Name: Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung spezifischer Wurzelzelltypen von Arabidopsis thaliana mittels FACS und die anschließende scRNA-seq-Analyse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung subtiler Genexpressionsunterschiede in Pflanzenzellen.

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Wir haben dieses Protokoll in der Einzelzell-Multi-Omics-Einrichtung der School of Agriculture and Biology der Shanghai Jiao Tong University eingerichtet und wurden von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), dem Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) und der Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05) unterstützt.

Das folgende Protokoll wurde für A. thaliana-Wildtyp-Samen (WT) ohne Fluoreszenz- und Fluoreszenzmarkerlinien für die folgenden Wurzelzelltypen optimiert: Xylempol-Pericycluszellen (J0121), laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen (J3411), Endodermis- und Cortexzellen (J0571) (Abbildung 1A). Alle Markierungslinien wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle), mit Ausnahme der Lateralwurzel-Initiationszell-Markerlinie, die durch die Einführung eines GATA23-Promotor-getriebenen GFP-Konstrukts in eine Wildtyp-Arabidopsis-Pflanze im Anschluss an einen zuvor veröffentlichten Berichterzeugt wurde 14.
1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials
<ol><li>Sterilisieren Sie die A. thaliana WT-Samen und die fluoreszierenden Markerliniensamen, indem Sie die Samen in 20%igem Bleichmittel in einem rotierenden Inkubator bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren.</li>
	<li>Spülen Sie die Samen drei- bis fünfmal in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) ab. Führen Sie diesen Schritt auf einer sterilen, sauberen Bank durch.</li>
	<li>Die Samen der WT- und Reporterlinie auf halbstarkem Murashige und Skoog (MS) Medium mit 0,8 % Agar (w/v)15 ablegen. Wachsen Sie die Pflanzen 5 Tage lang senkrecht (16 h Licht bei 23 °C), nachdem Sie sie 2 Tage lang bei 4 °C stratifiziert haben.</li>
</ol>2. Protoplasting
<ol><li>Bereiten Sie die protoplasting Lösungen2,5 vor, die als Lösung A und Lösung B bezeichnet werden (siehe Materialtabelle).<ol><li>Bereiten Sie Lösung A vor, die 400 mM Mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 und 20 mM KCl enthält (siehe Materialtabelle). Lagern Sie Lösung A bis zu 1 Monat bei −20 °C.</li>
		<li>Bereiten Sie Lösung B zu, indem Sie 1 % (w/v) Cellulase R10, 1 % (w/v) Cellulase RS, 1 % (w/v) Hemicellulase, 0,5 % (w/v) Pektoligase und 1 % (w/v) Macerozym R10 in einem frischen Aliquot von Lösung A hinzufügen. Lagern Sie Lösung B bei −20 °C für bis zu 1 Monat.</li>
	</ol></li>
	<li>Tauen Sie Lösung A und Lösung B vorsichtig auf Eis auf, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sauberen Klinge oder Schere ab und hacken Sie die Wurzeln in ~0,5 cm große Stücke. Tauchen Sie die Wurzeln in 1,5 ml Lösung B, gefolgt von einer sanften Rotation (bei ca. 18 U/min) bei Raumtemperatur für 1,5-2 Stunden.</li>
	<li>Filtern Sie die Wurzelprotoplasten durch das 40 μm Siebgewebe (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Spülen Sie das Siebgewebe mit 1-2 ml Lösung A aus.</li>
	<li>Die Flüssigkeiten aus Schritt 2.4 und Schritt 2.5 vermischen und bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500-600 μl Lösung A und legen Sie es dann sofort auf Eis.</li>
	<li>Die resuspendierte Zelllösung wird zur Zellsortierung in ein neues 5-ml-Reagenzglas überführt.</li>
</ol>3. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
<ol><li>Schalten Sie das Gerät ein und beenden Sie die Schritte zum Einrichten des Geräts am Sortierer (siehe Materialtabelle). Wählen Sie die Fluoreszenzkanäle aus, verwenden Sie eine WEA-Anlage (keine Fluoreszenz) als Kontrolle, um die Basislinie für die Autofluoreszenz zu bestimmen, und passen Sie den Sortierschieber basierend auf der Fluoreszenzintensität und den FSC/SSC-Vereinzelungen an (Abbildung 2).</li>
