Name: Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und die Etablierung von Zellmonoschichten für veterinärmedizinische und biomedizinische Forschung.

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Diese Arbeit wurde vom Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig"-Projekt) und von INRAE HOLOFLUX ("Holopig"-Projekt) unterstützt. Dankbar sind die Autoren den Genotoul Core Facilities (TRI). Wir danken Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) für das sorgfältige Korrekturlesen.

<ol><li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465(2013).</li>
<li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368(2021).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+enteroids%3A+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682(2019).</li>
<li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375(2020).</li>
<li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li>
<li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031(2022).</li>
<li>Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance%2C+intestinal+development%2C+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Tsai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li>
<li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+porcine+intestinal+organoids%3A+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li>
<li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li>
<li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced%2C+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143(2021).</li>
<li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94(2021).</li>
<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821(2020).</li>
<li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011(2020).</li>
<li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease%2C+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Stem+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li>
<li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196(2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394(2019).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kryokonservierung von Epithelkrypten aus dem Ferkeldarm für die Langzeitlagerung und anschließende Kultivierung von 3D-Organoiden. Dieses Protokoll verwendet eine Gefrierlösung, die DMSO, FBS, den Y27632 ROCK-Inhibitor, DMEM und Antibiotika enthält. In einer anderen Studie an Schweinen wurden Organoide aus Krypten gewonnen, die in einer ähnlichen Gefrierlösung kryokonserviert wurden, jedoch ohne den ROCK-Inhibitor15. Der Y27632 ROCK-Inhibitor wurde hinzugefügt, um Apoptose zu verhindern und den Stammzellpool aufrechtzuerhalten, da epitheliale Kryptenzellen nach dem Auftauen dissoziiert werden, was zum Zelltod ("anoikis") führen kann27,28. Interessanterweise wurden equine Enteroide aus Epithelkrypten gewonnen, die in einem Nährmedium eingefroren wurden, das nur DMEM und DMSO16 enthielt; Diese einfache Methode wurde noch nicht für Epithelkrypten von Schweinen getestet. Es wurden andere Methoden veröffentlicht, um Organoide von Menschen und Schweinen aus gefrorenem Gewebe oder Biopsien anstelle von Epithelkrypten zu züchten 4,17. Der Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, das Darmgewebe direkt zu kryokonservieren, ohne die Kryptenisolierung durchzuführen, die Zeit und Laborgeräte erfordert. Dies kann praktisch sein, wenn das Gewebe weit weg vom Labor entnommen werden muss. Bei der Isolierung der Krypten unmittelbar nach der Schlachtung können jedoch große Darmsegmente verarbeitet werden, um eine sehr hohe Anzahl von Krypten zu erhalten, was bei der Entnahme von kleinen gefrorenen Gewebefragmenten nicht der Fall ist. Nach dem Auftauen der Epithelkrypten wurden die Organoide 3-4 Tage nach der Aussaat beobachtet und nach 10 Tagen gespalten. Dies ist eine langsamere Wachstumsrate als beim Beginn der Kultur aus frischen Epithelkrypten, für die die Organoide ab Tag 1 nach der Aussaat gewonnen wurden, und kann in der Regel um Tag 5bis 11 geteilt werden. Khalil et al. berichteten auch über ein verzögertes Wachstum von Schweineenteroiden, wenn sie von gefrorenen Krypten ausgehen15, was darauf hindeutet, dass Stammzellen möglicherweise Zeit benötigen, um ihre proliferative Kapazität wiederzuerlangen. Wir erhielten auch eine geringere Anzahl von Organoiden, wenn wir aus gefrorenen Krypten im Vergleich zu frischen Krypten ausgingen, was auf das Absterben von Stammzellen während des Einfrierprozesses zurückzuführen sein könnte. Bei einigen Versuchen des Auftauens von Krypten (<20%) erhielten wir keine Organoide aus gefrorenen Krypten, wahrscheinlich aufgrund eines suboptimalen Kryokonservierungsverfahrens (z. B. verzögertes Einfrieren nach Kryptenisolierung von wahrscheinlich mehr als 1 h). Wir empfehlen daher, die Krypten bis zur Zählung auf Eis zu legen und sie so schnell wie möglich einzufrieren.
Für 3D-Organoide haben wir uns für ein kommerzielles Organoid-Nährmedium entschieden, das für den Menschen entwickelt wurde. In der Tat haben frühere Berichte gezeigt, dass Schweinedarmorganoide mit diesem Medium effizient wachsen 8,11,14,19,25,26,29,30. Es ist von Interesse, dass dieses Nährmedium gebrauchsfertig ist und eine standardisierte Konzentration von Wachstumsfaktoren innerhalb einer Charge aufweist. Dieses Nährmedium ist jedoch kostspielig, seine Zusammensetzung ist nicht offenbart und es ist daher nicht möglich, seine Zusammensetzung zu modulieren. Im Gegensatz dazu wurden in anderen Studien Darmorganoide von Schweinen in maßgeschneiderten Medien kultiviert, die pharmakologische Inhibitoren, rekombinante Wachstumsfaktoren und/oder konditionierte Medien enthielten 5,6,7,21. Obwohl diese Methode sehr flexibel und kostengünstig ist, ist sie zeitaufwändig für die Herstellung konditionierter Medien und kann aufgrund der potenziellen Variabilität in der Konzentration von Wachstumsfaktoren in konditionierten Medien nicht reproduzierbar sein. Daher sollte die Qualität jeder Charge konditionierter Medien durch Messung des Organoidwachstums oder der Markergenexpressionvalidiert werden 31.
