Name: Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Erfahren Sie hochauflösende Calcium-Bildgebung in Neuronen von Caenorhabditis elegans unter physiologischen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in subzelluläre Calcium-Dynamik und neuronale Funktion.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt (R01- NS115947 verliehen an F. Hoerndli). Wir bedanken uns auch bei Dr. Attila Stetak für das pAS1-Plasmid.

1. Erzeugung transgener Stämme
<ol><li>Klonieren Sie Expressionsvektoren unter Verwendung einer Klonierungsmethode Ihrer Wahl8,9 so, dass sie den Pflp-18- oder Prig-3-Promotor (für AVA-spezifisches Signal im ventralen Nervenstrang) enthalten, gefolgt vom Ca2+-Indikator der Wahl und dann einer 3'-UTR (siehe Diskussion für weitere Informationen)10. Eine Liste der Plasmide und ihrer Quellen finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1.</li>
	<li>Befolgen Sie das etablierte Protokoll für die Erzeugung transgener Stämme durch Mikroinjektion einer DNA-Mischung (<100 ng/μl; siehe ergänzende Tabelle 1 für die Konzentrationen der einzelnen Plasmide), die das Ca2+-Indikatortransgen (~20 ng/μl) und die Rettungs-DNA lin-15+ (Selektionsmarker) enthält, in die Keimdrüse eines 1 Tag alten erwachsenen C. elegans10 (Genotyp: LIN-15(N765TS); Phänotyp: Multi-Vulva)10,11. ANMERKUNG. Die lin-15(n765ts)- Eltern sollten bei 15 °C gehalten werden, um die temperaturempfindliche Mutation zu unterdrücken.</li>
	<li>Halten Sie die injizierten Eltern bei 20 °C, bis die F1-Nachkommen das Erwachsenenalter erreichen, um eine transgene Selektion unter Ausnutzung des Fehlens des Multivulva-Phänotyps zu ermöglichen.</li>
	<li>Klonale Passage13 adulter F1-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp aufweisen, da dies auf die Expression des extrachromosomalen Arrays hinweist, das den Ca2+ -Indikator11 enthält.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Expression des Ca2+ -Indikators bei den F2- oder F3-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp aufweisen, indem Sie 1 Tag alte erwachsene Tiere wie weiter unten in Abschnitt 3 beschrieben montieren und bildgeben. ANMERKUNG. Eine relativ hohe Ausprägung des Indikators ist für die schnelle Aufnahme von Bildern erforderlich, wie hier beschrieben (siehe die Diskussion für weitere Details).</li>
	<li>Durchführung von Experimenten an nachfolgenden Generationen der transgenen Stämme mit einer optimalen Expression des Ca 2+-Indikators (siehe Diskussion für weitere Details) und Beibehaltung der Stämme unter Standardbedingungen (20 °C auf NGM-Platten)12.</li>
</ol>2. Optischer Aufbau
<ol><li>Verwenden Sie ein Mikroskop, das Langzeitaufnahmen im Zeitraffer ermöglicht. ANMERKUNG. Die repräsentativen Daten wurden mit einem konfokalen inversen Spinning-Disk-Mikroskop aufgenommen, das mit 488 nm und 561 nm Anregungslasern ausgestattet ist.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 10x/0,40) für die grobe Lokalisierung des Wurms.</li>
	<li>Um eine subzelluläre Auflösung zu erreichen, schalten Sie auf die Neuronen um und lokalisieren Sie sie mit einem Objektiv mit hoher Vergrößerung. ANMERKUNG. Ein 100x/1,40 NA Ölobjektiv wurde verwendet, um die repräsentativen Daten in dieser Studie zu erfassen.</li>
	<li>Nehmen Sie die Bilder mit einer hochempfindlichen Kamera auf, die eine schnelle Bildaufnahme (>50 fps) ermöglicht.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Standard-Emissionsfilter für den Ca2+ -Indikator Ihrer Wahl (d. h. einen 525-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter für GCaMP6f und mitoGCaMP).</li>
	<li>Fügen Sie einen Z-Drift-Korrektor (ZDC) für die Aufnahme von Bildströmen hinzu, die länger als 10 s sind, da die Austrocknung des Agar-Pads während der Bildgebungssitzung dazu führt, dass der Neurit innerhalb weniger Sekunden unscharf driftet. ANMERKUNG. Wenn ein Mikroskopie-Setup keine ZDC zulässt oder wenn lange Bildgebungszeiten (>20 Minuten) gewünscht werden, tragen Sie einen Rand aus Silikonfett oder geschmolzener Vaseline um das Agar-Pad auf, um die Austrocknung zu verlangsamen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Würmer für die Bildgebung