	<li>Geben Sie 500 μl Lösung A (Schritt 2.1.1) in ein 1,5-ml-Sammelröhrchen, um eine Beschädigung der Zellen zu verhindern. Sammle 2.000-3.000 Zellen pro Röhrchen.</li>
	<li>Nach dem Sortieren werden die Proben sofort auf Eis gelegt, das Sammelröhrchen mit den Zellen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette entfernt.</li>
	<li>Nehmen Sie 2 μl sortierte Zellen und überprüfen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Fluoreszenz (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Lagern Sie die sortierten Zellen bei −80 °C oder verwenden Sie sie sofort für den Bibliotheksaufbau (Schritt 4).</li>
	<li>Setzen Sie für die Sortierung des Einzelzellenindex die 96-Well-Platte in den Adapter ein. Kalibrieren Sie die Position der Platte so, dass der Tropfen in das mittlere Loch der Platte fällt. Wählen Sie beim Sortieren den Einzelzellen-Sortiermodus, geben Sie die Zielanzahl der sortierten Zellen als 1 ein und starten Sie die Sortierung.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Smart-seq2-Bibliothek
<ol><li>Aufgrund der extrem geringen Menge an Input können Einzelzell-RNA-seq-Bibliotheken in einer kontaminationsfreien Umgebung erstellt werden. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie den Prüfstand mit einem Oberflächendekontaminationsmittel8 (siehe Materialtabelle) und 75%igem Ethanol.</li>
	<li>Herstellung von Lysepuffer (Gemisch A) (Tabelle 1) durch Kombination von 0,33 μl 10 % Triton X-100, 0,55 μl RNase-Inhibitor und 0,22 μl 0,1 M DTT (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Geben Sie 1 μl der Mischung A in die sortierte Probe und mahlen Sie sie mit einem sterilen Stößel. Das bevorzugte Probenvolumen beträgt ≤0,5 μl; Verwenden Sie RNase-freies Wasser, um das Volumen auf 14 μl zu erhöhen. Übertragen Sie jede einzelne Zellprobe in ein dünnwandiges 0,2-ml-PCR-Röhrchen.</li>
	<li>Bereiten Sie Gemisch B vor, das 0,44 μl Oligo-dT30VN reverse Transkription (RT)-Reaktionsprimer (100 μM) und 4,4 μl dNTPs (10 mM) enthält (Tabelle 2) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Fügen Sie 4,4 μl Mischung B zu den 14 μl Probe in jedem Röhrchen hinzu, pipettieren Sie vorsichtig, um die Probe zu mischen, und inkubieren Sie die Probe 3 Minuten lang bei 72 °C. Nach der Inkubation werden die Proben sofort auf Eis gelegt, um das Oligo-dT mit dem Poly-A-Schwanz zu hybridisieren.</li>
	<li>Bereiten Sie das Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch (Gemisch C) (Tabelle 3) vor (siehe Materialtabelle). Geben Sie 21,6 μl der Mischung C in jedes Röhrchen mit den Proben. Schalten Sie das RT-Programm auf einem gängigen PCR-Gerät ein (Tabelle 4).</li>
	<li>Führen Sie die Vorverstärkungsreaktion auf Eis durch. Bereiten Sie Gemisch D vor, indem Sie 44 μl 2x PCR-Polymerase-Mix und 0,88 μl IS-PCR-Primer (10 μM) kombinieren (Tabelle 5) (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 40,8 μl Gemisch D zu den 40 μl RT-Reaktionsprodukt hinzu und führen Sie das Voramplifikationsprogramm aus (Tabelle 6).</li>
	<li>Reinigen Sie die Produkte der Voramplifikationsreaktion mit Ampure XP-Kügelchen (siehe Materialtabelle). Geben Sie 48 μl Beads (Verhältnis 0,6:1) in jede Probe aus Schritt 4.7 und mischen Sie die Proben vorsichtig durch Pipettieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Proben für 5 Minuten auf einen magnetischen Trennständer. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus den Proben, ohne die Kügelchen zu stören.</li>
	<li>Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie sie in 200 μl 80%igem Ethanol resuspendieren, und legen Sie die Proben für weitere 3 Minuten auf den Magnetseparationsständer (siehe Materialtabelle), bevor Sie den ethanolhaltigen Überstand entsorgen.</li>
	<li>Lassen Sie die Proben 10 Minuten lang an der Luft trocknen und decken Sie das Röhrchen ab, um eine Kontamination und Kreuzkontamination während der Lufttrocknung zu vermeiden.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Beads in 20 μLddH2O, inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min und legen Sie sie dann für 5 min auf den magnetischen Trennständer.</li>
