Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven
15. September 2023
Dieser Bericht stellt ein neues Probenvorbereitungsverfahren zur Visualisierung neuromuskulärer Verbindungen in Drosophila-Larven dar. Diese Methode ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer bei der Verhinderung des Einrollens der Proben und eignet sich besonders für die Ultrastrukturanalyse der neuromuskulären Verbindung von Drosophila .
Die diffuse Verteilung und die eingeschränkte Sichtweite des TEM stellen Herausforderungen für die Infrastrukturanalyse dar. Dieses Protokoll stellt eine innovative und effiziente Probenvorbereitungsmethode dar, die den herkömmlichen Ansatz übertrifft. Diese fortschrittliche Methode der TEM-Probenvorbereitung ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer, um das Kräuseln der Proben zu verhindern, indem sie die Proben während der anschließenden Dehydratisierung flach bleiben lässt.
Die Auswahl der Reagenzien und die Anpassung der Dosierung müssen je nach Probentyp erforderlich sein. Es gibt viele giftige chemische Reagenzien, die bei der Probenvorbereitung verwendet werden. Sheng Qingyuan, ein Meisterschüler aus dem Labor von Dr. Gan Guangming, wird das Verfahren vorführen.
Zu Beginn sezieren Sie die wandernden Drosophila-Larven im späten dritten Stadium in Januar-Lösung und erhalten Sie die gesamte Körperwand gemäß den Standardverfahren. Fixieren Sie die Körperwand der Larve mit dem Fixiermittel in der Präparierkammer über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag wird die Larvenkörperwand aus der Sezierkammer in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und mehrmals mit Natriumcacodylatpuffer gespült.
Fixieren Sie die Körperwand der Larve zwei Stunden lang in 1%Osmiumtetroxid. Waschen Sie die Proben nach der Fixierung mehrmals mit destilliertem Wasser. Geben Sie 2% gesättigte Urinalacetatlösung in das Röhrchen, um die neuromuskuläre PHI-Verbindung zu färben.
Spülen Sie die Proben nach zwei Stunden mit entionisiertem Wasser ab. Schneiden Sie anschließend mit einer Schere zwei runde Stücke Metallgitter mit einer Porengröße von 270 Mikrometern ab. Lege das Metallgitter an den Boden einer Flasche mit flachem Boden.
Legen Sie dann die fixierten Larven auf das Netz und platzieren Sie anschließend ein weiteres Netz. Dehydrieren Sie die Proben in einer ansteigenden Ethanolkonzentration für jeweils 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend spülen Sie die Proben zweimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Propylenoxid aus.
Legen Sie anschließend die Proben in eine Propylenoxid- und Epoxidharzlösung, gefolgt von reinem Epoxidharz für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Schneiden Sie zum Einbetten eine Polyethylenfolie in ein großes Quadrat und eine kleine, hohle rechteckige Stütze. Klebe das kleine Quadrat mit dem großen Quadrat zusammen.
Geben Sie ausreichend Epoxidharz in die Mitte des großen Quadrats. Schalten Sie dann das Stereoskop ein und legen Sie die Proben mit der Muskelseite nach oben in das vorpositionierte Epoxidharz. Geben Sie einige Tropfen Epoxidharz auf die Proben und bedecken Sie sie mit Polyethylenfolie.
Legen Sie die Proben für die Polymerisation jeweils 24 Stunden lang bei steigenden Temperaturen. Entfernen Sie nach der Polymerisation mit einer scharfen Klinge die überschüssigen Teile des Larvenkörpers, während Sie ein Trapez behalten, einschließlich des A2- und A3-Segments. Entfernen Sie das Trapez von der verbleibenden Körperwand der Larve und befestigen Sie es mit AB-Kleber an der mit Harz gefüllten Kapsel.
Bestätigen Sie unter einem Lichtmikroskop die Position des sechsten und siebten Muskels des A2- und A3-Segments, wobei Sie die Tangentialebene parallel zum sechsten Muskel beibehalten. Schneiden Sie dann ein Fünftel der Probe entlang der beiden Seiten des A3-Segments ab. Bereiten Sie mit einem Mikrotom einen ultradünnen Schnitt der Probe vor, beginnend mit dem sechsten Muskel.
Befestigen Sie nach dem Schneiden so viele Scheiben wie möglich an jedem Kupfernetz. Verwenden Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, um die Proben zu beobachten. Neben dem Lowicryl K4M-Harz und dem Epoxidharz lieferte das Lowicryl K4M-Harz schärfere und leichter beobachtbare Ergebnisse der Drosophila-Körpermuskulatur.
