Name: Isolierung und Aufreinigung von Pilz-β-Glucan als Immuntherapiestrategie beim Glioblastom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Aufreinigung von Pilz-β-Glucanen zur Immuntherapie gegen Glioblastom. Diese Methode nutzt BV2-Mikrogliazellen und analytische Techniken wie HPLC und FTIR zur Evaluierung immunmodulatorischer Effekte.

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Wir bedanken uns bei Dr. Vasiliki Economopoulos für ihr hauseigenes Skript zur Messung des Fuluoreszenz-Signals in ImageJ. Wir möchten uns auch bei der CITIUS (Universität Sevilla) und ihrem gesamten Personal für die Unterstützung während der Demonstration bedanken. Diese Arbeit wurde vom spanischen FEDER I + D + i-USE, US-1264152 der Universität Sevilla, und dem Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00 unterstützt

Die vier verschiedenen Pilzvarianten, die in diesem Protokoll beschrieben werden, wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Isolierung von pilzlichen β-Glucanen
<ol><li>Extraktion und Isolierung von löslichen Pilzpolysacchariden HINWEIS: Lösliche Pilzpolysaccharide (SMPs) wurden gemäß dem in Abbildung 1 schematisch dargestellten Verfahren erhalten.<ol><li>Spülen Sie frische Fruchtkörper von P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus und G. lucidum (ca. 2.000 g/Pilz) fünfmal vorsichtig in destilliertem Wasser ab.</li>
		<li>Trocknen Sie die Fruchtkörper bei 50 ± 2 °C in einem konventionellen Lufttrockner, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist (~24 h).</li>
		<li>Mahlen Sie die getrockneten Pilze in einer Messermühle und erhalten Sie von jedem Pilz etwa 200 g Pulver.</li>
		<li>100 g Pilzpulver (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus und G. lucidum) in 1.000 mlH2Od suspendieren. Dann 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren und schließlich 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.</li>
		<li>Die resultierende Suspension wird bei 6.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
		<li>Trocknen Sie den Niederschlag mit unlöslichen Pilzpolysacchariden (IMPs) bei 50 ± 2 °C in einem Lufttrocknungsofen für 24 h.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Niederschlag und bewahren Sie den Überstand auf. Konzentrieren Sie den Überstand 10 Mal in einem Rotationsverdampfer.</li>
		<li>Das SMP-haltige Konzentrat mit Ethanol (80 % Endkonzentration) wird über Nacht bei 4 °C ausgefällt.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Ethanolsuspension bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C, halten Sie das Pellet zurück (Niederschlag) und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>Waschen Sie den Niederschlag dreimal mit 80 % Ethanol, bevor Sie ihn in H2Od (10 % w/v) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5/7 und die Temperatur auf 37 °C ein und behandeln Sie mit 2 U bzw. 4 U α-Amylase und Glucoamylase, um α-Glucane gemäß den Anweisungen des Herstellers zu lösen (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Nach der Behandlung mit α-Amylase/Glucoamylase den pH-Wert und die Temperatur auf 8,0 bzw. 50 °C einstellen und mit Alcalase (2,5 E/g Protein) behandeln (siehe Materialtabelle), um die Proteine zu lösen. HINWEIS: Bei dieser sequenziellen enzymatischen Behandlung werden die meisten α-Glucane und Proteine entfernt, die zusammen mit β-Glucanen in der Ethanolfällung ausfallen.</li>
		<li>Nach der Hydrolyse wird das Hydrolysat bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert und der saubere Überstand fünfmal in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Erneut mit 80%igem Ethanol ausfällen.</li>
		<li>Den resultierenden Niederschlag in H2Od auflösen und 24 h lang in destilliertem Wasser dialysieren, wobei Zelluloseschlauchmembranen (12.000Da Cut-off-Membranen; siehe Materialtabelle) verwendet werden, um niedermolekulare Moleküle zu entfernen. Gewinnen Sie den wasserlöslichen Teil zurück und trocknen Sie ihn gefrier, um lösliche β-Glucane (SβGs) herzustellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zucker- und Proteinmessung<ol><li>Messen Sie den Gesamtzuckergehalt jeder Fraktion mit der Phenol-Schwefelsäure-Methode, wobei Glukose als Standard verwendetwird 8. ANMERKUNG: Die Quantifizierung des β-Glucan-Gehalts kann auch mit dem β-Glucan-Assay-Kit (Pilz und Hefe; siehe Materialtabelle) erfolgen, das auf enzymatischer Hydrolyse und der Aktivität von Oxidoreduktasen basiert: nämlich exo-1,3-β-Glucanase, Glucoseoxidase, β-Glucosidase und Peroxidase, mit anschließender Bildung des Chinonimins. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen.</li>
		<li>Verwenden Sie 18 MH 2SO 4 anstelle von 12 MH2SO4.</li>