Eine Studie hat gezeigt, dass jejunale Organoide von Schweinen, die in demselben kommerziellen Organoid-Nährmedium kultiviert wurden, das hier verwendet wurde, schneller wuchsen und weniger differenziert zu sein schienen, verglichen mit Enteroiden, die mit Medien kultiviert wurden, die rekombinanten Wachstumsfaktor und/oder konditionierten Medien enthielten23. Ein hoher proliferativer Zustand erleichtert die Kultivierung von 3D-Organoiden, erfordert jedoch möglicherweise eine Induktion der Differenzierung, um repräsentativer für die physiologischen Eigenschaften des Darms zu sein. Bei diesem Protokoll werden die Zellen für die Passage von 3D-Organoiden für die Zählung vollständig dissoziiert, wodurch die Anzahl der in der EZM ausgesäten Zellen kontrolliert werden kann. Dies erhöht die Reproduzierbarkeit des Phänotyps von Organoiden, die stark von ihrer Dichte beeinflusst wird. Darüber hinaus vermeidet die Zählung der Zellen, dass eine zu niedrige oder überfüllte Kultur erhalten wird, was eine Anpassung des Kulturplans erfordert. In den meisten anderen Studien wurden Organoidfragmente hergestellt, die nicht vollständig in einzelne Zellen dissoziiert waren, und ein Verdünnungsverhältnis für die Passage verwendet. Diese Methode ist einfacher, kann aber je nach Organoiddichte der Kultur zu einer Variabilität führen.
Für die Kultur in Monoschichten werden Organoidzellen in Kultureinsätze eingesät, die mit einer dünnen EZM-Schicht vorbeschichtet sind, die die Anheftung von Zellen ermöglicht, aber das Wachstum von Organoiden in 3D verhindert. Bei diesem Protokoll wurde Kollagen Typ IV als ECM-Protein verwendet, wie zuvor bei Schweinenbeschrieben 23. Andere Studien mit Schweine-Organoid-Monolayern verwendeten die gleiche tumorabgeleitete EZM, die hier verwendet wurde, um 3D-Organoide zu kultivieren 6,8,9,21,25,30. Der Vorteil der Verwendung von Kollagen ist die Möglichkeit, die Proteinkonzentration mit einer vollständig definierten Zusammensetzung zu standardisieren, was bei der tumorbedingten EZM nicht der Fall ist. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Kultivierung von Zellmonolayern besteht darin, auf das visuelle Erscheinungsbild der Vorläufer-3D-Organoide zu achten, die gut definierte Kanten und ein leeres Lumen ohne schwarze Trümmer aufweisen sollten. In der Tat sind Organoide mit einem hohen Reifegrad und einer niedrigen Proliferationsrate keine geeignete Zellquelle für die 2D-Kultur. Daher ist der Zeitpunkt der Dissoziation von 3D-Organoiden in einzelne Zellen entscheidend für den Erfolg dieses Schritts.
Die Kultivierung von 2D-Monoschichten aus einzelnen Zellen ermöglicht die Standardisierung der Anzahl der ausgesäten Zellen, was schwieriger ist, wenn man von Organoidfragmenten ausgeht, wie es bei einigen anderen Methoden der Fall ist. Wir säten 7,6 x 10 5 Zellen pro cm2 aus, was im Vergleich zu den meisten anderen Studien 21,22,23 bei Schweinen mit einer geringeren Zelldichte von 0,25 x 105 Zellen pro cm2 bis 1,78 x 105 Zellen pro cm2 hoch ist. Die Forderung nach einer hohen Anzahl von Organoidzellen stellt eine Einschränkung dieses Protokolls dar, aber es ermöglichte uns, schnell eine konfluente Monoschicht zu erhalten, die den Kultureinsatz nach 1 Tag vollständig bedeckt. Im Gegensatz dazu erreichten Vermeire et al.23 eine Konfluenz nach 4-7 Tagen mit einer geringeren Dichte der ausgesäten Zellen (von 0,25 x 10 5 Zellen/cm2 auf 0,4 x 105 Zellen/cm2). In einigen Studien wurden auch Organoidzell-Monoschichten von Schweinen verwendet, die die Kulturoberfläche für Infektionen mit Viren nicht vollständig bedeckten 8,30. Unter diesen Bedingungen ist die apikale Seite der Epithelzellen für Behandlungen zugänglich, aber vollständig konfluierende Monoschichten sind erforderlich, wenn das Ziel darin besteht, die Nährstoffaufnahme oder die Epithelpermeabilität zu untersuchen.