Die konfokale Bildgebung zeigte eine verbesserte Visualisierung der neuromuskulären Verbindung zwischen dem sechsten und siebten Muskel. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte kügelchenartige neuromuskuläre Verbindungen, die eine verbesserte synaptische Strukturinformation bieten. Die Proben blieben während des gesamten Dehydratisierungsprozesses aufgrund der Einschränkung der Metallgewebe flach.
Außerdem wurden die Proben zwischen den Kunststoffprodukten polymerisiert, wodurch ein Falten der Proben verhindert wurde. In Zukunft kann die Methode der TEM-Probenvorbereitung auf Neuropil des Gehirns und des ventralen Nervenstrangs angewendet werden, wodurch das Potenzial der Ultrastrukturforschung verbessert wird.
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Überblick
Dieser Bericht stellt ein neuartiges Verfahren zur Probenvorbereitung zur Visualisierung von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven vor und verbessert die ultrastrukturelle Analyse. Die Methode verhindert effektiv das Krümmen von Proben im Vergleich zu herkömmlichen Techniken und zeigt ihre Nützlichkeit für detaillierte Beobachtungen von Strukturen der neuromuskulären Verbindungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologische Bildgebung
- Ultrastrukturelle Analyse
Hintergrund
- Die Visualisierung von neuromuskulären Verbindungen stellt aufgrund des Krümmens von Proben eine Herausforderung dar.
- Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wird häufig verwendet, kann aber den visuellen Bereich einschränken.
- Innovative Methoden sind erforderlich, um die Probenstabilität und die Analysequalität zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Probenvorbereitungsmethode, die die Probenintegrität bewahrt.
- Verbesserung der Visualisierung von Drosophila-neuromuskulären Verbindungen.
- Bereitstellung eines Protokolls für die ultrastrukturelle Analyse, das auf andere Arten von Nervengeweben anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Nutzung der Transmissionselektronenmikroskopie für die Bildgebung.
- Fokussierung auf die neuromuskuläre Verbindung von Drosophila-Larven als biologisches Modell.
- Einbeziehung spezifischer Schritte wie Fixierung, Färbung, Dehydrierung und Einbettung.
- Verwendung von Metallgittern zur Verhinderung des Krümmens von Proben während der Dehydrierung.
Hauptergebnisse
- Die neue Methode ermöglichte es, Proben während der Vorbereitung und Polymerisation flach zu halten.
- Nutzung der konfokalen Bildgebung zur Verbesserung der Visualisierung von neuromuskulären Verbindungen.
- Die Ergebnisse zeigten eine verbesserte Sichtbarkeit der synaptischen Struktur im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Probenvorbereitung für die Analyse von neuromuskulären Verbindungen dar.
- Die Methodik ermöglicht eine bessere Beobachtung von Nervenstrukturen mit potenziellen Anwendungen in anderen Bereichen der neurobiologischen Forschung.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis von synaptischen Strukturen und funktionellen Analysen in Drosophila-Modellen bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Robust ultrastructural analysis of neuromuscular junctions in Drosophila larvae is critical for early-stage neuroscience target validation and mechanistic de-risking. This optimized TEM sample preparation method enhances morphological fidelity and quantitative imaging, supporting predictive confidence in synaptic biology workflows. Improved sample integrity directly impacts the reliability of downstream discovery and translational research decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution interrogation of synaptic architecture for mechanistic pathway clarification.
- Reduces sample distortion, supporting functional target validation in neuromuscular models.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage in neurobiology programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, flat biological samples for reproducible imaging workflows.
- Supports quantitative assessment of synapse abundance and morphology for assay standardization.
- Enables reliable comparison of compound effects on neuromuscular junction structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ultrastructural findings with disease-relevant synaptic biomarkers in preclinical models.
- Provides continuity from discovery imaging to translational validation of neural targets.
- De-risks advancement decisions by ensuring morphological endpoints are robust and reproducible.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and preclinical imaging, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Maintains sample flatness for accurate ultrastructural hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables precise measurement of synaptic features, supporting statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical biomarker validation in neuromuscular systems.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, scalable protocol adaptable to other neural tissues and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic biology.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neurobiological assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by ensuring robust morphological endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in TEM sample handling and neuromuscular dissection.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of reagent selection and dosage adjustments.
- Adaptable to other neural tissues with consideration of tissue-specific preparation needs.
- Involves handling of toxic reagents, requiring strict adherence to safety protocols.