		<li>Bewerten Sie den Gehalt der Gesamtglucane und der α-Glucane separat.</li>
		<li>Messen Sie die resultierenden β-Glucan-Werte als Differenz zwischen den Gesamt-Glucan- und α-Glucan-Werten (dreifach) nach dem Kjeldahl-Protokoll. In bestimmten Fällen kann der Proteingehalt mit der Lowry-Methode bestimmt werden, wobei Albumin verwendet wird, um die Kalibrierungskurve11,12 aufzuzeichnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der Ultraviolett-Absorptionsspektroskopie<ol><li>Erhalten Sie die ultravioletten (UV) SβG-Spektren mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer (siehe Materialtabelle), indem Sie die Proben im Bereich von 200-400 nm scannen (Abbildung 2).</li>
		<li>Bereiten Sie 1,0 mg/ml jedes SβG inH2Od vor, übertragen Sie die Lösung in eine Quarzküvette und scannen Sie sie bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der Molekulargewichtsverteilung<ol><li>Abschätzung der Homöogenität von SβGs und des Molekulargewichts von Polymeren mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems (HPLC) (siehe Materialtabelle), das mit einem Brechungsindexdetektor und einer linearen Ultra-Hydrogel-Gelfiltrationssäule (300 mm x 7,8 mm; Abbildung 3).</li>
		<li>Führen Sie den Test bei 40 °C mit deionisiertem Wasser als Laufmittel mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min-1 und Dextran (110, 80 und 50 kDa) als Standard durch (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie eine 5-ml-Fraktion.</li>
	</ol></li>
	<li>Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Analyse<ol><li>Nehmen Sie die Infrarotspektren (Abbildung 4) mit einem FTIR-Spektrometer im Bereich von 4000-500 cm-1 auf. Die Proben sollten zuvor mit KBr gemischt werden, um Filme zu bilden (Standard-FTIR-Verfahren; siehe Herstelleranweisung und Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der molekularen Zusammensetzung<ol><li>Schätzung der molekularen Zusammensetzung von SβGs mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) sowie Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS) nach Standardverfahren12.</li>
	</ol></li>
</ol>2. In-vitro-Studie zur β-Glucan-induzierten Mikroglia-Stimulation
<ol><li>Zellkultur von Maus-Glioblastom- und Mikrogliazellen in 8-Well-Kammerobjektträgern HINWEIS: Dieses Protokoll ist spezifisch für GL261 (Glioblastom) und BV2 (Mikroglia) Zelllinien. Mit leichten Modifikationen könnten diese Schritte jedoch möglicherweise zur Untersuchung anderer Krebs- und Immunzelllinien verwendet werden.<ol><li>Bereiten Sie das modifizierte Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco zu, das mit L-Glutamin, 4,5 g/L D-Glukose und ohne Pyruvat modifiziert ist. Fügen Sie 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin hinzu (siehe Materialtabelle). Das Material im Wasserbad bei 37 °C für 15 min vorwärmen.</li>
		<li>Tauen Sie gefrorene BV2- und GL261-Aliquots 2 Minuten lang in einem Wasserbad (37 °C) auf und tragen Sie sie kurz vor dem vollständigen Auftauen in eine Laminar-Flow-Haube und plattieren Sie die Zellen in zwei verschiedene sterile T25-Kolben (einen für jede Zelllinie).</li>
		<li>Inkubieren Sie die T25-Kolben bei 37 °C, 5 % CO2 , bis die Kultur konfluent ist. HINWEIS: Abhängig von den Gefrierbedingungen und der Zeit der Kryokonservierung kann die Zeit bis zum Zusammenfluss variieren. Diese Zelllinien benötigen in der Regel zwischen 3 und 5 Tagen, um die Konfluenz in einem T75-Kolben zu erreichen.</li>
		<li>Nachdem die BV2-Zellkultur konfluiert ist, wird sie in Objektträger mit 8 Wells und 0,6 x 106 Zellen/Well überführt. Bewahren Sie die Objektträger mit 8 Wells 24 Stunden im Inkubator auf.</li>
		<li>Sobald die Mikrogliazellen in die 8-Well-Kammer-Objektträger eingebracht sind, wiederholen Sie das gleiche Protokoll mit den GL261-Zellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Aktivierung von Mikroglia mit β-Glucanen<ol><li>Beschichten Sie die BV2-Zellen 72 h lang mit vier verschiedenen β-Glucanen (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus) in einer Konzentration von 0,2 mg/ml. Eine Versuchsbedingung muss unbehandelt bleiben (normales Medium) und als Kontrollgruppe fungieren.</li>
		<li>Den Überstand nach 72 h mit einer Pipette auffangen und das restliche Volumen durch einen 0,20 μm Spritzenvorsatzfilter leiten. Anschließend wird der Überstand bei -80 °C für mindestens 24 h eingefroren.</li>
	</ol></li>