Für Organoidzell-Monolayer wurde ein kommerzielles Organoid-Nährmedium verwendet, das mit 20 % FBS ergänzt wurde, basierend auf einer kürzlich durchgeführten Studie an Rinder-Enteroid-Monolayern32. In unseren Tests war die Supplementierung mit 20% FBS notwendig, um vollständig konfluierende Monolagen zu erhalten, wahrscheinlich aufgrund eines hohen Wachstumsfaktorbedarfs. Im Gegenteil, andere Studien, die das gleiche kommerzielle Medium verwendeten, haben Monolagen ohne zusätzliche FBS 8,25,30 etabliert, ohne jedoch eine vollständige Konfluenz zu erreichen. In anderen Studien wurde auch eine Supplementierung mit 20 % FBS in einem maßgeschneiderten Medium für die Kultivierung von Organoidzell-Monolayern von Schweinen verwendet21,22. In unseren Experimenten ist TEER 1 Tag nach der Aussaat hoch (ca. 700 Ω·cm 2) und bleibt bis Tag 3 hoch (ca. 1.500 Ω·cm2; dies stimmt mit der Bildung von Tight Junctions überein, was durch die Expression von Occludin angezeigt wird. Van der Hee et al. erhielten ähnliche TEER-Werte über 72 h für Jejunum-Organoidzell-Monolayer21. Sie zeigten auch, dass Monoschichten bis zum 12. bis 15. Tag mit täglichem Medienwechsel aufrechterhalten werden können. Im Gegensatz dazu haben andere Studien viel niedrigere TEER-Werte (ca. 200 Ω·cm2) für Organoidzell-Monoschichten von Schweinen berichtet 6,22. Diese Unterschiede zwischen den Studien könnten mit dem untersuchten Darmsegment oder den verwendeten Medien zusammenhängen, die die Epitheldifferenzierung beeinflussen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das obige Protokoll zur Zucht von Schweinedarm-3D-Organoiden aus gefrorenen Epithelkrypten die Organisation der Kulturarbeit erleichtert. Es reduziert den Bedarf an frischem Gewebe, das von lebenden Tieren gewonnen werden muss. Wir erklären auch, wie man in weniger als 3 Tagen vollständig konfluierende Zellmonoschichten aus Schweineorganoiden herstellen kann. Daher könnten unsere Protokolle nützliche Ressourcen für Wissenschaftler sein, die das Darmepithel von Schweinen für die veterinärmedizinische oder biomedizinische Forschung untersuchen.

Das Darmepithel besteht aus einer Monoschicht von Zellen, die die Verdauungsschleimhaut an der Grenzfläche zur luminalen Umgebung bedecken. Diese Position ist mit verschiedenen Funktionen verbunden, wie z. B. der Nährstoffaufnahme und der Barrierefunktion, die durch das Vorhandensein von Stammzellen und mehreren differenzierten Epithelzelltypen (absorbierende, enteroendokrine, Paneth- und Becherzellen) unterstützt werden1. Immortalisierte Zelllinien, die traditionell zur Untersuchung von Epithelzellen verwendet werden, weisen große Einschränkungen auf, da sie nicht die zelluläre Komplexität des Darmepithels widerspiegeln und genomische Anomalien aufweisen2. Die Entwicklung von dreidimensionalen (3D) Organoiden durch Sato et al.3 lieferte ein neues Modell zur Untersuchung des Darmepithels mit einer verbesserten physiologischen Relevanz. Tatsächlich werden Darmorganoide aus nicht transformierten Stammzellen gewonnen, bestehen aus mehreren Zelltypen und rekapitulieren die Funktionalität des Darmepithels. Darmorganoide werden zunehmend verwendet, um die Entwicklung und Funktion des Darmepithels und seine Wechselwirkungen mit Krankheitserregern, Nährstoffen, Toxinen, Medikamenten, der Mikrobiota und ihren Metaboliten zu verstehen2.
Ursprünglich für Menschen und Mäuse entwickelt, wurden die Methoden zur Kultivierung von Darmorganoiden in jüngster Zeit auch auf andere Spezies übertragen, darunter Schweine4. Gonzales et al.5 waren die ersten, die Schweineorganoide aus dem Jejunum kultivierten; Seitdem wurden porcine Organoide für andere Darmsegmente (Zwölffingerdarm, Ileum und Dickdarm) beschrieben6,7,8, und es wurde gezeigt, dass sie einen ortsspezifischen Phänotyp beibehalten 9,10,11. 3D-Organoide aus Schweinedarm werden heute häufig verwendet, um die Wirkung von Nährstoffen 12,13 oder Darminfektionen 6,8,14 zu untersuchen.
Die meisten Studien haben die Kultivierung von Darmorganoiden ausgehend von frisch isolierten Epithelkrypten beschrieben. Dies ist jedoch aus logistischen Gründen nicht immer möglich, insbesondere bei der Arbeit mit großen Tieren wie Schweinen. In der Tat können sich Tiereinrichtungen für Schweine weit vom Labor entfernt befinden, in dem Organoide kultiviert werden, was die Arbeitsorganisation erschwert. Darüber hinaus ist die Organoidkultur zeitaufwändig; Daher ist es nicht praktikabel, mehrere Organoidlinien gleichzeitig zu züchten, z. B. aus verschiedenen Darmsegmenten oder mehreren Tieren. Um diese Probleme zu umgehen, wurden in einigen Studien an Menschen, Pferden und Schweinen Methoden zur Kultivierung von Organoiden aus gefrorenem Darmgewebe (oder Biopsien) oder aus isolierten Epithelkryptenbeschrieben 4,15,16,17. Diese Methoden ermöglichen die Kryokonservierung von Darmepithelstammzellen aus mehreren Darmsegmenten eines einzigen Tieres, die dann bei Bedarf zur Züchtung von Organoiden verwendet werden können. Darüber hinaus ermöglicht dies eine starke Reduzierung der Anzahl lebender Tiere, die als Spender von Stammzellen verwendet werden, da große Bestände an kryokonservierten Krypten angelegt werden können (Prinzipien von 3R). Ein weiterer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass intestinale Organoide nur von Tieren von Interesse gezüchtet werden, nachdem phänotypische oder genotypische Ergebnisse erzielt wurden, was sehr kostengünstig ist.
