Name: Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Erfahren Sie effizientes PAM-loses Baseneditieren mit zSpRY-ABE8e in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht präzise Krankheitsmodellierung für Einzelnukleotid-Varianten und unterstützt die Erforschung genetischer Erkrankungen.

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Wir danken Barbara Garbers, PhD, von Liwen Bianji (Edanz) für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das Key-Area Research and Development Program der Provinz Guangdong (2019B030335001), das National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), die National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) und das Research Fund Program des Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05) unterstützt.

Diese Studie wurde unter strikter Einhaltung der Richtlinien des Care and Use Committee der South China Normal University durchgeführt.
1. Herstellung synthetisch modifizierter gRNA und zSpRY-ABE8e mRNA
<ol><li>Design der gRNA nach früheren Veröffentlichungen37,38.<ol><li>Wählen Sie vorzugsweise NRN als PAM-Sequenz aus, da zSpRY-ABE8e eine höhere Präferenz für NRN-PAM als NYN-PAM zeigt (wobei R A oder G und Y C oder T ist)18. Stellen Sie sicher, dass sich das Adenin-Zielnukleotid im hochaktiven Editierfenster befindet (drittes bis neuntes Nukleotid entlang des Protospacers).</li>
	</ol></li>
	<li>Bestellen Sie EasyEdit sgRNA (EE gRNA), modifiziert mit 2′-O-methyl-3′-phosphorothioat (MS) an beiden Enden (Abbildung 1). HINWEIS: Die EE-gRNA sollte in RNase-freiem Wasser gelöst und bei −80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Linearisieren Sie das zSpRY-ABE8e-Plasmid18.<ol><li>Linearisieren Sie 6 μg des Plasmids mit dem XbaI-Enzym (Table of Materials) in einem Metallbad bei 37 °C für 3 h.</li>
		<li>Reinigen Sie das linearisierte Plasmid mit dem DNA-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol></li>
	<li>Transkribieren Sie die mRNA mit dem In-vitro-Transkriptionskit (Materialtabelle).<ol><li>Transkribieren Sie die zSpRY-ABE8e mRNA mit dem linearisierten Plasmid als Template gemäß den Herstellerangaben. HINWEIS: Alle Operationen, bei denen mRNA und gRNA verwendet werden, erfordern die Verwendung von RNase-freiem Laborbedarf.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie das RNA-Aufreinigungskit (Materialtabelle), um die mRNA gemäß den Anweisungen des Herstellers aufzureinigen. Anmerkungen: Vor der Elution muss das Ethanol getrocknet werden, um eine Zytotoxizität zu vermeiden, und die mRNA sollte bei −80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort verwendet wird.</li>
</ol>2. Herstellung von Mikroinjektionsglaskapillaren
<ol><li>Richten Sie das Mikropipettenziehersystem ein und heizen Sie es mindestens 30 Minuten lang vor.</li>
	<li>Führen Sie einen Rampentest durch, um den Heizwert zu bestimmen, der zum Schmelzen der Borosilikatglaskapillaren (mit 1 mm Außendurchmesser und 0,58 mm Innendurchmesser) gemäß den Anweisungen des Herstellers erforderlich ist.</li>
	<li>Wählen Sie ein Programm aus und klicken Sie auf die Zahl auf der Tastatur, um die Parameterwerte einzugeben. Stellen Sie die folgenden Parameter ein, um die Glaskapillaren zu ziehen: Wärme = Rampentestwert, Zug = 50, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 50 und Druck = 30.</li>
	<li>Installieren Sie das Kapillarrohr und stellen Sie sicher, dass es sich in der Nut befindet. Drücken Sie PULL START/STOP, um das Programm auszuführen.</li>
	<li>Bewahren Sie die gezogenen Kapillaren auf, indem Sie sie in Schaumstoff einführen, der Lücken enthält, und halten Sie die Nadel in der Schwebe.</li>
</ol>3. Mikroinjektion der mRNA- und EE-gRNA-Mischung zSpRY-ABE8e in Zebrafischembryonen