	<li>Behandlung von GL261 mit voraktiviertem Mikroglia-konditioniertem Medium<ol><li>Sobald der GL261 zu 80 % in den Objektträgern mit 8 Wells zusammenfließt, wird β-Glucan-behandeltes Mikrogliamedium (Schritt 2.2.2) mit einer Endvolumenkonzentration von 25 % für 72 h (Gesamtvolumen: 250 μl/Well) zugegeben.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium nach 72 h Inkubation und entsorgen Sie es.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen dreimal 5 Minuten lang mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4, 0,1 M).</li>
		<li>Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C für 15 min. HINWEIS: Abhängig von den verschiedenen Antikörpern, die für die Immunfluoreszenz verwendet werden können, können die Fixierungsmethoden von der typischen 4%igen PFA abweichen. Fixiermittel auf Alkoholbasis können bei der Erhaltung bestimmter Epitope effizienter sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunfluoreszenz-Studie<ol><li>Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS mit Triton X (PBST; 0,01 %) für 10 Minuten.</li>
		<li>Entfernen Sie das PBST und fügen Sie Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungspuffer 10 % in PBST (Tabelle 1) für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 200 μl PBS pro Vertiefung hinzu, die die primäre Antikörpermischung enthält (1:500 monoklonaler Ki-67-Antikörper der Ratte und 1:500 gespaltener Caspase-3-Antikörper des Kaninchens; siehe Materialtabelle). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
		<li>Nach 24 h Inkubation bei 4 °C lassen Sie die Proben 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Waschen Sie die Vertiefungen dreimal für 10 Minuten mit PBS auf einem Shaker (niedrige Geschwindigkeit).</li>
		<li>Entfernen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 200 μl PBS pro Vertiefung, das die Mischung aus Sekundärantikörpern (1:200 Esel-Anti-Ratten-IgG (H + L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 und 1:200 Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) hoch-kreuzadsorbiertem Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647; siehe Materialtabelle) für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln enthält.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben 10 Minuten lang mit PBS auf einem Mehrzweckschüttler.</li>
		<li>Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 200 μl pro Vertiefung von 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in PBS (1:5,000), für 1 Minute hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie DAPI (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Zellen 5 Minuten lang in PBS.</li>
		<li>Entfernen Sie den Well-Rahmen und geben Sie 50 μl PBS:Glycerin (1:1) auf jede Vertiefung und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Objektträger mit Nagellack.</li>
		<li>Erfassen Sie Bilder mit 20-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskopsystem (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantifizierung und Analyse der Tumorzellproliferation und Apoptose
HINWEIS: Um die potenzielle Wirkung der verschiedenen β-Glucane auf die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen zu messen, wurde ein internes Skript in der ImageJ-Software verwendet, um die Anzahl der positiven Pixel von Ki67 (Proliferation) und cCasp3 (Apoptose)13 zu quantifizieren.
<ol><li>Öffnen Sie ImageJ. Klicken Sie auf die Schaltfläche Plugins . Klicken Sie auf Coloc2, ein Plugin, das zuvor im Plugin-Ordner installiert wurde, und wählen Sie schließlich das zu analysierende Bildaus 11. HINWEIS: Dieses Plugin war nach einem vorherigen Kontakt mit Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca) verfügbar. Anstelle des Skripts verfügen sowohl ImageJ als auch Fiji Software über unterschiedliche Werkzeuge für die Kolokalisierungsanalyse (siehe Materialtabelle) mit ähnlichen Eigenschaften.</li>
	<li>Legen Sie die Schwellenwerte entsprechend den Kontrollbedingungen (unbehandelt, nur DMEM) fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK . HINWEIS: Um Hintergrund- und Intensitätsdiskrepanzen zu vermeiden, müssen alle Bilder unter den gleichen Bedingungen aufgenommen werden. Vorzugsweise sollten Bildgebungssitzungen am selben Tag durchgeführt werden, und die Mikroskopparameter sollten über die Bilder hinweg unverändert bleiben.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die resultierenden Bilder der kolokalisierten Pixel und ein Zusammenfassungsfenster mit dem Prozentsatz oder der Rohanzahl der Pixel über dem Schwellenwert angezeigt werden. Normalisieren Sie die Ergebnisse in Bezug auf die Kontrollbedingungen (unbehandelt). HINWEIS: Alle Daten sind als Mittelwert ± REM angegeben. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle). Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey verwendet. Fehler werden als Standardfehler des Mittelwerts (s.e.m.) dargestellt (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