In vivo sind die Darmepithelzellen polarisiert, wobei die apikale Seite zum Lumen gerichtet ist. In vitro ist bei 3D-Organoiden die apikale Seite der Epithelzellen ebenfalls dem Lumen zugewandt (d. h. innerhalb der Organoide)4. Diese Organisation verhindert den Zugang zur apikalen Seite, was ein Problem darstellt, wenn die Auswirkungen von luminalen Komponenten (z. B. Nährstoffe, Mikroben, Metaboliten) auf Epithelzellen untersucht werden. Um diesen Nachteil zu umgehen, wurden verschiedene Methoden entwickelt, wie z. B. die Kultur von Organoidzellen als 2D-Monolayer, die Mikroinjektion und die Polaritätsumkehr ("apikale Organoide")18,19. Die Kultivierung von Organoidzell-Monoschichten entwickelt sich zum effizientesten und kontrollierbarsten System. Das Prinzip besteht darin, 3D-Organoide in einzelne Zellen zu dissoziieren und sie auf ein Zellkulturgefäß zu legen, das zuvor mit einer dünnen Schicht extrazellulärer Matrix (EZM) beschichtet war20. Unter diesen Kulturbedingungen ist die apikale Seite der Epithelzellen nach oben gerichtet und somit für experimentelle Behandlungen zugänglich20. Die Kultivierung von Organoidzell-Monoschichten wurde kürzlich für den Schweinedarm adaptiert21,22; Zellmonoschichten, die aus Schweine-3D-Organoiden gewonnen wurden, wurden für zahlreiche Anwendungen verwendet, darunter die Untersuchung von enterischen Infektionen 6,23,24,25, des Transports von Nährstoffen 9 und der Modellierung von Verdauungskrankheiten 26.
In dieser Arbeit wird zunächst ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung und Konservierung von 3D-Organoiden aus dem Darm von Schweinen vorgestellt, die aus kryokonservierten Epithelkrypten gewonnen wurden (Abbildung 1). Anschließend wird ein Protokoll zur Etablierung von Zellmonoschichten aus 3D-Organoiden im Darm von Schweinen beschrieben. Die hier beschriebenen Methoden bieten experimentelle Werkzeuge, mit denen das Darmepithel von Schweinen auf Nährstofftransport, Barrierefunktion und Wirt-Mikroorganismus-Interaktionen untersucht werden kann.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte </td><td>Corning</td><td>003526</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Zellkulturplatte </td><td>Corning</td><td>003548</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>A6003</td><td>Bei 4 & Grad C lagern.</td></tr><tr><td>Zentrifuge Universal 320 R</td><td>Hettich</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ IV aus humaner Plazenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Bereiten Sie die Stammlösung bei 1 mg/mL in Essigsäure gemäß der Empfehlung des Herstellers vor. Aliquot (500 &micro; L) und bei -20 °C lagern. </td></tr><tr><td>CoolCell LX Cell Freezing</td><td>Container Corning</td><td>432003</td><td>Wird zur Kryokonservierung von Krypten und Organoiden verwendet. </td></tr><tr><td>Countess 3 Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16842556</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>630-1845</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen ClearLine 1 mL</td><td>Klare Linie </td><td>390706</td><td>Wird zur Kryokonservierung von Krypten und Organoiden verwendet. </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Bereiten Sie die Stammlösung bei 5 mg/ml in Wasser gemäß dem Hersteller vor. Empfehlung. Aliquot (20 & Mikro; L) und lagern bei -20 °; C </td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT) </td><td>Merck</td><td>10197777001</td><td>Lagern bei 4 &°C.</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31966047</td><td>Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Epredia Superfrost Plus Adhesion mikroskopischer Objektträger</td><td>VWR</td><td>631-9483 </td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>5 ml Aliquote bei -20 μC lagern.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile Zellsiebe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Wird für die Isolierung von Krypten verwendet. </td></tr><tr><td>3D-Plattformrotator VWR </td><td></td><td> 97025-564 </td> mit fester Neigung <td>Wird für Inkubationen im Immunfärbeprotokoll verwendet. </td></tr><tr><td>Gibco PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010015</td><td>bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Express Enzym (1x), phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>Reagenz zur Enzymdissoziation. Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Sekundärer Antikörper. Bei 4 °C lagern. Arbeitsverdünnung 1:1000. </td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid-Wachstumsmedium (Mensch)</td><td>Stammzelltechnologie</td><td>6010</td><td>Organoid-Kulturmedium. Bei -20 °C lagern. Das Basalmedium und das Organoid-Präparat bei Raumtemperatur auftauen und (1:1) mischen. Lagern Sie die Mischung bei 4 Grad; C für bis zu 1 Woche. </td></tr><tr><td>Einsatz mit PET-Membran transparent Falcon für Platte 24 Wells</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td> Eclipse TS2</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basalmembran Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Tumor-abgeleitete extrazelluläre Matrix, die für die 3D-Kultur von Organoiden verwendet wird. Matrigel polymerisiert bei Raumtemperatur. Verwenden Sie gekühlte Spitzen, um das Matrigel zu pipettieren. Prepare 500 &micro; L aliquotiert und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Eindeckmedium