<ol><li>Stellen Sie in der Nacht vor der Injektion Aufzuchtbecken. Setzen Sie eine Trennwand ein, legen Sie zwei weibliche und einen männlichen Zebrafisch des AB-Stammes (3-18 Monate alt) in jedes Aquarium und decken Sie es mit dem Deckel ab. Siehe frühere Veröffentlichungen für geschlechtsspezifische Unterscheidungen39. HINWEIS: Um mehr Embryonen zu erhalten, wählen Sie Fische aus, die seit mindestens 1 Woche nicht mehr gebrütet haben.</li>
	<li>Am nächsten Morgen vor der Injektion die zSpRY-ABE8e mRNA und EE gRNA auf Eis auftauen. Mischen Sie die mRNA und die gRNA bis zu Endkonzentrationen von 400 ng/μl bzw. 200 ng/μl.<ol><li>Führen Sie die gesamte Prozedur auf Eis mit RNase-freien Spitzen und Röhrchen durch und fassen Sie sie mit Handschuhen an.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfigurieren Sie den pneumatischen Mikroinjektor. Schließen Sie das Partialdruckventil der Luftpumpe und öffnen Sie zuerst das Hauptventil, schrauben Sie die Gasflasche ab und stellen Sie den Druck des Partialdruckventils auf 0,2 MPa/29 psi ein.<ol><li>Schalten Sie den pneumatischen Mikroinjektor ein, stellen Sie den Modus auf TIMER ein und stellen Sie den Druckwert des Anfangsparameters auf 20,0 psi und den TIMER-Wert auf 0,040 s ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Nadeln der gezogenen Glaskapillaren unter einem Stereomikroskop vorsichtig zu brechen, und achten Sie darauf, dass die Nadeln schräg geschnitten sind, um das Durchstechen des Chorions und des Eies zu erleichtern. Anmerkungen: Die Bruchstelle der Nadel muss an der richtigen Stelle sein und stark genug sein, um das Ei zu durchstechen, aber dünn genug, um Schäden am Ei zu minimieren.</li>
	<li>Geben Sie das Gemisch aus zSpRY-ABE8e mRNA und gRNA mit einer Microloader-Pipettenspitze an die Spitze einer Glaskapillare, um Blasen in der Kapillare zu vermeiden. Befestigen Sie die Nadel am Mikromanipulator und konfigurieren Sie den Druck und den TIMER-Wert des Injektors, um sicherzustellen, dass 2 nL Gemisch pro Injektion mit einer Mikrokappe erzeugt werden.</li>
	<li>Trennen Sie die Trennwände der Aufzuchtbecken und lassen Sie die Fische 10-15 Minuten lang brüten. Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb und untersuchen Sie das Zellstadium und die Qualität der Eier unter einem Stereomikroskop. Wählen Sie die Eizellen im Einzelzellzustand für die Injektion aus, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern.</li>
	<li>Die Eier werden auf einer Injektionsplatte mit 1,5 % Agarose ausgekleidet und 2 ml der Mischung unter einem Mikroskop in die Zelle und nicht in das Eigelb der Embryonen injiziert, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern. Behalten Sie mindestens 15 Eier als Kontrollgruppe.</li>
	<li>Verwenden Sie 1x E3-Puffer, um die Eier in Petrischalen zu sammeln, und legen Sie sie in einen Inkubator bei 28 °C. Entfernen Sie die toten Eizellen und wechseln Sie den Kulturpuffer alle 12 Stunden bis 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf).</li>
</ol>4. Effizienzanalyse des Base Editing mit EditR
<ol><li>Bei 48 hpf werden drei Pools mit sechs zufällig ausgewählten injizierten Embryonen bzw. sechs zufällig ausgewählten Kontrollembryonen in PCR-Röhrchen gesammelt. Verwenden Sie eine Pipette, um den verbleibenden E3-Puffer abzusaugen.</li>
	<li>Geben Sie 40 μL 50 mM NaOH in die PCR-Röhrchen. Die Röhrchen werden für 20 min in ein Metallbad bei 95 °C gelegt und dann 15 s lang gewirbelt.</li>
	<li>Fügen Sie 4 μL 1 M Tris· hinzu HCl (pH 8,0) in jedes Röhrchen, um das NaOH zu neutralisieren. Kurz bei 2.000 x g für 10 s bei Raumtemperatur zentrifugieren, um Tröpfchen von der Röhrchenwand zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand in neuen PCR-Röhrchen und lagern Sie diese bei −20 °C.</li>
	<li>Entwerfen Sie geeignete Primer stromaufwärts und stromabwärts der gRNA-Zielstellen. Verwenden Sie 1 μL des obigen Überstands als Vorlage für die PCR-Reaktionen mit einem Volumen von 50 μL. Die in dieser Studie für die PCR verwendeten Primer sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.</li>