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</ol>

Es bestehen keine Interessenkonflikte, die deklariert werden müssen.

Diese Arbeit beschreibt die Verwendung etablierter Techniken zur erfolgreichen Isolierung, Reinigung und Charakterisierung des Gehalts an SβGs aus vier verschiedenen Pilzen. Die Ergebnisse zeigten, wie nach der Heißwasserextraktion von SMPs, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus gewonnen wurden, gefolgt von einer hydrolytischen Behandlung mit α-Amylase, Glucosidase und Protease, der Gehalt an α-Glucan und Protein reduziert wurde, wodurch die Menge an reinen SβGs ...

Trotz neuer Errungenschaften auf dem Gebiet der Neuroonkologie ist die Lebenserwartung von Glioblastom-Patienten nach wie vor gering. Goldstandard-Therapien gegen Hirntumore basieren auf der Verschmelzung von Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie. In den letzten zehn Jahren hat sich die Immuntherapie jedoch zu einer wirksamen Strategie zur Behandlung verschiedener Krebsarten entwickelt1. So ist die Möglichkeit, die körpereigene Immunantwort gegen Tumorzellen nutzbar zu machen, in jüngster Zeit zur vierten Säule der Onkologie geworden.
Es ist seit langem bekannt, dass eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet darin besteht, die starke Immunsuppression in der Tumormikroumgebung zu überwinden2. Insbesondere im Fall des Glioblastoms, einer der häufigsten und aggressivsten Formen von Hirntumoren, könnte die Entschlüsselung wichtiger Signalwege, die solche pro-tumoralen Szenarien orchestrieren, und die Suche nach neuen Verbindungen, die der depressiven Reaktion des Immunsystems entgegenwirken könnten, den Weg für zukünftige Therapien gegen diese unheilbare Krankheit ebnen.
Das Gehirn besitzt eigene Zellen des Immunsystems, und der relevanteste Zelltyp sind Mikroglia. Es wurde nachgewiesen, dass diese Zellen ein ziemlich komplexes Verhalten bei verschiedenen zentralen Krankheiten aufweisen3. Bei primären Hirntumoren (z.B. Glioblastom) werden diese Zellen in Richtung eines antiinflammatorischen Phänotyps verschoben, der Tumorzellen bei der Besiedlung des Hirnparenchyms unterstützt3. Zahlreiche Veröffentlichungen belegen die wichtige Rolle dieser Zellen bei der Tumorprogression. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass Gliom-assoziierte Mikroglia und infiltrierte Makrophagen (GAMs) ein Drittel der gesamten Tumormasse ausmachen, was auf den eindeutigen Einfluss ihrer Aktivierungszustände während der Progression von Hirntumoren hindeutet 4,5.
In diesem Sinne wurden pilzliche β-Glucane als starke Moleküle beschrieben, die wirksame Immunreaktionen auslösen, einschließlich Phagozytose und Produktion entzündungsfördernder Faktoren, was zur Eliminierung schädlicher Stoffe führt 6,7,8,9,10. Pilze β-Glucane wurden im Allgemeinen mit Extrakten aus verschiedenen Pilzteilen untersucht. Die Zuordnung spezifischer Wirkungen erfordert jedoch eine Reinigung, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden und den Wirkmechanismus solcher Moleküle als immunmodulatorische Wirkstoffe verstehen zu können8.
In dieser Arbeit werden lösliche β-Glucane aus dem Fruchtkörper von vier verschiedenen Pilzen gereinigt, die regelmäßig als essbare (Pleurotus ostreatus und Pleurotus djamor) und als Heilpilze (Ganoderma lucidum und Hericium erinaceus) verwendet werden. Insbesondere in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie finden diese vier Pilze große Verwendung und wurden im Rahmen einer umweltfreundlichen Kreislaufwirtschaft in einem Gewerbebetrieb hergestellt (siehe Materialtabelle).
Um den Grundstein für den zukünftigen Einsatz von Pilz-β-Glucanen in der Therapie von Hirntumoren zu legen, sind klar definierte Aufreinigungsstrategien und präklinische Studien, die sich mit ihrer mutmaßlichen Interaktion mit Zellen des Immunsystems befassen, unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Anti-Tumor-Mediatoren zu bewerten. Diese Arbeit beschreibt die zahlreichen Schritte der Isolierung und Reinigung, die erforderlich sind, um die löslichen β-Glucane zu gewinnen, die in den Fruchtkörpern des ausgewählten Pilzes enthalten sind. Nach erfolgreicher Reinigung werden die Mikrogliazellen aktiviert, um ihren entzündlichen Phänotyp zu verstärken. Maus-Glioblastomzellen (GL261) werden mit einem anderen Mikroglia-konditionierten Medium beschichtet, das zuvor mit diesen Extrakten behandelt wurde, und dann wird seine Wirkung auf das Verhalten der Tumorzellen untersucht. Interessanterweise haben Pilotstudien aus unserem Labor (Daten nicht gezeigt) aufgedeckt, wie entzündungsfördernde Mikroglia die Migration von Tumorzellen und die Invasionseigenschaften nicht nur in Glioblastomzellen, sondern auch in anderen Krebszelllinien verlangsamen können. Diese multidisziplinäre Arbeit könnte ein nützliches Werkzeug für Onkologieforscher sein, um vielversprechende Wirkstoffe zu testen, die in der Lage sind, die Immunantwort bei vielen verschiedenen Tumorarten zu verstärken.

