Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Proteinbindungspartnern einer bekannten RNA-Sequenz, indem diese mit Hilfe von biotinylierten RNA-Oligonukleotiden aus dem Zellextrakt herausgezogen werden. Im Vergleich zu Methoden, die Detergenzien oder hohe Temperaturen erfordern, um die Proteine von der RNA zu lösen, verwenden diese Protokolle stattdessen sehr milde Bedingungen, die es auch ermöglichen, potenzielle Proteinkomplexe zu erhalten. Das Verfahren wird von Jakob Rupert, einem Doktoranden unter meiner Stelle, demonstriert.

Beginnen Sie mit der gesamten Proteinernte, indem Sie das Medium aus den Vertiefungen der HEK 293T-Zellplatte entfernen und die Vertiefungen der Sechs-Well-Platten mit einem Milliliter PBS waschen. Verwerfen Sie PBS und legen Sie die Platten auf Eis, bevor Sie 200 Mikroliter Lysepuffer in jede Vertiefung geben. Trennen und brechen Sie die Zellen mit einem Zellschaber, bevor Sie den Zellextrakt aus zwei Vertiefungen in dasselbe 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.

Nach 30 Minuten Inkubation auf Eis und Zentrifugation wird der Überstand in ein vorgekühltes Röhrchen überführt. Berechnen Sie als Nächstes das Volumen des Proteinextrakts, das 1,5 Milligramm Proteinen entspricht. Bringen Sie dann alle Proben mit einem Lysepuffer auf ein Endvolumen von 600 Mikrolitern.

Bewahren Sie die Proben bis zur Verwendung auf Eis auf. Um die Perlen vorzubereiten, mischen Sie sie im Vorratspuffer, indem Sie das Röhrchen schnippen. Nachdem Sie die 100 Mikroliter Schlammmedium pro Probe berechnet haben, legen Sie das berechnete Volumen der Aufschlämmung in ein magnetisches Gestell.

Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie die Aufbewahrungslösung und waschen Sie die Perlen, indem Sie einen Milliliter Lysepuffer hinzufügen und ihn manuell invertieren. Entfernen Sie dann den Puffer mit dem Magnetgestell und wiederholen Sie den Waschschritt. Fügen Sie den Kügelchen ein Volumen des Lysepuffers hinzu, das dem ursprünglichen Volumen des Aufschlämmungsmediums entspricht, und mischen Sie es, indem Sie das Röhrchen schnippen, bevor Sie das Medium gleichmäßig in so viele 1,5-Milliliter-Röhrchen wie Proben abgeben.

Entfernen Sie zum Verstopfen der Perle den Puffer mit dem Magnetgestell und fügen Sie 600 Mikroliter 0,25 Milligramm pro Milliliter Hefe-TRNA-Lösung hinzu, die in Lysepuffer hergestellt wurde. Inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad. Entfernen Sie die TRNA-Lösung mit dem Magnetgestell, bevor Sie 600 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen, und waschen Sie sie durch manuelles Mischen.

Wiederholen Sie den Waschschritt und entsorgen Sie den Puffer. Für jedes Röhrchen, das die ersten 100 Mikroliter des Slurry-Mediums enthält, werden 200 Mikrogramm RNA-Oligonukleotid in 600 Mikrolitern Lysepuffer hergestellt. Geben Sie das Oligo zu den Kügelchen und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rotation.

Entfernen Sie die Lösung aus den Kügelchen und waschen Sie sie zweimal mit 600 Mikrolitern Lysepuffer, indem Sie die Röhrchen jeweils fünf Minuten lang bei Raumtemperatur drehen. Verwerfen Sie den Puffer. Für die Proteinbindung an Beads trennen Sie 5 % oder 30 Mikroliter Volumen von der 600-Mikroliter-Proteinlösung und bewahren Sie sie als Input oder IN für die weitere Analyse auf.

Geben Sie die restliche Proteinmischung in jedes Röhrchen mit den beladenen Kügelchen und inkubieren Sie sie mit langsamen Rotationen über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die ungebundene Proteinfraktion mit dem Magnetgestell von den Kügelchen. Sparen Sie 5 % oder 30 Mikroliter seines Volumens und etikettieren Sie es als Durchfluss oder FT. Geben Sie einen Milliliter Waschpuffer 1 auf die Perlen und drehen Sie ihn fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Puffer und wiederholen Sie diesen Waschgang einmal. Geben Sie einen Milliliter Waschpuffer 2 zu den Perlen. Und nachdem Sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator inkubiert haben, entsorgen Sie den Überstand.

Um die spezifischen Bindemittel zu eluieren, fügen Sie den Kügelchen 100 Mikroliter Elutionspuffer 1 hinzu. Nach dem manuellen Mischen durch Schnippen fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Röhrchen in einen Thermomixer geben und fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius kräftig schütteln.

Legen Sie dann das Röhrchen in das Magnetgestell und sammeln Sie die eluierte Fraktion in einem sauberen Röhrchen. Wenn Sie fertig sind, drehen Sie die Perlen schnell mit einer Tischzentrifuge, um die Rückgewinnung des Eluats zu maximieren. Und sparen Sie 5 % oder fünf Mikroliter des gesamten Eluat- oder EL-Volumens für weitere Analysen.

Die eluierten Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert. Die Darstellung der signifikant angereicherten Proteine in einem Vulkandiagramm zeigte, dass der Gesamtproteingehalt und die angereicherten Proteine, die aus RNA eluiert wurden, signifikant höher waren als die von RNA, was darauf hindeutet, dass RNA eine höhere Anzahl spezifischer Interaktionen aufbauen kann. Als Beispiele für die Übereinstimmung zwischen vorhergesagten und erhaltenen Ergebnissen zeigten die Interaktionswerte für Plus-RNA und Minus-RNA mit Proteinen aus dem humanen Proteom, dass HNRNPH3 selektiv an Plus-RNA bindet und PCBP2 spezifisch mit RNA interagiert.

Darüber hinaus wurde vorhergesagt, dass das Protein RBM41 für beide RNA-Oligonukleotide promiskuitiv ist. Die massenspektroskopierische Analyse von Protein-Pull-Down-Assay-Proben bestätigte das Vorhandensein von HNRNPH3 in RNA und PCBP2 in Minus-RNA. Es wurde festgestellt, dass RBM41 mit beiden interagiert.

Western Blot wurde verwendet, um das Vorhandensein von TDP-43 in den Ergebnissen und Protokolloptimierungsschritten nachzuweisen. In der RNA wurde TDP-43 in der Eingangsprobe und im Eluat beobachtet, was auf seine Anwesenheit von Anfang an hinweist. TDP-43 wurde während der Waschschritte von RNA zurückgehalten und am Ende mit einem hohen Salzpuffer eluiert.

Durch die Kartierung von Protein-RNA-Interaktionen kann diese Methode makromolekulare Netzwerke hinter vielen physiologischen Signalwegen aufdecken. Zum Beispiel die Transkriptionsregulation oder pathologische Mechanismen wie Krebs und Neurodegeneration.