	<li>Führen Sie eine DNA-Agarose-Gelelektrophorese durch, um korrekte und spezifische Banden sicherzustellen, gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung, wie zuvor beschrieben40.</li>
	<li>Analysieren Sie die Sanger-Sequenzierungsdaten mit dem Programm EditR (1.0.10)41.<ol><li>Laden Sie die Sequenzierungsdatei (ab1-Format) in das Feld ".ab1-Datei hochladen" hoch.</li>
		<li>Geben Sie die 20 bp gRNA-Sequenz in 5′-3′-Ausrichtung in das Feld "gRNA-Sequenz eingeben" ein.</li>
		<li>Öffnen Sie die Sequenzierungsdatei (ab1-Format) und bestätigen Sie die Basispositionen, an denen die 20 bp gRNA-Sequenz beginnt und endet. Geben Sie die entsprechende Basisposition in die Felder "5′ Start" und "3′ Ende" ein.</li>
		<li>Klicken Sie auf Predicted Editing , um die Effizienz der Basisbearbeitung zu erhalten. Überprüfen Sie die Qualität der Sequenzierungsdaten in der Nähe der gRNA-Zielsequenz, um ungeordnete Peaks oder Indels zu vermeiden. HINWEIS: Im Allgemeinen können die ungeordneten Peaks durch Einstellen der PCR-Annealing-Temperatur effektiv entfernt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
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<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
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<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Zebrafisch-Krankheitsmodells mit Hilfe des Basiseditors zSpRY-ABE8e. Im Vergleich zum herkömmlichen HDR-Pfad für die Basensubstitution kann dieses Protokoll eine effizientere Basisbearbeitung erreichen und das Auftreten von Indels reduzieren. Gleichzeitig beinhaltet dieses Protokoll die Umsetzung der kürzlich vorgeschlagenen i-Silence-Gen-Knockout-Strategie im Zebrafisch. Zusammenfassend wird zSpRY-ABE8e die Anwendung von Zebrafischmodellen in der Krankheitsforschung ver...

Einzelnukleotidvarianten (SNVs), die Missense- oder Nonsense-Mutationen verursachen, sind die häufigste Quelle für Mutationen im menschlichen Genom1. Um festzustellen, ob eine bestimmte SNV pathogen ist, und um ihre Pathogenese aufzuklären, sind präzise Tiermodelle erforderlich2. Zebrafische sind gute menschliche Krankheitsmodelle, die ein hohes Maß an physiologischer und genetischer Homologie mit dem Menschen, einen kurzen Entwicklungszyklus und eine starke Fortpflanzungsfähigkeit aufweisen, was für die Erforschung pathogener Eigenschaften und Mechanismen sowie für das Screening von Medikamenten von Vorteil ist3.
Das CRISPR/Cas9-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde in großem Umfang in der Genom-Editierung verschiedener Arten, einschließlich Zebrafisch4, eingesetzt. Mit gRNA-Führung kann das CRISPR/Cas9-System DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) an der Zielstelle erzeugen, die dann eine Einzelbasensubstitution durch Rekombination der Zielstelle mit Spender-DNA-Vorlagen über den Homologie-gerichteten Reparaturweg (HDR) ermöglichen. Die Effizienz dieser Basenersatzmethode ist jedoch recht gering, da der zelluläre DNA-Reparaturprozess hauptsächlich über den nicht-homologen End-Joining-Signalweg (NHEJ) durchgeführt wird, der in der Regel von Insertions- und Deletionsmutationen (Indel-Mutationen) begleitet wird5. Glücklicherweise entschärft die CRISPR/Cas9-basierte Single-Base-Editing-Technologie dieses Problem erheblich, indem sie Basis-Editoren verwendet, die eine effizientere Single-Base-Bearbeitung ermöglichen, ohne DSBs zu induzieren. Zwei Hauptklassen von Baseneditoren, Adenin-Basen-Editoren (ABEs) und Cytosin-Basen-Editoren (CBEs), wurden entwickelt, um die Basensubstitutions-Editierung für A· T bis G· C und C·G bis T· A bzw. 6,7,8,9,10,11. Diese vier Arten von Basensubstitutionen decken 30 % der humanpathogenen Variantenab 12. Es wurde berichtet, dass beide Klassen von Basiseditoren, einschließlich PmCDA1, BE-System, CBE4max, ABE7.10 und ABE8e, in Zebrafischen funktionieren, wobei BE4max und ABE8e insbesondere eine hohe Bearbeitungsaktivität erreichen 13,14,15,16,17,18,19.