<table><tbody><tr><td>8-Well-Objektträger</td><td>Thermo Fisher, USA</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Lufttrockenschrank</td><td>J.P. Selecta S.A., Spanien</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Dänemark</td><td>Protease</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, USA</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Messermühle</td><td>Retsch, Deutschland</td><td>&nbsp; SM100</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>MERK, Deutschland</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Zelluloseschlauchmembran</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>MERK, Deutschland</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Kolokalisations-Pluggins</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Deutschland</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Dänemark</td><td>Dextran 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s modifizierter Eagle&acute; s Medium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha;- Amylase/Glucoamylase)</td><td>Novozyme, Dänemark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>FT-IR-Spektrometer</td><td>Bruker-Vertex, Schweiz</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Grafik- und Analysesoftware</td><td>GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4HPLC-System</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>Waters 2695 HPLC-Inkubator</td><td></td></tr><tr><td>Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometer</td><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>MERK, Deutschland</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Crison, Barcelona, Spanien</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen gespaltene Caspase-3 (Asp175) Antikörper</td><td>Abcam, Großbritannien</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Ki-67 Monoklonaler</td><td>Thermofisher, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>B&uuml; chi Ib&eacute; rica S.L.U., Spanien</td><td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Hydrogel lineare Gel-Filtrationssäule (300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, USA</td><td>WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>UV-sichtbares Spektralphotometer</td><td>Amersham Bioscience, UK</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, USA</td><td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>J.P. Selecta S.A., Spanien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 7 DUO Konfokales Mikroskopsystem.</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glucan Assay Kit</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irland</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glucane</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Geliefert wurden die vier Varianten von Pilzen</td></tr></tbody></table>

isolierung und aufreinigung von pilz-β-glucan als immuntherapiestrategie beim glioblastom