für die Fluoreszenz mit DAPI</td><td>Vectashield</td><td>H1250</td><td> Bei 4 °C lagern. </td></tr><tr><td>Polyklonaler Occludin-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>71-1500</td><td>Primärer Antikörper. Bei -20 °C lagern. Arbeitsverdünnung 1:200. </td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32%</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>15714</td><td>Bereiten Sie 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung unter chemischer Haube vor, indem Sie 5 mL 32% PFA zu 35 mL PBS hinzufügen. Aliquotieren Sie um 10 mL und lagern Sie es bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Antibakteriell. Lagern Sie 5 mL Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Phalloidin TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Sonde für die Aktinfärbung. 1 mg/ml Stammlösung. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td>Antimikrobielles Mittel für Primärzellen, das auf Bakterien, Mykoplasmen und Pilze wirkt. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor (Y27632)</td><td>ATCC</td><td>ACS-3030</td><td>Wird zur Erhaltung der Stammzellen verwendet. Bereiten Sie die Stammlösung bei 10 mM in sterilem Wasser gemäß der Empfehlung des Herstellers vor und lagern Sie die Aliquote (50 & Mikro; L) bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Rotierender Schüttler Mix XL</td><td>Klare Linie </td><td>062646CL</td><td>Wird für die Kryptenisolierung verwendet. </td></tr><tr><td>Serologische Pipetten mit Stripette 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale </td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>8787</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Trypan Blue stain 0,4 % </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Vakuumsystem Vacusip</td><td>Integra</td><td>159000</td><td>Wird verwendet, um das Medium von Organoid-Vertiefungen zu entfernen. </td></tr></tbody></table>

kultivierung von ferkel-darm-3d-organoiden aus kryokonservierten epithelkrypten und etablierung von zellmonoschichten

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Darmorganoide werden zunehmend verwendet, um das Darmepithel für die Modellierung von Verdauungskrankheiten zu untersuchen oder um Wechselwirkungen mit Medikamenten, Nährstoffen, Metaboliten, Krankheitserregern und der Mikrobiota zu untersuchen. Methoden zur Kultivierung von Darmorganoiden stehen jetzt für mehrere Spezies zur Verfügung, darunter auch Schweine, eine Spezies, die sowohl als Nutztier als auch als translationales Modell für den Menschen von großem Interesse ist, z. B. zur Untersuchung von Zoonosen. Hier geben wir eine ausführliche Beschreibung eines Verfahrens, das zur Kultivierung von 3D-Organoiden aus gefrorenen Epithelkrypten verwendet wird. Das Protokoll beschreibt die Kryokonservierung von Epithelkrypten aus dem Schweinedarm und die anschließenden Verfahren zur Kultivierung von 3D-Darmorganoiden. Die Hauptvorteile dieser Methode sind (i) die zeitliche Dissoziation der Isolierung von Krypten aus der Kultur von 3D-Organoiden, (ii) die Präparation großer Bestände an kryokonservierten Krypten, die aus mehreren Darmsegmenten und von mehreren Tieren gleichzeitig stammen, und damit (iii) die Verringerung der Notwendigkeit, frisches Gewebe von lebenden Tieren zu beproben. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Etablierung von Zellmonolayern, die von 3D-Organoiden abgeleitet sind, um den Zugang zur apikalen Seite von Epithelzellen zu ermöglichen, die der Ort der Wechselwirkungen mit Nährstoffen, Mikroben oder Medikamenten ist. Insgesamt sind die hier beschriebenen Protokolle eine nützliche Ressource für die Untersuchung des Darmepithels von Schweinen in der veterinärmedizinischen und biomedizinischen Forschung.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll werden Epithelkrypten aus dem Schweinedarm gewonnen und für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff kryokonserviert (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Nach dem Auftauen werden die Kryptenstammzellen in der EZM ausgesät (Abbildung 2B). Die Kryptenstruktur geht in der Regel nach diesem Schritt verloren, da die Kryptenstruktur im ECM zerfällt. Die Organoide können innerhalb von 3-4 Tagen beobachtet werden und wachsen dann schnell und entwickeln knospende Strukturen (Abbildung 2B). Wir erhielten erfolgreich Organoide, nachdem wir gefrorene Krypten in &gt;80% der Versuche aufgetaut hatten. Etwa 10 Tage nach dem Auftauen (entsprechend der Wachstumsrate der Organoide) wird eine Passage von Organoiden durchgeführt, um die Kultur zu erweitern (Abbildung 3). Die Organoide wachsen nach der Spaltung schneller und weisen unterschiedliche Morphologien auf, wobei einige zystische und die meisten knospenden Organoide vorhanden sind. Um eine optimale Aufrechterhaltung der Kultur zu gewährleisten, müssen die für die Passage verwendeten Organoide ein klares und leeres Lumen und gut definierte Ränder aufweisen (Beispiele durch grüne Pfeile gekennzeichnet) ohne schwarze Ablagerungen im Lumen (gekennzeichnet durch rote Pfeile), wie dies bei reifen Organoiden zu beobachten ist (Abbildung 3). Wir fanden heraus, dass sich die Trümmer der schwarzen Blutkörperchen um den 6. Tag nach der Passage ansammeln. Daher wird empfohlen, die Organoide am 4.-5. Tag nach der Passage zu spalten oder einzufrieren.