Cas9-Proteine aus verschiedenen Spezies, darunter Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und S. canis, wurden in die Genom-Editierung von Zebrafischen implementiert, wobei das Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) am häufigsten verwendet wurde20,21,22,23. SpCas9 kann jedoch nur Zielstellen mit einem NGG-Protospacer-Nachbarmotiv (PAM) erkennen, was seinen editierbaren Bereich einschränkt und dazu führen kann, dass keine geeignete Sequenz in der Nähe des pathogenen Ortes gefunden wird24. Um den Zielbereich zu erweitern, wurde eine Vielzahl von SpCas9-Varianten entwickelt, um verschiedene PAMs durch gerichtete Evolution und strukturgeführtes Design zu erkennen. Allerdings sind nur wenige Varianten bei Tieren wirksam, insbesondere bei Zebrafischen, was die Anwendung von Zebrafischen in der SNV-bezogenen Krankheitsforschung einschränkt25,26,27,28. Kürzlich wurde berichtet, dass zwei Varianten von SpCas9, SpG und SpRY, mit weniger strengen PAM-Einschränkungen (NGN für SpG und NNN für SpRY mit einer höheren Präferenz für NRN als NYN), eine hohe Editieraktivität in menschlichen Zellen und Pflanzen aufweisen 29,30,31,32. In der Folge wurde berichtet, dass SpG und SpRY sowie eine Reihe ihrer vermittelten Basiseditoren, wie z. B. SpRY-vermittelte CBEs und SpRY-vermittelte ABEs, auch im Zebrafisch funktionieren, was die Anwendung von Zebrafischmodellen in der mechanistischen Untersuchung und dem Arzneimittelscreening von SNV-bedingten Krankheiten verbessern wird 18,33,34,35. Darüber hinaus wurde i-Silence als effektive und genaue Gen-Knockout-Strategie durch ABE-vermittelte Start-Codon-Konversion von ATG zu GTG oder ACG36 vorgeschlagen. Die Kombination aus der i-Silence-Strategie und dem SpRY-vermittelten Basiseditor zSpRY-ABE8e stellt eine neue Methode zur Krankheitsmodellierungdar 18. Dieses Protokoll demonstriert, wie Genom-Editierung mit zSpRY-ABE8e im Zebrafisch durchgeführt werden kann, um ein tsr2 (M1V)-Modell unter Verwendung der i-Silence-Strategie zu konstruieren. Die Editiereffizienz und die Phänotypen, die in Zebrafischmodellen auftreten, wurden bewertet und analysiert.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1,5 % Agarose zur Herstellung einer Injektionsplatte</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillaren&nbsp;</td><td>Harvard Apparatur</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step Klonierungskit</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>Kit für Infusionsklon</td></tr><tr><td>Codon-Optimierungsservice</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>Länge:32 mm, Kapazität:0,5 &mu; L</td></tr><tr><td>EasyEdit gRNA-Service</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Feines wissenschaftliches Instrument</td><td>11254-20</td><td>Wird zum Aufbrechen von Meedle</td></tr> verwendet <tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller&nbsp;</td><td>Stotterinstrument</td><td>P-97</td><td>Wird verwendet, um die Glaskapillaren zu ziehen</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>Wird für die PCR-Reaktion</td></tr><tr><td>verwendet Intelligente künstliche Klimabox</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>Wird verwendet, um Zebrafischembryonen zu kultivieren</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>Wird verwendet, um Zebrafische beim Fotografieren von</td></tr><tr><td>Microloader-Pipettenspitzen zu fixieren. nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE Bausatz&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II Fast Mutagenese Kit V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>Kit für ortsgerichtete Mutagenese</td></tr><tr><td>Pneumatischer Mikroinjektor</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Kit für die RNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Sanger-Sequenzierungsservice</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, granuliert</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH für die Genomextraktion</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX10</td><td>Wird für die Fotografie des Phänotyps</td></tr><tr><td>verwendet SZ-Serie Zoom Stereomikroskop</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>Kit für die In-vitro-Transkription&nbsp;</td></tr><tr><td>TIANprep Mini Plasmid Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>Kit für Plasmid-Extraktionskit</td></tr><tr><td>TIANquick Mini Purification Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP203-02</td><td>Kit für die Aufreinigung von linearisiertem Plasmid</td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Wird zur Anästhesie von Zebrafischen</td></tr><tr><td>verwendet Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Bestandteil von Tris&middot; HCl für die Genomextraktion</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Restriktionsendonuklease für die Plasmidlinearisierung</td></tr></tbody></table>