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung wirksamer Therapien gegen das Glioblastom ist die Überwindung der starken Immunsuppression in der Tumormikroumgebung. Die Immuntherapie hat sich als wirksame Strategie herausgestellt, um die Reaktion des Immunsystems gegen Tumorzellen zu richten. Gliom-assoziierte Makrophagen und Mikroglia (GAMs) sind wichtige Treiber solcher entzündungshemmenden Szenarien. Daher könnte die Verstärkung des antikanzerösen Ansprechens bei GAMs eine potenzielle co-adjuvante Therapie zur Behandlung von Glioblastom-Patienten darstellen. In diesem Sinne sind pilzliche β-Glucan-Moleküle seit langem als starke Immunmodulatoren bekannt. Ihre Fähigkeit, die angeborene Immunaktivität zu stimulieren und das Ansprechen auf die Behandlung zu verbessern, wurde beschrieben. Diese modulierenden Eigenschaften werden zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, an Mustererkennungsrezeptoren zu binden, die interessanterweise in GAMs stark exprimiert werden. Daher konzentriert sich diese Arbeit auf die Isolierung, Reinigung und anschließende Verwendung von pilzlichen β-Glucanen zur Verbesserung der tumoriziden Reaktion von Mikroglia gegen Glioblastomzellen. Die Maus-Zelllinien Glioblastom (GL261) und Mikroglia (BV-2) werden verwendet, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen zu testen, die aus Pilzen extrahiert werden, die in der aktuellen biopharmazeutischen Industrie stark verwendet werden: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum. Um diese Verbindungen zu testen, wurden Co-Stimulations-Assays durchgeführt, um die Wirkung eines voraktivierten Mikroglia-konditionierten Mediums auf die Proliferation und Apoptose-Aktivierung in Glioblastomzellen zu messen.

Erfolgreiche Aufreinigung von β-Glucanen Die Masse an MP, SMPs und SβGs, die aus den Fruchtkörpern von P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus nach dem Extraktions- und Reinigungsprozess gewonnen werden, ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die grundlegende Zusammensetzung (Gesamtkohlenhydrate, β-Glucane und Protein) von MP, SMPs und SβGs, die aus den Pilzen gewonnen werden, ist in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse z...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reinigungsschritte und anschließenden Studien von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen als potentielle immunmodulatorische Moleküle, die die antitumoralen Eigenschaften von Mikroglia gegen Glioblastomzellen verbessern.

Isolierung und Aufreinigung von Pilz-β-Glucan als Immuntherapiestrategie beim Glioblastom