<ol><li>Vorbereiten der Agar-Pads<ol><li>Stellen Sie 3 ml 10%iges Agar her, indem Sie molekularen Agar in M912 in einem 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchen auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen (siehe Materialtabelle). ANMERKUNG. Geschmolzener Agar kann bis zu 1 Stunde auf einem Heizblock aufbewahrt oder jedes Mal frisch zubereitet werden, wenn Agarpads benötigt werden.</li>
		<li>Legen Sie einen Objektträger zwischen zwei zusätzliche Objektträger, die jeweils zwei Lagen Laborklebeband aufweisen (siehe Abbildung 1A-i).</li>
		<li>Schneiden Sie die Spitze einer 1.000-μl-Pipettenspitze (ohne Filter) ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf das mittlere Deckglas (Abbildung 1A-i).</li>
		<li>Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken (Abbildung 1A-ii).</li>
		<li>Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchens in eine kleine Scheibe (Abbildung 1A-iii) und entfernen Sie dann den umgebenden Agar.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbereitung der Schneckenwalzlösung<ol><li>Lösen Sie Muscimol-Pulver in M9 auf, um eine 30-mM-Brühe zu erhalten. In 50-μl-Aliquots trennen und bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Alle 3-5 Tage ein neues Aliquot von 30 mM Muscimol auftauen (und während der Anwendung bei 20 °C lagern).</li>
		<li>Verdünnen Sie eine 30 mM Muscimol-Brühe im Verhältnis 1:1 mit Styroporperlen, um die Walzlösung herzustellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Positionieren eines Wurms für die Bildgebung<ol><li>Geben Sie 1,6 μl der Rollenlösung auf die Mitte des Agarpads. Anmerkungen: Die Flüssigkeitsmenge sollte für die Aufnahme jüngerer (weniger) oder älterer Tiere (mehr) angepasst werden.</li>
		<li>Übertragen Sie mit dem bevorzugten Wurmstich (d. h. einem Glas- oder Platindrahtpickel)13 einen Wurm des gewünschten Alters ohne den Multivulva-Phänotyp11 in die rollende Lösung auf dem Agarkissen (Abbildung 1A-iv). ANMERKUNG. Die repräsentativen Daten stammen von 1 Tag alten Hermaphroditen (GCaMP6f-Stamm = FJH185; mitoGCaMP-Stamm; FJH597; siehe Ergänzende Tabelle 1), die durch das Vorhandensein von nur einer Reihe von Eiern identifiziert werden kann. Weitere Informationen zur Arbeit mit Würmern unterschiedlichen Alters finden Sie in der Diskussion.</li>
		<li>Warten Sie ~5 Minuten, bis das Muscimol die Wurmbewegung reduziert hat, und lassen Sie dann ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas auf das Agar-Pad fallen, wodurch die Bewegung des Wurms physisch eingeschränkt wird.</li>
		<li>Um Neuriten im ventralen Nervenstrang abzubilden, rollen Sie den Wurm durch leichtes Schieben des Deckglases in die in Abbildung 1B,C gezeigte Ausrichtung. ANMERKUNG. Um den ventralen Nervenstrang zu visualisieren, positionieren Sie den Wurm mit dem Kopf nach oben und rollen Sie den Wurm, bis sich der Darm auf der rechten Seite des proximalen Abschnitts und auf der linken Seite des distalen Teils des Wurms befindet (aus der Perspektive des Betrachters). Kehren Sie diese Orientierung um (Abbildung 1C), um Neuriten im dorsalen Nervenstrang abzubilden.</li>
	</ol></li>
	<li>Den Wurm auf ein Mikroskop montieren<ol><li>Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas, bevor Sie es auf den Mikroskoptisch montieren.</li>
		<li>Finden Sie den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (10x) im Hellfeld.</li>
		<li>Wechseln Sie zum 100x-Objektiv und passen Sie den Fokus an.</li>
		<li>Lokalisieren Sie den AVA-Neuriten mit der Beleuchtung des GCaMP oder mitoGCaMP mit dem 488-nm-Bildgebungslaser. Anmerkungen: Verwenden Sie kleine Anpassungen, um zu verhindern, dass der Wurm gequetscht oder das Deckglas abgezogen wird.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Aufnahme von hochauflösenden Bildströmen
