bedeutung ist. Patch-Clamp-Aufzeichnungen dieser bipolaren Neuronen haben entscheidend dazu beigetragen, zu zeigen, wie biophysikalische Diversität zur funktionellen Diversität in sensorischen Neuronen beiträgt.