	<li>Pipettieren Sie 18 μl des Überstands aus jedem Röhrchen und übertragen Sie die Proben in neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 1 μl der Probe, um die Qualität der cDNA mit einem DNA-Quantifizierungskit zu beurteilen, bestimmen Sie die Größenverteilung jeder Vorbibliothek mit einem Fragmentanalysator (siehe Materialtabelle) und lagern Sie die verbleibende Probe bei −20 °C.</li>
	<li>Konstruieren Sie eine cDNA-Bibliothek8 für die Illumina-Sequenzierung 16 aus dem Vorbibliotheksprodukt aus Schritt4.13 unter Verwendung eines Sequenzierungsbibliotheks-Vorbereitungskits (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bereinigen Sie die Bibliotheken (ab Schritt 4.14) mit den Ampure XP-Beads, quantifizieren Sie die bereinigten Bibliotheken und bestimmen Sie die Größenverteilung der einzelnen Bibliotheken gemäß Schritt 4.13. HINWEIS: Fassen Sie gleiche Nanomol jeder Bibliothek zusammen, um sicherzustellen, dass keiner von ihnen die gleiche Kombination des Illumina-Index hat. Andernfalls können die Libraries in einem Verhältnis basierend auf dem gewünschten Sequencing-Output gepoolt und auf derselben Lane des Illumina-Sequenzers sequenziert werden. Im Allgemeinen bietet die Sequenzierung jeder Bibliothek bis zu einer Tiefe von 4-6 GB, was >10 Millionen kartierte Lesevorgänge ergibt, eine 20-30-fache Abdeckung des Arabidopsis-Genoms . Geringere Sequenziertiefen sind ebenfalls akzeptabel, können aber die Aussagekraft der differentiellen Expressionsanalyse beeinträchtigen.</li>
</ol>5. RNA-seq-Datenanalyse
<ol><li>Trimmen Sie die rohen Reads mit Trim-Galore17, gefolgt von der Zuordnung zum Referenzgenom mit hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), und entfernen Sie die PCR-duplizierten Fragmente mit Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).</li>
	<li>Führen Sie die Rohzählung und die anschließende Analyse der differentiell exprimierten Gene (DEG) mit DESeq220 unter Verwendung von mindestens drei biologischen Replikaten für jede Probe durch. Führen Sie ein Clustering der Genexpression mit dem Pheatmap-Paket durch und visualisieren Sie es in einer Expressions-Heatmap. HINWEIS: Die RPKM-Werte (Reads per Kilobase per Million Mapped Reads) der Gene und der TEs (Transposable Elements) wurden mit Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) berechnet und in einem Genombrowser visualisiert.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).</li>
<li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li>
<li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li>
<li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li>
<li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+aux%2FIAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li>
<li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li>
<li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li>
<li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAsik%3A+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Source+Software%22%5BJournal%5D)">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li>
<li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li>
<li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139(2016).</li>
<li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li>
<li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Smart-seq2-basierte Protokoll kann zuverlässige Sequenzierungsbibliotheken aus mehreren hundert Zellenerzeugen 8. Die Qualität des Ausgangsmaterials ist entscheidend für die Genauigkeit der Transkriptomanalyse. FACS ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Präparation von Zellen von Interesse, aber dieses Verfahren, insbesondere der Protoplasting-Schritt, muss für pflanzliche Anwendungen optimiert werden. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) oder manuell präparierte Zellen können auch als Eing...