<ol><li>Im lebenden Organismus GCaMP-Bildgebung<ol><li>Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 ms ein.</li>
		<li>Passen Sie den Bildgebungslaser und die Aufnahmeeinstellungen an, bis die basale GCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich des Dynamikbereichs der Kameraliegt 14. In der Diskussion finden Sie Vorschläge zur Optimierung der Bildgebungsparameter mit anderen Mikroskopie-Setups. ANMERKUNG. Stellen Sie für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 50 % und Dämpfung = 1. Ändern Sie die zusätzlichen Erfassungseinstellungen wie folgt: EM-Verstärkung = 200 und Vorverstärkerverstärkung = 1.</li>
		<li>Nachdem der AVA-Neurit mit der GCaMP-Fluoreszenz bei 100-facher Vergrößerung lokalisiert wurde, stellen Sie den ZDC (siehe Materialtabelle) auf einen Bereich von ±30 μm ein und starten Sie den kontinuierlichen Autofokus. Korrigieren Sie die Fokusebene vor der Bildgebung nach Bedarf manuell.</li>
		<li>Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung. Mit dem in dieser Studie verwendeten Aufbau können Dauern von bis zu 10 Minuten erreicht werden.</li>
	</ol></li>
	<li> In-vivo-mitoGCaMP-Bildgebung<ol><li>Befolgen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.2 nach Bedarf, um die basale mitoGCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich für den Dynamikbereichder Kamera zu erfassen 14. ANMERKUNG. Stellen Sie für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 20 % und Dämpfung = 10. Ändern Sie die Erfassungseinstellungen wie folgt: EM-Verstärkung = 100 und Vorverstärkerverstärkung = 2.</li>
		<li>Nachdem die Mitochondrien im AVA-Neuriten mit Hilfe der mitoGCaMP-Fluoreszenz lokalisiert wurden, stellen Sie den ZDC wie oben in Schritt 3.3 beschrieben ein.</li>
		<li>Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse des Bildstroms
<ol><li>Öffnen Sie den Bildstrom in einer geeigneten Bildsoftware, um die Pixelwerte in einer Bildserie zu analysieren (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Definieren Sie mit dem Werkzeug Polygonauswahl die subzelluläre Region of Interest (ROI), die GCaMP oder mitoGCaMP enthält.</li>
	<li>Klicken Sie auf Analyze > Tools > ROI Manager. Klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen und dann auf Mehr > Multi-Kennzahl. Klicken Sie im Fenster "Multi Measure" auf "OK ", um automatisch die durchschnittliche, minimale und maximale Pixelintensität des oben definierten ROI für jedes Bild des Bildstreams zur weiteren Analyse zu erfassen. ANMERKUNG. Es wird empfohlen, die durchschnittliche Pixelintensität (Favg) für jede ROI auf die minimale Intensität (F min) zu normalisieren, wobei das Verhältnis Favg/Fmin verwendet wird, um Fluoreszenzunterschiede aufgrund der Positionierung in der z-Ebene zu berücksichtigen. Verwerfen Sie die Bildströme mit Wurmbewegung während der Bildgebung, da dies auch die Fluoreszenzmessungen beeinflussen würde.</li>
</ol>

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<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+aging+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200(2012).</li>
<li>Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+aging%3A+Learning+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14(2013).</li>
<li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li>
<li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die erste Überlegung bei der Implementierung der beschriebenen Methode betrifft die Auswahl eines Ca2+ Indikators mit idealen Eigenschaften für die gegebene Forschungsfrage. Zytoplasmatische Ca 2+-Indikatoren haben typischerweise eine hohe Affinität zu Ca 2+, und die Sensitivität dieser Indikatoren gegenüber Ca 2+ steht in umgekehrtem Verhältnis zur Kinetik (Ein-/Ausschaltrate)16,17. Dies bedeutet, dass entweder die Emp...