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Beta-Glucane von Pilzen sind wichtige Modulatoren des Immunsystems. Die Verbesserung der Reinheits- und Isolationsprotokolle ist unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Co-Adjuvantien für die Krebstherapie zu behaupten. Ein hoher Gehalt an vier verschiedenen Beta-Glucanen wurde mit verschiedenen Geräten erreicht, die üblicherweise in molekularbiologischen und proteomischen Labors zu finden sind.Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Prüfung der Wirkung von Beta-Glucanen auf Mikroglia, die am häufigsten vorkommende Immunzelle des Gehirns. Die Modulation des Mikroglia-Phänotyps im Glioblastom kann wichtige Erkenntnisse liefern. Beginnen Sie mit der Extraktion von löslichen Pilzpolysacchariden oder SMPs, indem Sie frische Fruchtkörper von Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum fünfmal mit destilliertem Wasser abspülen.Trocknen Sie dann die gewaschenen Fruchtkörper etwa 24 Stunden lang bei 50 Grad Celsius in einem herkömmlichen Lufttrockner vollständig ab, bevor Sie sie in einer Messermühle mahlen, um von jedem Pilz etwa 200 Gramm Pulver zu erhalten. Als nächstes suspendieren Sie 100 Gramm aller vier Pilzpulver oder MP in 1.000 Milliliter destilliertem Wasser und autoklavieren die Suspension bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird die entstandene Suspension bei 6.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Anschließend trocknen Sie den Niederschlag mit unlöslichen Pilzpolysacchariden oder IMPs bei 50 Grad Celsius für 24 Stunden an der Luft. Verwerfen Sie den Niederschlag und konzentrieren Sie den Überstand 10 Mal in einem Rotationsverdampfer. Als nächstes wird das SMP-haltige Konzentrat über Nacht bei vier Grad Celsius mit Ethanol ausgefällt.Nachdem Sie die Ethanolsuspension bei 6.000 G 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Pellet dreimal mit 80%igem Ethanol, bevor Sie es und destilliertes Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 bis 7 und die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein und lösen Sie die Alpha-Glucane, indem Sie die Suspension mit zwei Einheiten bzw. vier Einheiten Alpha-Amylase bzw. Glucoamylase behandeln. Als nächstes stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 und die Temperatur auf 50 Grad Celsius ein und lösen die Proteine, indem Sie die Suspension mit Alkalase behandeln, die 2,5 Einheiten pro Gramm Protein entspricht.Nach der Hydrolyse wird das Hydrolysat zentrifugiert und das überstehende Konzentrat fünfmal in einem Rotationsverdampfer gereinigt. Das überstehende Konzentrat durch Zugabe von 80%igem Ethanol erneut ausfällen. Um niedermolekulare Moleküle zu entfernen, lösen Sie den Niederschlag in destilliertem Wasser und dialysieren Sie ihn 24 Stunden lang im destillierten Wasser mit 12.000 Dalton-Cutoff-Zelluloseschlauchmembranen.Gewinnen Sie den wasserlöslichen Teil zurück und trocknen Sie ihn gefrier, um lösliche Beta-Glucane oder S beta-Gs herzustellen. Bewerten Sie die Gesamtglucane und Alpha-Glucane separat. Messen Sie die resultierenden Beta-Glucan-Werte als Differenz zwischen den Gesamt-Glucan- und Alpha-Glucan-Werten.Um die S beta-G UV-Spektren mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer zu erhalten, bereiten Sie 1,0 Milligramm pro Milliliter jedes S beta-G in destilliertem Wasser vor. Übertragen Sie die Probe in eine Quarzküvette und scannen Sie sie bei Raumtemperatur im Bereich von 200 bis 400 Nanometern. Schätzen Sie die Homogenität von S beta-Gs und das Molekulargewicht von Polymeren mittels Größenausschlusschromatographie oder SEC unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographie- oder HPLC-Systems, das mit einem UV-sichtbaren Detektor und einer Superdex TM 200 10/300 GL Gelfiltrationssäule ausgestattet ist.Zeichnen Sie die Infrarotspektren der Probe mit einem Infrarot- oder FTIR-Spektrometer mit Fourier-Transformation im Bereich von 4.000 bis 500 Prozent auf. Aktivieren Sie die Mikroglia, indem Sie die BV2-Mikrogliazellen 72 Stunden lang mit einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter von vier verschiedenen Beta-Glucanen beschichten, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus isoliert wurden. Nach 72 Stunden wird der Überstand mit einer Pipette aufgefangen und das verbleibende Volumen durch einen 0,20-Mikrometer-Spritzenfilter geleitet.Anschließend frieren Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden ein. Um GL 261 mit dem voraktivierten mikrogliakonditionierten Medium zu behandeln, werden 250 Mikroliter mit Beta-Glucan behandeltes Mikrogliamedium für 72 Stunden zu 80 % konfluierenden GL 261-Zellen hinzugefügt. Entsorgen Sie das Medium nach 72 Stunden.Die UV-Spektren der verschiedenen S-beta-Gs zeigten keine UV-Absorptionsspitzen bei 260 und 280 Nanometern, was darauf hindeutet, dass S-beta-Gs Nukleinsäuren und Proteine fehlten. Die HPLC-Chromatogramme zeigten eine gute Homogenität mit einem scharfen und einzelnen Hauptpeak bei 10,9 Minuten für P. ostreatus, 10,5 Minuten für Lucidum, 11,3 Minuten für P. djamor und 8,20 Minuten für H. erinaceus, was darauf hindeutet, dass die Fraktion mit Homopolymeren übereinstimmt. Die FTIR-Spektren maßen die molekularen Schwingungen, die kovalenten Polysaccharidbindungen entsprechen.Es zeigte sich, dass SS beta-Gs aus Kohlenhydraten bestand, die mit einem minimalen Protein konjugiert waren. HPTLC und GC-MS, die das Monosaccharidprofil von S beta-Gs analysierten, zeigten das Vorhandensein einer großen Menge an D-Glucose, kleineren Mengen an D-Galactose und D-Mannose sowie einer Spur von D-Xylose, D-Rhamnose, D-Fucose und L-Arabinose. Mit Hilfe eines hauseigenen Skripts in der ImageJ-Software wurde die Anzahl der positiven Pixel für jeden Fluoreszenzkanal quantifiziert.Das Skript verwendete Kontrollproben als Schwellenwert für die Intensität jedes Fluorophors und gab die Anzahl der Pixel an. Es gab die Expression für jeden Marker nach verschiedenen experimentellen Bedingungen an. Interessanterweise zeigte GL 261 keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die Tumorproliferation unter Exposition bei den verschiedenen Mikroglia-konditionierten Medien.P. djamor und H. erinaceus zeigten jedoch eine starke Induktion eines etwa sechsfachen bzw. neunfachen Anstiegs der gespaltenen Caspase-3. Die Gewährleistung einer hochgradigen Reinheit der Beta-Glucane ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll verwendet fortschrittliche Geräte wie Spektralphotometer und HPLC.oder FITR. Die Verwendung dieser Tools erhöht die Robustheit unserer Ergebnisse. Wir können die Wirkung von Beta-Glucanen auf Mikroglia sicher analysieren und zuverlässigere Ergebnisse erzielen.Aus zeitlichen und weltweiten Gründen haben wir unser Protokoll auf die Untersuchung von Beta-Glucanen auf Mikrogliazellen beschränkt. Andere Zellen des Immunsystems wie Makrophagen oder T-Zellen können jedoch problemlos während dieses Protokolls sein. Zum ersten Mal kombinieren diese Protokolle zwei unterschiedliche Wissensgebiete.Zum einen der Einsatz biotechnologischer Verfahren zur Reinigung bestimmter Produkte und zum anderen der Einsatz von Zellkulturtechniken zur Prüfung ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt, Protokoll der Isolierung und Expansion von Stammzellen, wie Zellen, die aus operativ entfernt menschlichen Glioblastom mutliforme (GBM) Tumorgewebe mit dem Neurosphäre Assay Kultur-Methode.