Zellen sind die Grundeinheit aller Lebewesen und erfüllen strukturelle und physiologische Funktionen. Obwohl die Zellen in mehrzelligen Organismen eine scheinbare Synchronizität aufweisen, weisen Zellen verschiedener Typen und einzelne Zellen Unterschiede in ihren Transkriptomen während der Entwicklung und der Umweltreaktionen auf. Die Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet eine noch nie dagewesene Leistung für das Verständnis der zellulären Heterogenität. Die Anwendung von scRNA-seq in den Pflanzenwissenschaften hat zur erfolgreichen Erstellung eines Pflanzenzellatlas1 beigetragen, wurde zur Identifizierung seltener zellulärer Taxa in Pflanzengeweben2 verwendet, hat Einblicke in die Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben geliefert und wurde verwendet, um die zelluläre Identität und wichtige Funktionen zu identifizieren, die bei der Entwicklung und Differenzierung von Pflanzen eine Rolle spielen. Darüber hinaus ist es möglich, räumlich-zeitliche Entwicklungsverläufe in Pflanzengeweben 1,2,3 abzuleiten, um neue Markergene4 zu entdecken und die Funktionen wichtiger Transkriptionsfaktoren5 mit Hilfe von scRNA-seq zu untersuchen, um die evolutionäre Konservierung desselben Zelltyps in verschiedenen Pflanzen aufzudecken 3. Abiotische Belastungen gehören zu den wichtigsten Umwelteinflüssen auf das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Indem man die Veränderungen in der Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben unter verschiedenen Behandlungsbedingungen durch Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung untersucht, kann man auch den abiotischen Stressreaktionsmechanismus aufklären6.
Das Potenzial für die Auflösung der transkriptionellen Heterogenität zwischen Zelltypen durch scRNA-Sequenzierung hängt von der Zellisolationsmethode und der Sequenzierungsplattform ab. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung einer Subpopulation von Zellen für scRNA-seq basierend auf Lichtstreuung und den Fluoreszenzeigenschaften der Zellen. Die Entwicklung von fluoreszierenden Markerlinien mittels transgener Technologie hat die Effizienz der Zellisolierung durch FACS7 erheblich verbessert. Die Durchführung von scRNA-seq mit Smart-seq28 verbessert die Fähigkeit, die zelluläre Heterogenität zu analysieren. Die Smart-seq2-Methode hat eine gute Sensitivität für den Gennachweis und kann Gene auch mit einem geringen Transkripteintrag nachweisen9. Zusätzlich zur Massenerfassung von Zelltypen bieten moderne Zellsortierer ein Einzelzell-Index-Sortierformat, das eine Transkriptomanalyse mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von Smart-seq210 oder anderen gemultiplexten RNA-seq-Methoden, wie z. B. CEL-seq211, ermöglicht. Die Einzelzell- oder Zellsortierung kann potenziell für viele andere nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, z. B. für parallele Multi-Omics-Studien12,13. Hier wird ein robustes und vielseitiges Protokoll zur Isolierung von Pflanzenzelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, lateralen Wurzelkappenzellen, lateralen Wurzelinitialzellen, Kortexzellen und endodermalen Zellen aus den Wurzeln von Arabidopsis thaliana-Markerzelllinien mittels FACS vorgestellt. Das Protokoll beinhaltet außerdem den Aufbau der Smart-seq2-Bibliothek für die nachgelagerte Transkriptomanalyse.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Sieb</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>622110</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Yeasen</td><td>70101ES76</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Fragmentanalysator</td><td>Aglient</td><td>Aglient 5200</td><td></td></tr><tr><td>Agilent hochempfindliches DNA-Kit</td><td>Aglient</td><td>DNF-474-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP beads</td><td>BECKMAN</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Betain</td><td>yuanye</td><td>S18046-100g</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Mr Muscle</td><td>FnBn83BK</td><td>20% (v/v) Bleiche</td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>yuanye</td><td>S24109-500g</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase R10</td><td>Yakult (Japan)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase RS</td><td>Yakult (Japan)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (1,5 mL)</td><td>Eppendolf</td><td>30121589</td><td></td></tr><tr><td>DNase-, RNase-, DNA- und RNA-Away Oberflächen-Dekontaminationsmittel</td><td>Beyotime</td><td>R0127</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (0,1 M)</td><td> Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092680</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD FACS Melody</td><td>BD-65745</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>Tipp