Calcium-Ionen (Ca2+) sind in vielen Zelltypen sehr vielseitige Informationsträger. In Neuronen ist Ca2+ für die aktivitätsabhängige Freisetzung von Neurotransmittern, die Regulierung der Zytoskelettmotilität, die Feinabstimmung von Stoffwechselprozessen sowie viele andere Mechanismen verantwortlich, die für eine ordnungsgemäße Aufrechterhaltung und Funktion der Nervenzellen erforderlich sind 1,2. Um eine effektive intrazelluläre Signalübertragung zu gewährleisten, müssen Neuronen einen niedrigen basalen Ca2+-Spiegel in ihrem Zytoplasmaaufrechterhalten 3. Dies wird durch kooperative Ca 2+-Handhabungsmechanismen erreicht, einschließlich der Aufnahme von Ca2+ in Organellen wie das Endoplasmatische Retikulum (ER) und Mitochondrien. Diese Prozesse, zusätzlich zur Anordnung von Ca 2+-permeablen Ionenkanälen in der Plasmamembran, führen zu heterogenen Konzentrationen von zytoplasmatischem Ca2+ im gesamten Neuron.
Die Ca 2+-Heterogenität während der Ruhephase und der neuronalen Aktivierung ermöglicht die vielfältige, ortsspezifische Regulation von Ca2+-abhängigen Mechanismen1. Ein Beispiel für die konzentrationsspezifischen Effekte von Ca 2+ ist die Freisetzung von Ca2+ aus dem ER durch Inositol-1,4,5-trisphosphat (InsP3)-Rezeptoren. NiedrigeCa2+-Spiegel in Kombination mit InsP3 sind für die Öffnung der kalziumdurchlässigen Pore des Rezeptors erforderlich. Alternativ hemmen hoheCa2+-Spiegel sowohl direkt als auch indirekt den Rezeptor4. Die Bedeutung der Ca 2+-Homöostase für die ordnungsgemäße neuronale Funktion wird durch Hinweise gestützt, die darauf hindeuten, dass eine gestörte intrazelluläre Ca2+-Handhabung und -Signalübertragung ein früher Schritt in der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen und des natürlichen Alterns ist 5,6. Insbesondere die abnorme Aufnahme und Freisetzung von Ca2+ durch das ER und die Mitochondrien wird mit dem Auftreten neuronaler Dysfunktion bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit in Verbindung gebracht 6,7.
