Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten

Unser Protokoll bietet Werkzeuge zur Untersuchung des Darmepithels von Schweinen für die veterinärmedizinische und biomedizinische Forschung. Darmorganoide von Schweinen können verwendet werden, um den Nährstofftransport, die Barrierefunktion und die Wirt-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Durch die Konservierung von Schweinedarmepithelkrypten kann ein großer Vorrat an Stammzellen erzeugt werden, die später zur Kultivierung von Organoiden in 3D- oder 2D-Monoschichten verwendet werden können.

Dieses Protokoll wird für das Jejunum detailliert beschrieben, kann aber auch für andere Darmsegmente wie Zwölffingerdarm, Ileum und Dickdarm verwendet werden. Tauen Sie zunächst schnell ein Fläschchen mit 900 gefrorenen Krypten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Kryptenlösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Bei 300 x g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie 150 Mikroliter der extrazellulären Matrix oder EZM mit einer gekühlten Spitze hinzu, um eine Endkonzentration von 150 Krypten pro 25 Mikroliter EZM zu erhalten. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um eine homogene Suspension der Krypten im ECM zu erhalten.

Säen Sie sechs Vertiefungen mit einem Tropfen von 25 Mikrolitern pro Vertiefung in eine vorgewärmte 48-Well-Platte. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zur Polymerisation der EZM inkubieren. Fügen Sie 250 Mikroliter pro Vertiefung Kulturmedium bei Raumtemperatur hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Wechseln Sie das Nährmedium alle zwei bis drei Tage. Um 3D-Organoide aus gefrorenen Krypten 10 Tage nach der Aussaat zu passieren, entfernen Sie das Nährmedium und fügen Sie 250 Mikroliter vorgewärmtes PBS bei 37 Grad Celsius hinzu. Ersetzen Sie das PBS nach der Inkubation durch 250 Mikroliter vorgewärmtes Enzymdissoziationsreagenz, das mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren bei 37 Grad Celsius in jeder Vertiefung ergänzt wird.

Lösen Sie die Organoide im ECM durch Schaben mit einer P-1000-Pipette und homogenisieren Sie sie vorsichtig durch fünfmaliges Pipettieren. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die Zellen durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren dissoziieren. Geben Sie 500 Mikroliter DMEMc in jede Vertiefung mit dissoziierten Zellen und ziehen Sie bis zu 12 Vertiefungen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern kaltem DMEMc.

Bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter kaltem DMEMc. Zählen Sie die Zellen mit einer Verdünnung von ein bis zwei in Trypanblau mit einem Zellzähler.

Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zelllösung, um 3000 lebende Zellen pro Kuppel zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet mit 17 Mikrolitern kaltem DMEMc pro 3000 lebende Zellen auf Eis. Stellen Sie die Lautstärke auf die erforderliche Anzahl von Vertiefungen ein.

Fügen Sie langsam 33 Mikroliter kalte ECM pro 3000 lebende Zellen hinzu. Stellen Sie das Volumen auf die erforderliche Anzahl von Vertiefungen ein und homogenisieren Sie, ohne Blasen zu bilden. Sehen Sie sich dann die Vertiefungen mit 50 Mikrolitern der ECM-Zellsuspension pro Well in einer vorgewärmten 24-Well-Platte an und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang für die Polymerisation der ECM.

Fügen Sie 500 Mikroliter des Nährmediums pro Vertiefung hinzu. Inkubieren und wechseln Sie dann das Nährmedium alle zwei bis drei Tage. Um den Kultureinsatz zu beschichten, bereiten Sie die Beschichtungslösung mit Kollagen IV vor, die mit 50 Mikrogramm pro Milliliter in kaltem PBS verdünnt ist.

Geben Sie 150 Mikroliter der verdünnten Beschichtungslösung in jeden Zellkultureinsatz und inkubieren Sie sie über Nacht oder drei Stunden lang. Fünf Tage nach dem Spalten lösen Sie die Organoide mit dem ECM, indem Sie sie mit einer P-1000-Pipette abkratzen. Vorsichtig durch Pipettieren im Nährmedium homogenisiert und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern kaltem DMEMc auf Eis überführen.

Zentrifugieren Sie die gesammelten Organoide bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter vorgewärmtem Enzymdissoziationsreagenz, das mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren ergänzt wird. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um die Dissoziation der Organoide einzuleiten.

Zur enzymatischen Verdauung fünf Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Brechen Sie die Organoide mechanisch auf, indem Sie 10 Mal pipettieren und vier Milliliter eiskaltes DMEMc hinzufügen. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Organoid-Zellpellet in einem Milliliter DMEMc resuspendieren.

Zählen Sie die Zellen in Trypanblau mit einem Zellzähler und berechnen Sie das notwendige Volumen, um 2,5 mal 10 bis fünfte Zellen pro Kultureinsatz auszusäen. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension entsprechend 2,5 mal 10 der fünften Zellen pro Kultureinsatz. Während der Zentrifugation die Beschichtungslösung vorsichtig aus den Kultureinsätzen absaugen und fünf Minuten lang ohne Deckel unter der Haube trocknen lassen.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in der erforderlichen Menge an 2D-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, resuspendiert. 200 Mikroliter der Zellsuspension auf die beschichtete durchlässige Membran aufbringen. 500 Mikroliter des 2D-Mediums, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, in das untere Kompartiment geben und inkubieren.

Auf der Membran sollte eine hohe Zelldichte beobachtet werden. Einen Tag nach der Aussaat werden die epischen und basalen Medien durch frische 2D-Medien ohne den ROCK-Inhibitor ersetzt. Wechseln Sie jeden Tag das Medium.

Die Monolage wird einen Tag nach der Aussaat konfluent und kann für ihre Experimente verwendet werden. In dieser Arbeit wurden epitheliale Krypten aus dem Schweinedarm gewonnen und für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Nach dem Auftauen wurden die Kryptenstammzellen in der EZM ausgesät.

Die Organoide wurden innerhalb von drei bis vier Tagen beobachtet und wuchsen schnell und entwickelten knospende Strukturen. Etwa 10 Tage nach dem Auftauen wurde die Passage von Organoiden durchgeführt, um die Kultur zu erweitern. Für eine optimale Aufrechterhaltung der Kultur müssen die für die Verpackung verwendeten Organoide ein klares und leeres Lumen und gut definierte Ränder ohne schwarze Ablagerungen im Lumen aufweisen, wie sie bei reifen Organoiden beobachtet werden.

Die Zellen lagern sich an und bilden innerhalb eines Tages eine vollständig konfluierende Monoschicht, was durch den hohen transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) von etwa 700 Quadratzentimetern bestätigt wird. Der TEER bleibt drei Tage lang hoch. Die Aktinfärbung zeigt an, dass die apikale Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden zum Lumen hin ausgerichtet ist.

Organoide Zellen, die in Kultureinsätzen ausgesät werden, bilden eine konfluierende Einzelschicht von Epithelzellen, wobei die apikale Seite zum oberen Kompartiment hin ausgerichtet ist. Die Okkludinfärbung zeigt das Vorhandensein von Tight Junctions an der apikalen Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden und in Zellmonolagen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Organoide, die zur Aussaat von Zellmonoschichten verwendet werden, klar mit einem leeren Lumen ohne schwarze Ablagerungen erscheinen sollten, die einer Ansammlung toter Zellen entsprechen.

Monoschichten aus Darmorganoiden von Schweinen können verwendet werden, um die Auswirkungen von Metaboliten oder Mikroben auf die epitheliale Barrierefunktion zu testen, indem funktionelle Assays, Bildgebung und Genexpressionsanalysen verwendet werden.