Isolation und Expansion der menschlichen Glioblastoma multiforme Tumorzellen unter Verwendung der Neurosphäre Assay

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay, bei dem β-Glucane verwendet werden, um Mikrogliazellen für die Produktion von Superoxidradikalen, einer reaktiven Sauerstoffspezies, zu aktivieren. In Hirntumorzellen unterdrücken die erzeugten reaktiven Oxidantien aktiv die Proliferation von Tumorzellen und induzieren den Zelltod.

Ein Assay zur Analyse von Test-β-Glucan als Immuntherapiestrategie gegen Hirntumorzellen

Das Video zeigt die Isolierung von tumorinfiltrierenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus einem Mäusegehirn durch mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung. Daran schließt sich eine Dichtegradientenzentrifugation an, um die Immunzellen für die weitere Analyse zu sammeln.

Isolierung tumorinfiltrierender Immunzellen aus einem Gehirn von Mäusen

Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Um das bösartige Verhalten von Krebs zu verstehen, müssen genaue Modelle erstellt werden, wie Tumorzellen mit Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z.B. Makrophagen, interagieren. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur Untersuchung der Interaktion von Glioblastomzellen mit tumorassoziierten Makrophagen und Mikroglia, bei denen die Wirkung auf die Glioblastominvasion bewertet wird.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Tumor-Suche nach therapeutischen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) vielversprechend zur Behandlung von invasiven Glioblastom. Optimale Transplantation umfasst Lieferung von MSCs in den Tumor Resektion Hohlraum auf Gerüsten. Hierbei sind präklinische Techniken, MSC Behandlung des Glioblastoms zu studieren vorgesehen, einschließlich: bildgebende Tumor Resektion; Implantation von MSC ausgesät Gerüste; und postoperative Therapie verfolgen.

Bildgestützte Resektion der Glioblastom und intrakraniellen Implantation von therapeutischen Stammzellen entkernt Gerüste

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Neurosphären als 3D Kulturen angebaut sind ein mächtiges Werkzeug um Gliom Biologie zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Immunohistochemistry durchführen unter Beibehaltung der 3D-Struktur von Gliom Neurospheres durch Paraffin einbetten. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Gliom Neurosphäre Eigenschaften wie Stemness und neuronale Differenzierung.

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Erfahren Sie die Isolierung und Aufreinigung von Pilz-β-Glucanen zur Immuntherapie gegen Glioblastom. Diese Methode nutzt BV2-Mikrogliazellen und analytische Techniken wie HPLC und FTIR zur Evaluierung immunmodulatorischer Effekte.

Isolierung und Aufreinigung von Pilz-β-Glucan als Immuntherapiestrategie beim Glioblastom

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