Die Untersuchung der Ca 2+ Dyshomöostase während des natürlichen Alterns oder der Neurodegeneration erfordert die longitudinale Beobachtung der Ca2+ Spiegel mit subzellulärer Auflösung in einem lebenden, intakten Organismus, in dem die native zelluläre Architektur (d.h. die Anordnung der Synapsen und die Verteilung der Ionenkanäle) erhalten bleibt. Zu diesem Zweck bietet dieses Protokoll eine Anleitung für den Einsatz von zwei leicht verfügbaren, genetisch kodierten Ca 2+ Sensoren zur Erfassung der Ca2+ Dynamik in vivo mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Die repräsentativen Ergebnisse, die mit der beschriebenen Methode in C. elegans gewonnen wurden, zeigen, wie die Expression von Ca 2+-Indikatoren im Zytoplasma oder in der mitochondrialen Matrix einzelner Neuronen die schnelle Aufnahme von Fluoreszenzbildern (bis zu 50 Hz) ermöglichen kann, die die Ca 2+-Dynamik veranschaulichen, mit der zusätzlichen Fähigkeit, die Ca 2+-Spiegel innerhalb einzelner stachelähnlicher Strukturen und einzelner Mitochondrien zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>100x/1.40 Öl-Ziel&nbsp; &nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; UPlanSApo</td></tr><tr><td>10x/0.40 Zielsetzung</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; UPlanSApo</td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm Deckglas&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>48366-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose SFR&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>J234-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strahlhomogenisator</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>Borealis rüstet auf CSU-X1</td></tr><tr><td>CleanBench Labortisch</td> auf<td>TMC&nbsp;</td><td></td><td>Mit Vibrationsdämpfung</td></tr><tr><td>Einweg-Kulturröhrchen</td><td>VWR&nbsp;</td><td>47729-572</td><td>&nbsp; 13 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Klimakammer</td><td>Thermo Scientific</td><td>3940</td><td>Set auf 20 > C</td></tr><tr><td>Filterrad oder Schieber</td><td>ASI</td><td></td><td>Für Filter mit 25 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>FJH 185</td><td>Caenorhabditis Genetics Center&nbsp;</td><td>FJH 185</td><td>Wurmstamm</td></tr><tr><td>FJH 597</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>FJH 597</td><td>Wurmstamm</td></tr><tr><td>GFP Bandpass-Emissionsfilter&nbsp;</td><td>Chroma&nbsp;</td><td></td><td>525 &plusmn; 50 nm&nbsp;( 25 mm Durchmesser)</td></tr><tr><td>ILE Laser Combiner&nbsp;</td><td>Andor Technologies&nbsp;</td><td></td><td>4 Laserlinien&nbsp;</td></tr><tr><td>ILE Festkörperlaser 488 nm</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>50 mW</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Version 1.52a</td></tr><tr><td>IX83 Konfokalmikroskop mit Spinning-Disk&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>Mit Yokogawa CSU-X1 Spinning Disc</td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD-Kamera&nbsp;</td><td>Andor Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl mit geringer Autofluoreszenz&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Z-81226</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;</td><td>Molekulare Bauelemente&nbsp;</td><td></td><td>Version 7.10.1&nbsp;</td></tr><tr><td>Steuerbox für Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX3-CBH</td></tr><tr><td>Muscimol&nbsp;</td><td>MP Biomedical&nbsp;/ Sigma</td><td>02195336-CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pAS1</td><td>AddGene</td><td>194970</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pBSKS</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCT61</td><td></td><td></td><td>Plasmid auf Anfrage im Hoerndli/Maricq Labor erhältlich</td></tr><tr><td>pJM23</td><td></td><td></td><td>Plasmid im Hoerndli/Maricq Labor auf Anfrage</td></tr><tr><td>erhältlich pKK1&nbsp;</td><td>AddGene&nbsp;</td><td>194969</td><td></td></tr> Plasmid-Polybead-Mikrosphären<tr><td>&nbsp;</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>00876-15</td><td>&nbsp; 0,094 &Mikro; m</td></tr><tr><td>Stabilitätskammer</td><td>Norlake Scientific</td><td>NSRI241WSW/8H</td><td>Auf 15 &/Grad eingestellt; C</td></tr><tr><td>Tischregler</td><td>ASI</td><td></td><td>Mit Filterradsteuerung</td></tr><tr><td>Standard Objektträger</td><td>Premiere</td><td>9108W-E</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Touchpanel-Controller</td><td>Olympus</td><td></td><td>I3-TPC</td></tr><tr><td>Z-Drift-Korrektor</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>IX3-ZDC2</td></tr></tbody></table>

subzelluläre bildgebung des neuronalen calcium-handlings in vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Die Bildgebung von Kalzium (Ca 2+) wurde bisher weitgehend zur Untersuchung der neuronalen Aktivität eingesetzt, aber es wird immer deutlicher, dass die subzelluläre Ca2+-Handhabung eine entscheidende Komponente der intrazellulären Signalübertragung ist. Die Visualisierung der subzellulären Ca2+-Dynamik in vivo, bei der Neuronen in ihren nativen, intakten Schaltkreisen untersucht werden können, hat sich in komplexen Nervensystemen als technisch anspruchsvoll erwiesen. Die Transparenz und das relativ einfache Nervensystem des Fadenwurms Caenorhabditis elegans ermöglichen die zellspezifische Expression und in vivo Visualisierung von fluoreszierenden Tags und Indikatoren. Darunter befinden sich Fluoreszenzindikatoren, die für den Einsatz im Zytoplasma modifiziert wurden, sowie verschiedene subzelluläre Kompartimente, wie z.B. die Mitochondrien. Dieses Protokoll ermöglicht eine nicht-ratiometrische Ca 2+ Bildgebung in vivo mit einer subzellulären Auflösung, die die Analyse der Ca2+ Dynamik bis auf die Ebene einzelner dendritischer Dornen und Mitochondrien ermöglicht. In dieser Arbeit werden zwei genetisch kodierte Indikatoren mit unterschiedlichen Ca 2+-Affinitäten verwendet, um die Verwendung dieses Protokolls zur Messung relativer Ca2+-Spiegel innerhalb des Zytoplasmas oder der mitochondrialen Matrix in einem einzigen Paar exzitatorischer Interneuronen (AVA) zu demonstrieren. Zusammen mit den genetischen Manipulationen und Längsschnittbeobachtungen, die in C. elegans möglich sind, könnte dieses Bildgebungsprotokoll nützlich sein, um Fragen zu beantworten, wie der Umgang mit Ca2+ die neuronale Funktion und Plastizität reguliert.

Diese beiden Protokolle ermöglichen die schnelle Erfassung von differentiellen Ca2+-Spiegeln innerhalb der subzellulären Regionen und Organellen einzelner Neuriten in vivo mit hoher räumlicher Auflösung. Das erste Protokoll ermöglicht die Messung von zytoplasmatischem Ca2+ mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Dies wird hier anhand der zellspezifischen Expression von GCaMP6f in den glutamatergen AVA-Befehlsinterneuronen15 demonstriert, deren Neuriten sich üb...