Auch das Reifestadium der Organoide ist ein wichtiger Punkt bei der Gewinnung von Zellmonolagen. Organoide mit fortgeschrittener Reife (angezeigt durch das Vorhandensein von schwarzen Blutkörperchen im Lumen) sind nicht optimal, um Monoschichten zu besiedeln. In der Regel dissoziieren wir 3D-Organoide 4 Tage nach der Passage, um Zellen für die 2D-Kultur zu sammeln. Etwa ein bis drei Vertiefungen mit 3D-Organoiden, die mit 3.000 Zellen pro 50-μl-Kuppel der EZM kultiviert werden, werden benötigt, um einen Kultureinsatz mit 2,5 x 105 Zellen zu besiedeln. Die Zellen heften sich an und bilden innerhalb von 1 Tag eine vollständig konfluierende Monoschicht (Abbildung 4A), was durch den hohen TEER von etwa 700 Ω·cm2 bestätigt wird (Abbildung 4B). Allerdings sind die Zellränder zu diesem frühen Zeitpunkt mit der Hellfeldmikroskopie nur schwer sichtbar zu machen, was wahrscheinlich auf ein geringes Differenzierungsniveau zurückzuführen ist. Der TEER bleibt 3 Tage lang hoch (Abbildung 4B).
Die Aktinfärbung zeigt an, dass die apikale Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden zum Lumen hin ausgerichtet ist (Abbildung 5A). Organoide Zellen, die in den Kultureinsatz eingesät werden, bilden eine konfluente einzelne Schicht von Epithelzellen, wobei die apikale Seite zum oberen Kompartiment hin ausgerichtet ist (Abbildung 4B, C). Die Okkludinfärbung zeigt das Vorhandensein von Tight Junctions an der apikalen Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden und in Zellmonolagen (Abbildung 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methoden zur Kultivierung von 3D-Organoiden und Zellmonolayern, die von Organoiden abgeleitet sind. Epithelkrypten werden aus dem Ferkeldarm isoliert. Diese Krypten können i) sofort zur Kultivierung von 3D-Organoiden verwendet oder ii) eingefroren und in einer Biobank in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Kryokonservierte Krypten können aufgetaut und zur Kultivierung von 3D-Organoiden verwendet werden. Die 3D-Organoidkultur kann durch sukzessive Spaltung beibehalten oder eingefroren und in der Biobank gelagert werden. Aus der 3D-Organoidkultur können Zellmonoschichten gewonnen werden, um den Zugang zur apikalen Seite der Zellen zu ermöglichen und die epitheliale Barrierefunktion zu untersuchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Kultivierung von 3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkryptionen. (A) Repräsentative mikroskopische Aufnahme frisch isolierter Jejunalkrypten. (B) Repräsentative mikroskopische Aufnahmen von 3D-Organoiden, die nach dem Auftauen der jejunalen Krypten aufgenommen wurden. Die Organoide wurden in einer 25 μL EZM-Kuppel in einer 48-Well-Platte kultiviert. Die Abbildung zeigt Bilder der 3D-Organoide 4, 7, 8, 9 und 10 Tage nach der Aussaat. Der Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Morphologie von 3D-Organoiden aus dem Darm von Schweinen, die aus kryokonservierten Epithelkrypten nach der ersten Passage gewonnen wurden. Repräsentative mikroskopische Aufnahmen, die die Entwicklung von Organoiden aus kryokonservierten Jejunumkrypten nach der ersten Passage von Tag 4 bis Tag 7 zeigen. Grüne Pfeile zeigen klare Organoide an, die für die Passage oder Aussaat von Monoschichten geeignet sind. Rote Pfeile zeigen reife Organoide an, die nicht zum Spalten oder Aussäen von Monoschichten geeignet sind. Daher sollten Brunnen vor der Erscheinung dieser Morphologie verwendet werden. Der Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Charakteristika von Zellmonolayern, die aus 3D-Organoiden aus Schweineintestinalen abgeleitet wurden . (A) Repräsentative mikroskopische Aufnahmen der Monolayer-Morphologie über 3 Tage. Jejunum-Organoidzellen wurden bei 2,5 x 105 Zellen in 0,33 cm2 Zellkultureinsätze eingesät, die mit Kollagen i.v. bei 50 ng/ml beschichtet waren. Der Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. (B) Transepithelialer elektrischer Widerstand (TEER) von Organoidzell-Monolagen über 3 Tage. Punkte, die durch eine Linie verbunden sind, entsprechen demselben Well zu unterschiedlichen Zeiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> Abbildung 5: Bildgebung von Schweine-Jejunum-Organoiden, die in 3D oder 2D kultiviert wurden. Konfokalmikroskopische Bildgebung von (A) 3D-Organoiden 5 Tage nach der Teilung und (B,C)-Organoidzell-Monolayern 3 Tage nach der Aussaat (B: XZ-Schnitt; C: XY-Abschnitt). Die DNA (blau) wurde mit DAPI gefärbt. Aktin (rot) wurde mit Phalloidin gefärbt. Occludin (grün) wurde mit einem polyklonalen Antikörper gefärbt. Weiße Pfeile zeigen Occludin an, das an der Tight Junction lokalisiert ist. Der Maßstabsbalken stellt 20 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Kultivierung von 3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkryptionen. Wir beschreiben auch eine Methode zur Etablierung von Zellmonolagen, die von 3D-Organoiden abgeleitet sind und den Zugang zur apikalen Seite von Epithelzellen ermöglichen.

Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Unser Protokoll bietet Werkzeuge zur Untersuchung des Darmepithels von Schweinen für die veterinärmedizinische und biomedizinische Forschung. Darmorganoide von Schweinen können verwendet werden, um den Nährstofftransport, die Barrierefunktion und die Wirt-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Durch die Konservierung von Schweinedarmepithelkrypten kann ein großer Vorrat an Stammzellen erzeugt werden, die später zur Kultivierung von Organoiden in 3D- oder 2D-Monoschichten verwendet werden können.Dieses Protokoll wird für das Jejunum detailliert beschrieben, kann aber auch für andere Darmsegmente wie Zwölffingerdarm, Ileum und Dickdarm verwendet werden. Tauen Sie zunächst schnell ein Fläschchen mit 900 gefrorenen Krypten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Kryptenlösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.Bei 300 x g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie 150 Mikroliter der extrazellulären Matrix oder EZM mit einer gekühlten Spitze hinzu, um eine Endkonzentration von 150 Krypten pro 25 Mikroliter EZM zu erhalten. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um eine homogene Suspension der Krypten im ECM zu erhalten.Säen Sie sechs Vertiefungen mit einem Tropfen von 25 Mikrolitern pro Vertiefung in eine vorgewärmte 48-Well-Platte. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zur Polymerisation der EZM inkubieren. Fügen Sie 250 Mikroliter pro Vertiefung Kulturmedium bei Raumtemperatur hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Wechseln Sie das Nährmedium alle zwei bis drei Tage. Um 3D-Organoide aus gefrorenen Krypten 10 Tage nach der Aussaat zu passieren, entfernen Sie das Nährmedium und fügen Sie 250 Mikroliter vorgewärmtes PBS bei 37 Grad Celsius hinzu. Ersetzen Sie das PBS nach der Inkubation durch 250 Mikroliter vorgewärmtes Enzymdissoziationsreagenz, das mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren bei 37 Grad Celsius in jeder Vertiefung ergänzt wird.Lösen Sie die Organoide im ECM durch Schaben mit einer P-1000-Pipette und homogenisieren Sie sie vorsichtig durch fünfmaliges Pipettieren. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die Zellen durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren dissoziieren. Geben Sie 500 Mikroliter DMEMc in jede Vertiefung mit dissoziierten Zellen und ziehen Sie bis zu 12 Vertiefungen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern kaltem DMEMc.Bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter kaltem DMEMc. Zählen Sie die Zellen mit einer Verdünnung von ein bis zwei in Trypanblau mit einem Zellzähler.Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zelllösung, um 3000 lebende Zellen pro Kuppel zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet mit 17 Mikrolitern kaltem DMEMc pro 3000 lebende Zellen auf Eis. Stellen Sie die Lautstärke auf die erforderliche Anzahl von Vertiefungen ein.Fügen Sie langsam 33 Mikroliter kalte ECM pro 3000 lebende Zellen hinzu. Stellen Sie das Volumen auf die erforderliche Anzahl von Vertiefungen ein und homogenisieren Sie, ohne Blasen zu bilden. Sehen Sie sich dann die Vertiefungen mit 50 Mikrolitern der ECM-Zellsuspension pro Well in einer vorgewärmten 24-Well-Platte an und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang für die Polymerisation der ECM.Fügen Sie 500 Mikroliter des Nährmediums pro Vertiefung hinzu. Inkubieren und wechseln Sie dann das Nährmedium alle zwei bis drei Tage. Um den Kultureinsatz zu beschichten, bereiten Sie die Beschichtungslösung mit Kollagen IV vor, die mit 50 Mikrogramm pro Milliliter in kaltem PBS verdünnt ist.Geben Sie 150 Mikroliter der verdünnten Beschichtungslösung in jeden Zellkultureinsatz und inkubieren Sie sie über Nacht oder drei Stunden lang. Fünf Tage nach dem Spalten lösen Sie die Organoide mit dem ECM, indem Sie sie mit einer P-1000-Pipette abkratzen. Vorsichtig durch Pipettieren im Nährmedium homogenisiert und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern kaltem DMEMc auf Eis überführen.Zentrifugieren Sie die gesammelten Organoide bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter vorgewärmtem Enzymdissoziationsreagenz, das mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren ergänzt wird. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um die Dissoziation der Organoide einzuleiten.Zur enzymatischen Verdauung fünf Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Brechen Sie die Organoide mechanisch auf, indem Sie 10 Mal pipettieren und vier Milliliter eiskaltes DMEMc hinzufügen. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Organoid-Zellpellet in einem Milliliter DMEMc resuspendieren.Zählen Sie die Zellen in Trypanblau mit einem Zellzähler und berechnen Sie das notwendige Volumen, um 2,5 mal 10 bis fünfte Zellen pro Kultureinsatz auszusäen. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension entsprechend 2,5 mal 10 der fünften Zellen pro Kultureinsatz. Während der Zentrifugation die Beschichtungslösung vorsichtig aus den Kultureinsätzen absaugen und fünf Minuten lang ohne Deckel unter der Haube trocknen lassen.Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in der erforderlichen Menge an 2D-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, resuspendiert. 200 Mikroliter der Zellsuspension auf die beschichtete durchlässige Membran aufbringen. 500 Mikroliter des 2D-Mediums, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, in das untere Kompartiment geben und inkubieren.Auf der Membran sollte eine hohe Zelldichte beobachtet werden. Einen Tag nach der Aussaat werden die epischen und basalen Medien durch frische 2D-Medien ohne den ROCK-Inhibitor ersetzt. Wechseln Sie jeden Tag das Medium.Die Monolage wird einen Tag nach der Aussaat konfluent und kann für ihre Experimente verwendet werden. In dieser Arbeit wurden epitheliale Krypten aus dem Schweinedarm gewonnen und für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff kryokonserviert. Nach dem Auftauen wurden die Kryptenstammzellen in der EZM ausgesät.Die Organoide wurden innerhalb von drei bis vier Tagen beobachtet und wuchsen schnell und entwickelten knospende Strukturen. Etwa 10 Tage nach dem Auftauen wurde die Passage von Organoiden durchgeführt, um die Kultur zu erweitern. Für eine optimale Aufrechterhaltung der Kultur müssen die für die Verpackung verwendeten Organoide ein klares und leeres Lumen und gut definierte Ränder ohne schwarze Ablagerungen im Lumen aufweisen, wie sie bei reifen Organoiden beobachtet werden.Die Zellen lagern sich an und bilden innerhalb eines Tages eine vollständig konfluierende Monoschicht, was durch den hohen transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) von etwa 700 Quadratzentimetern bestätigt wird. Der TEER bleibt drei Tage lang hoch. Die Aktinfärbung zeigt an, dass die apikale Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden zum Lumen hin ausgerichtet ist.Organoide Zellen, die in Kultureinsätzen ausgesät werden, bilden eine konfluierende Einzelschicht von Epithelzellen, wobei die apikale Seite zum oberen Kompartiment hin ausgerichtet ist. Die Okkludinfärbung zeigt das Vorhandensein von Tight Junctions an der apikalen Seite der Epithelzellen in 3D-Organoiden und in Zellmonolagen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Organoide, die zur Aussaat von Zellmonoschichten verwendet werden, klar mit einem leeren Lumen ohne schwarze Ablagerungen erscheinen sollten, die einer Ansammlung toter Zellen entsprechen.Monoschichten aus Darmorganoiden von Schweinen können verwendet werden, um die Auswirkungen von Metaboliten oder Mikroben auf die epitheliale Barrierefunktion zu testen, indem funktionelle Assays, Bildgebung und Genexpressionsanalysen verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Biologie

Wir beschreiben eine Methode zur Etablierung menschlicher Enteroide aus Dünndarmkrypten und Kolonoide aus Dickdarmkrypten, die sowohl aus chirurgischem Gewebe als auch aus Biopsien entnommen wurden. In diesem methodischen Artikel stellen wir die Kulturmodalitäten vor, die für das erfolgreiche Wachstum und die Erhaltung von humanen Enteroiden und Kolonoiden unerlässlich sind.

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen Kultur Enteroid oder Colonoid Monolagen, die intakten Barrierefunktion, Wirt epithelialen Mikrobiota Interaktionen auf die zelluläre und biochemische Ebene zu studieren.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man murine primäre epitheliale Dickdarmmonoschichten direkt aus Darmkrypten erzeugt. Wir bieten experimentelle Ansätze zur Erzeugung konfluenter Monoschichten auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für die Kratzwundeheilung und biochemische Studien sowie spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Enteroide entwickeln sich zu einem neuen Modell für die Untersuchung der Gewebephysiologie und Pathophysiologie, der Arzneimittelentwicklung und der regenerativen Medizin. Hier beschreiben wir ein bovines primäres 2D-enteroides Kultursystem, das eine Co-Kultivierung mit relevanten Gewebezelltypen ermöglicht. Dieses Modell bietet einen translationalen Vorteil für die gastrointestinale Forschungsmodellierung.

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Lernen Sie die Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und die Etablierung von Zellmonoschichten für veterinärmedizinische und biomedizinische Forschung.

Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten

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