zum Filter&nbsp; (1000 &Mikro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitze&nbsp; (200 & Mikro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF140-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitze (10 & Mikro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF104-10-Q</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitze (100 & Mikro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Vierdimensionaler rotierender Mischer</td><td>Kylin-Bell</td><td>BE-1100</td><td></td></tr><tr><td>Hemicellulase</td><td>Sigma</td><td>9025-56-3</td><td></td></tr><tr><td>IS PCR-Primer</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA</td></tr> <tr><td>HiFi HotStart ReadyMix( 2X)</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>7958935001</tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult (Japan)</td><td>9032-75-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Trennständer</td><td>invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Aladdin</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Aladdin</td><td>145224948</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>yuanye</td><td>R21455-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5425</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Mini-Zentrifuge</td><td>Titan</td><td>Timi-10k</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>oligo-dT30VN Primer</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3'PCR-Instrument</td></tr> <tr><td></td><td>Thermocycler</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Pektoliase</td><td>Yakult (Japan)</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>Pflanzenmarkerlinien</td><td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Lösung A</td><td></td><td></td><td>400 mM Mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl-Lösung</td></tr><tr><td>B</td><td></td><td></td><td>1 % (w/v)Cellulase R10, 1 % (w/v) Cellulase RS, 1 %&nbsp; (w/v)Hemicellulase, 0,5 %&nbsp; (w/v)Pektoliase und 1 %&nbsp; (w/v) Macerozym R10 in einem frischen Aliquot der Lösung A</td></tr><tr><td>Steriler Stößel</td><td>BIOTREAT</td><td>453463</td><td></td></tr><tr><td>Sieb (40 & Mikro; m )</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>251100</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV reverse Transkriptase (200 U/&micro; L)</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Puffer (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglas (5 mL)</td><td>BD Falcon 352052</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige PCR-Röhrchen mit Kappen (0,5 mL)</td><td>AXYGEN</td><td>PCR-05-C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600198-0500</td><td></td></tr><tr><td>TSO Primer</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'Vortex</td></tr> <tr><td></td><td>Titan</td><td>VM-T2</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und transkriptomanalyse pflanzlicher zelltypen

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In mehrzelligen Organismen können die Entwicklungsprogrammierung und die Umweltreaktionen in verschiedenen Zelltypen oder sogar innerhalb von Zellen sehr unterschiedlich sein, was als zelluläre Heterogenität bezeichnet wird. In den letzten Jahren haben sich Einzelzell- und Zelltypisolierungen in Kombination mit Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zu wichtigen Werkzeugen entwickelt, um biologische Prozesse mit Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die Isolierung von Pflanzenzellen ist jedoch aufgrund des Vorhandenseins von pflanzlichen Zellwänden relativ schwierig, was die Anwendung von Einzelzellansätzen in Pflanzen einschränkt. Dieses Protokoll beschreibt ein robustes Verfahren zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-basierten Einzelzell- und Zelltypisolierung mit Pflanzenzellen, das sich für nachgelagerte Multi-Omics-Analysen und andere Studien eignet. Anhand von Arabidopsis-Wurzel-Fluoreszenzmarkerlinien zeigen wir, wie bestimmte Zelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen, Kortexzellen und endodermale Zellen, isoliert werden. Darüber hinaus wird eine effektive Downstream-Transkriptom-Analysemethode unter Verwendung von Smart-seq2 bereitgestellt. Die Zellisolationsmethode und die Transkriptomanalysetechniken können auf andere Zelltypen und Pflanzenarten übertragen werden und haben ein breites Anwendungspotenzial in den Pflanzenwissenschaften.

Isolierung von Protoplasten Dieses Protokoll ist effektiv für die Protoplastensortierung von fluoreszierenden A. thaliana-Wurzelmarkerlinien . Diese Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Fallenlinien entwickelt (Abbildung 1). Zahlreiche Gewebe und Organe wurden in Zelltypen zerlegt, die spezifische Fluoreszenzmarker in Modellpflanzen ...

Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Die Transkriptomanalyse an einzelnen Zellen oder Zelltypen kann den feinen Unterschied der Genexpression erkennen, der durch Heterogenität maskiert wird, was ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die ausgeklügelten intrazellulären Regulationsmechanismen aufzudecken. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit anschließender RN-seq-Analyse kann entweder im Einzelzell- oder Massenzellmodus mit hoher Transkriptdetektionsempfindlichkeit und Kompatibilität mit anderen Multi-Omik-Ansätzen durchgeführt werden. Erstanwender dieses Protokolls müssen auf einige Schritte bei der Protoplastensortierung und der Vorbereitung der RNA-seq-Bibliothek achten.Zusammen mit Jun Zhang wird Dr. Rongrong Xie, ein Postdoktorand in unserem Labor, bei der Demonstration des Verfahrens helfen. Geben Sie zunächst die Samen des Wildtyps Arabidopsis thaliana und der fluoreszierenden Markierungslinie in 20%iges Bleichmittel und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit einem rotierenden Inkubator bei Raumtemperatur, um die Samen zu sterilisieren. Während Sie auf einer sterilen Werkbank arbeiten, spülen Sie die Samen drei- bis fünfmal in doppelt destilliertem Wasser ab.Die Samen des Wildtyps und der Reporterlinie werden auf halbstarkem MS-Medium mit 0,8 Gew.-% pro Volumen-Agar angerichtet. Stratieren Sie die Pflanzen zwei Tage lang bei vier Grad Celsius. Dann züchten Sie sie fünf Tage lang vertikal bei 23 Grad Celsius unter 16-stündigen Licht- und 18-stündigen Dunkelzyklen.Tauen Sie die protoplasting Lösungen, die als Lösung A und Lösung B bezeichnet werden, vor dem Experiment vorsichtig auf Eis auf. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sauberen Klinge oder Schere von den Pflanzen ab und hacken Sie die Wurzeln in ca. 0,5 Zentimeter große Stücke. Tauchen Sie die gehackten Wurzeln in 1,5 Milliliter Lösung B und drehen Sie sie anschließend 1,5 bis 2 Stunden lang vorsichtig bei Raumtemperatur.Filtern Sie die resultierenden Wurzelprotoplasten durch ein 40-Mikron-Siebgewebe und spülen Sie das Gewebe mit ein bis zwei Millilitern Lösung A. Zentrifugieren Sie die kombinierten Filtrate bei 300 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 bis 600 Mikrolitern Lösung A und legen Sie es sofort auf Eis. Zur Zellsortierung wird die resuspendierte Zelllösung in ein neues Fünf-Milliliter-Reagenzglas überführt.Füllen Sie den Mantelflüssigkeitstank und überprüfen Sie den Fäkalientank. Schalten Sie dann die fluoreszenzaktivierte Zellsortier- oder FACS-Maschine ein. Führen Sie die Schritte zum Einrichten des Geräts und zur automatischen Kalibrierung am Sortierer durch.Wählen Sie die Fluoreszenzkanäle aus und verwenden Sie eine Wildtyppflanze ohne Fluoreszenz als Basiskontrolle. Passen Sie den Sortierschieber basierend auf der Fluoreszenzintensität und den Singuletts der Vorwärtsstreuung und der Seitenstreuung an. Nachdem Sie 500 Mikroliter Lösung A in ein 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen gegeben haben, beginnen Sie mit der Sortierung und sammeln Sie 2.000 bis 3.000 Zellen pro Röhrchen.Legen Sie die Proben nach dem Sortieren sofort auf Eis. Zentrifugieren Sie das Sammelröhrchen mit den Zellen bei 300 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Nehmen Sie zwei Mikroliter sortierte Zellen und prüfen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Fluoreszenz.Lagern Sie die sortierten Zellen bei minus 80 Grad Celsius, wenn sie nicht sofort verwendet werden. Für die Sortierung des Einzelzellindex setzen Sie die 96-Well-Platte mit Membran in den Adapter ein. Kalibrieren Sie die Position der Platte so, dass der Tropfen in das mittlere Loch der Platte fällt.Entfernen Sie die Membran von der 96-Well-Platte und setzen Sie die 96-Well-Platte in den Adapter ein. Wählen Sie beim Sortieren den Sortiermodus für einzelne Zellen aus. Geben Sie die Zielanzahl der sortierten Zellen als eine ein und beginnen Sie mit der Sortierung.Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie die Bank mit einem Oberflächendekontaminationsmittel und 75%igem Ethanol. Verwenden Sie alle Geräte nur für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek. Nachdem Sie einen Mikroliter der frisch zubereiteten Mischung A in die sortierte Probe gegeben haben, mahlen Sie sie mit einem sterilen Stößel.Mit RNAse-freiem Wasser wird das Volumen auf 14 Mikroliter erhöht. Anschließend wird jede Probe in ein dünnwandiges 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen überführt. Bereiten Sie dann die Mischung B vor.Geben Sie 4,4 Mikroliter in Mischung B in jedes PCR-Röhrchen mit den Proben und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren.Inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 72 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die Proben sofort auf Eis gelegt, um das Oligo dT mit dem Poly-A-Schwanz zu hybridisieren. Bereiten Sie das Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch oder das Gemisch C in 21,6 Mikrolitern davon in jedem Röhrchen vor, das die Proben enthält.Die Proben werden einer reversen Transkriptionsreaktion in einem gängigen PCR-Gerät gemäß dem reversen Transkriptionsprogramm unterzogen. Fügen Sie dem Produkt der reversen Transkriptionsreaktion 40,8 Mikroliter der frisch zubereiteten Voramplifikationsreaktionsmischung oder des Gemisches D hinzu und führen Sie das Voramplifikationsprogramm aus. Der Amplifikationszyklus kann durch quantitative PCR bestimmt werden, wenn die Reaktion gerade in die exponentielle Phase eintritt.Um die Produkte der Voramplifikationsreaktion aufzureinigen, werden die voramplifizierten Produkte aus einem PCR-Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie 48 Mikroliter AMPure XP-Beads in jede Probe und mischen Sie sie vor der Inkubation vorsichtig durch Pipettieren. Legen Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen mit den Proben und Kügelchen für fünf Minuten auf einen magnetischen Trennständer.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus den Proben, ohne die Kügelchen zu stören. Nachdem Sie sie in 200 Mikrolitern 80%igem Ethanol resuspendiert haben, legen Sie sie für weitere drei Minuten auf den Magnetabscheideständer. Nachdem Sie den Ethanolüberstand verworfen haben, trocknen Sie die Proben 10 Minuten lang in einem Röhrchen an der Luft.Resuspendieren Sie die Kügelchen in 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie sie dann für fünf Minuten auf den magnetischen Trennständer. Übertragen Sie mit einer Pipette 18 Mikroliter des Überstands aus jedem Röhrchen in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Befolgen Sie schließlich die im Text beschriebenen Schritte, um die Vorbibliothek zu charakterisieren, gefolgt von der Erstellung, Reinigung und Quantifizierung der Bibliothek. Die fluoreszierenden Arabidopsis thaliana-Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Trap-Linien entwickelt. Die fluoreszenzspezifisch markierten Protoplasten wurden erfolgreich anhand der Fluoreszenzintensität und der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung von Singuletts sortiert.Die sortierten Zellen wurden mittels Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung visualisiert. Die repräsentativen Ergebnisse der RNA-Sequenzierungsbibliothek von etwa 2.000 Xylempol-Pericycluszellen, lateralen Wurzelprimordialzellen, Endodermis- oder Cortexzellen und lateralen Wurzelkappenzellen werden gezeigt. Eine kleine Bibliothek mit Primer- oder Adapter-Dimer-Peaks konnte nach der Größenauswahl noch sequenziert werden.Eine Bibliothek mit einer abnormalen Größenverteilung deutete auf eine nicht erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung hin. Die Genexpressionsmuster wurden analysiert. Die Gene, die in einem der vier Wurzelzelltypen angereichert waren, wurden geclustert und in einer Heatmap dargestellt, die die Spezifität der Genexpression zwischen verschiedenen Zelltypen zeigt.Hohe Qualität und Reinheit der Zielzellen durch korrektes Gating und Sortieren sowie die Verhinderung des RNA-Abbaus sind der Schlüssel zum erfolgreichen Bibliotheksaufbau. Für RNA-seq im Einzelzellmodus wurden kürzlich mehrere Methoden beschrieben, die mit dem eindeutigen molekularen Identifikator integriert sind und die Leistung signifikant verbessert haben.

isolation-and-transcriptome-analysis-of-plant-cell-types

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Methode für die Gewinnung von Einzelzellen aus der Ratte primären neuronalen Kulturen und anschließende Transkriptom-Analyse mit aRNA Verstärkung. Dieser Ansatz ist verallgemeinerbar zu jedem Zelltyp.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll für die lasergestützte Mikrodissektion spezifischer Pflanzenzelltypen für die transkriptionelle Profilerstellung. Während das Protokoll für verschiedene Spezies und Zelltypen geeignet ist, liegt der Schwerpunkt bei der Kreuzblütlergattung Boechera auf schwer zugänglichen Zellen der weiblichen Keimbahn, die für die sexuelle und apomiktische Fortpflanzung wichtig sind.

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Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

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