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Diese Technik kann verwendet werden, um unser Verständnis des Umgangs mit Kalzium in Neuronen zu verbessern und zu verstehen, wie kompartimentiertes Kalzium verschiedene Mechanismen regulieren kann, die für die neuronale Funktion in vivo wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnellere In-vivo-Bildgebung mit höherer Auflösung unter physiologischen Bedingungen in C. elegans ermöglicht, die mit anderen fluoreszierenden Werkzeugen kombiniert werden kann. Diese Technik könnte Einblicke in den Mechanismus geben, der die Kalzium-Signalübertragung in Neuronen in vielen verschiedenen Kontexten reguliert.Zum Beispiel während des Alterns, neuronaler Verletzungen und Neurodegeneration. Dieses Verfahren demonstriert Ennis Deihl, Forschungstechniker. Kaz Knight, eine Doktorandin, und Rachel Doser, eine Postdoktorandin aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Klonierung von Expressionsvektoren, die einen Promotor enthalten, gefolgt von einem Kalziumindikator und drei primären UTRs Ihrer Wahl. Erzeugung transgener C. elegans-Stämme durch Mikroinjektion einer DNA-Mischung, die die Rettungs-DNA Lin-15 plus im Kalziumindikator-Transgen enthält, in die Keimdrüse eines einen Tag alten erwachsenen C. elegans. Halten Sie die injizierten Elternwürmer bei 20 Grad Celsius, bis die F1-Nachkommen das Erwachsenenalter erreichen.Wählen Sie transgene Erwachsene aus, indem Sie auf das Fehlen des Multivulva-Phänotyps screenen. Dies deutet auf die Expression des extrachromosomalen Arrays hin, das den Kalziumindikator enthält. Klonale Passage adulter F1-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp haben.Durchführung von Experimenten an nachfolgenden Generationen der transgenen Stämme mit optimaler Expression des Calcium-Indikators. Verwenden Sie ein Mikroskop, das Langzeitaufnahmen im Zeitraffer ermöglicht. Lokalisieren Sie den Wurm unter einem Objektiv mit geringer Vergrößerung und wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit hoher Vergrößerung, um die Neuronen zu lokalisieren.Nehmen Sie die Bilder mit einer hochempfindlichen Kamera auf, die eine schnelle Bildaufnahme mit mehr als 50 Bildern pro Sekunde ermöglicht. Verwenden Sie als Nächstes einen Standard-Emissionsfilter für den Kalziumindikator. Fügen Sie einen Z-Drift-Korrektor für die Aufnahme von Bildströmen hinzu, die länger als 10 Sekunden sind.Bereiten Sie in einem 13 x 100 Millimeter großen Glaskulturröhrchen drei Milliliter 10%iges Agar vor, indem Sie molekularen Agar in M9 auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen. Um die Agar-Pads herzustellen, bereiten Sie zunächst zwei Objektträger vor, indem Sie zwei Schichten Laborklebeband hinzufügen. Legen Sie dann einen Objektträger zwischen die beiden Objektträger.Schneiden Sie die Spitze einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf die Mitte des Deckglases. Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken. Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 10-Milliliter-Röhrchens in eine kleine Scheibe und entfernen Sie dann den umgebenden Agar.Als nächstes bereiten Sie die Schneckenwalzlösung vor, indem Sie Muscimol-Pulver in M9 auflösen, um einen 30-Millimol-Bestand zu erzeugen. Verdünnen Sie das Material im Verhältnis eins zu eins mit Styroporperlen, um die Walzlösung herzustellen. Um den Wurm für die Bildgebung zu positionieren, geben Sie zunächst 1,6 Mikroliter der Rolllösung auf die Mitte des Agarpads.Übertragen Sie dann mit einem bevorzugten Schneckenpickel eine Schnecke des gewünschten Alters in die Rolllösung auf dem Agarpad. Warten Sie etwa fünf Minuten, bis das Muscimol die Bewegung des Wurms reduziert hat, und legen Sie dann ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas auf das Agar-Pad. Für die Bildgebung von Neuriten im ventralen Nervenstrang rollen Sie den Wurm durch leichtes Schieben des Deckglases.Um die Schnecke auf dem Mikroskop zu montieren, geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas. Finden Sie den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Hellfeld. Wechseln Sie dann zum 100x-Objektiv und lokalisieren Sie den AVA-Neuriten mit der Beleuchtung des GCaMP oder mito GCaMP mit dem 488-Nanometer-Bildgebungslaser.Passen Sie für die In-vivo-GCaMP-Bildgebung den Bildgebungslaser in den Aufnahmeeinstellungen an, bis die Basilikum-GCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich des Dynamikbereichs der Kamera liegt, und stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 Millisekunden ein. Nachdem der AVA-Neurit mit der GCaMP-Fluoreszenz bei 100-facher Vergrößerung lokalisiert wurde, stellen Sie den Z-Drift-Korrektor ein und starten Sie den kontinuierlichen Autofokus. Korrigieren Sie die Fokusebene vor der Bildgebung nach Bedarf manuell.Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung. Mit Hilfe dieses Protokolls wurde zytoplasmatisches Kalzium mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gemessen. Die zellspezifische Expression von GCaMP6F in den glutamatergen Interneuronen des AVA-Kommandos zeigte eine gerichtete Ausbreitung des Calciumeinstroms.Die subzelluläre Quantifizierung der GCaMP6F-Fluoreszenz zeigte, dass der Beginn des Kalziumeinstroms in einem nur 10 Mikrometer entfernten Teil des Neuriten verzögert war. Auch dendritische wirbelsäulenartige Strukturen, die entlang des AVA-Neuriten gefunden wurden, zeigten Blitze in der GCaMP6F-Fluoreszenz, die unabhängig von der Neuritenaktivierung auftraten und nicht zu einer Ausbreitung des Kalziumeinstroms führten. Weiterhin wurden die relativen Calciumspiegel in den einzelnen Mitochondrien in einzelnen Neuriten mit Hilfe eines Wurmstammes mit einer AVA-spezifischen Expression des mitochondrialen Matrix-lokalisierten Calciumindikators mito GCaMP gemessen.Die Ergebnisse zeigten die synchrone Aufnahme einer relativ großen Menge Kalzium in eine Untergruppe von Mitochondrien. Insbesondere war die Kalziumaufnahme in einige Mitochondrien synchronisiert, während benachbarte Mitochondrien kein Kalzium aufzunehmen schienen. In ähnlicher Weise zeigten Untergruppen von Mitochondrien eine schnelle Aufnahme und Freisetzung kleiner Mengen an Kalzium.Dies schien auch synchron zu sein, aber nur für eine Untergruppe von Mitochondrien. Schnelligkeit und feine Manipulationen sind unerlässlich, um Tiere zu positionieren und die neuronale Funktion zu erhalten. Auch die Tiergesundheit steht an erster Stelle.Schon ein wenig Hunger ist problematisch. Am schwierigsten zu erlernen ist die schnelle Orientierung der Tiere für die konfokale Mikroskopie ohne Schäden. Mein Rat ist viel Übung und eine gute Kontrolle.Dieses Protokoll könnte auf Experimente angewendet werden, bei denen Kalzium von anderen subzellulären Stellen in Neuronen, anderen Neuronen oder anderen Zellen als Neuronen in C. elegans freigesetzt wird. Da dieser Ansatz bei C. elegans die Tiere intakt lässt, ist es möglich, Fragen zur Regulation des subzellulären Kalziumhandlings in vivo in einzelnen Neuronen eines kompletten Nervensystems zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können.

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

Quelle: Doser, R., et al. Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Kalziumumgangs in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt in vivo die Bildgebung des subzellulären Kalziumflusses in den ventralen Nervenstrangneuronen von transgenen Caenorhabditis elegans-Stämmen. Es werden zwei unterschiedliche Kalziumindikatoren verwendet: ein zytoplasmatischer Indikator in einem Stamm und ein mitochondrialer Indikator in einem anderen. Neuronen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um...

Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Die Zellkalziumbildgebung ist eine vielseitige Methodik zur Untersuchung der dynamischen Signalgebung einzelner Zellen, an gemischten Populationen in Kultur oder sogar an erwachten Tieren, basierend auf der Expression von kalziumdurchlässigen Kanälen / Rezeptoren, die einzigartige funktionelle Signaturen ergeben.

Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Erfahren Sie hochauflösende Calcium-Bildgebung in Neuronen von Caenorhabditis elegans unter physiologischen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in subzelluläre Calcium-Dynamik und neuronale Funktion.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

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