effizientes pam-loses baseneditieren für die zebrafisch-modellierung menschlicher genetischer erkrankungen mit zspry-abe8e

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat den Wert des Zebrafisches für die Modellierung menschlicher genetischer Krankheiten, die Untersuchung der Krankheitspathogenese und das Screening von Medikamenten erhöht, aber die Einschränkungen des Protospacer-benachbarten Motivs (PAM) sind ein großes Hindernis für die Erstellung genauer Tiermodelle menschlicher genetischer Erkrankungen, die durch Einzelnukleotidvarianten (SNVs) verursacht werden. Bisher haben einige SpCas9-Varianten mit breiter PAM-Kompatibilität ihre Wirksamkeit im Zebrafisch gezeigt. Die Anwendung des optimierten SpRY-vermittelten Adenin-Basen-Editors (ABE), zSpRY-ABE8e und synthetisch modifizierter gRNA im Zebrafisch hat eine effiziente Adenin-Guanin-Basenumwandlung ohne PAM-Einschränkung ermöglicht. Hier wird ein Protokoll zur effizienten Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Begrenzung im Zebrafisch unter Verwendung von zSpRY-ABE8e beschrieben. Durch die Injektion einer Mischung aus zSpRY-ABE8e mRNA und synthetisch modifizierter gRNA in Zebrafischembryonen wurde ein Zebrafisch-Krankheitsmodell mit einer präzisen Mutation konstruiert, das eine pathogene Stelle des TSR2-Ribosomenreifungsfaktors (tsr2) simulierte. Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für die Etablierung genauer Krankheitsmodelle zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und -behandlungen dar.

Es wurde berichtet, dass die Mutation von TSR2 eine Diamond Blackfan-Anämie (DBA) verursacht42. In dieser Arbeit wurde ein DBA-Zebrafischmodell mit einer tsr2 (M1V)-Mutation unter Verwendung der i-Silence-Strategie konstruiert. Das Adenin des Startcodons des Zebrafisches tsr2 wurde mit Hilfe von zSpRY-ABE8e erfolgreich in Guanin umgewandelt (Abbildung 3).
Die EditR-Analyse der Sanger-Sequenzierungsergebnisse zeigt...

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, eine Reihe von bisher nicht verfügbaren Zebrafischmodellen von krankheitsrelevanten Einzelnukleotidvarianten zu erstellen. PAM-Einschränkungen sind ein großes Hindernis für die Erstellung genauer Tiermodelle, und zSpRY-ABE8e ermöglicht eine effiziente Umwandlung von Adenin in Guanin-Basen mit geringer Intermutation und entspannter PAN-Restriktion. Dieses Werkzeug kann verwendet werden, um genaue Zebrafischmodelle zu konstruieren, um die pathogenen Eigenschaften von Krankheitsmechanismen im Zusammenhang mit Einzelnukleotidmarinen zu untersuchen und Medikamente auf diese Krankheit zu untersuchen.Richten Sie zunächst das Mikropipettenziehsystem ein und heizen Sie es mindestens 30 Minuten lang vor. Um die Glaskapillaren zu ziehen, wählen Sie ein Programm aus, stellen Sie den Rampentestwert als Wärme, 50 als Zug, die Geschwindigkeit als 100, die Zeit als 50 und den Druck als 30 ein. Installieren Sie als Nächstes das Kapillarrohr und stellen Sie sicher, dass es sich in der Nut befindet.Drücken Sie Pull Start/Stop", um das Programm auszuführen. Um die gezogenen Kapillaren zu schonen, führen Sie sie in Schaumstoff ein, der Lücken enthält, so dass die Nadel in der Schwebe bleibt. Verwenden Sie für Experimente die im Manuskript beschriebene zSpRY-ABE8e-mRNA und editieren Sie sgRNA, die an beiden Enden mit 2'O-Methylphosphorothioat modifiziert wurde.Für das gRNA-Design ist bevorzugt NRN als PAM-Sequenz zu wählen, da zSpRY-ABE8e eine höhere Präferenz für NRN-PAM als NYN-PAM zeigt. Geben Sie das Ziel-Adenin-Nukleotid in das hochaktive Editierfenster vom dritten bis zum neunten Nukleotid entlang des Protospacers ein. Stellen Sie in der Nacht vor der Injektion Aufzuchtbecken.Setzen Sie eine Trennwand ein und legen Sie zwei weibliche und einen männlichen Zebrafisch in jedes Becken. Legen Sie einen Deckel über jeden Tank. Am nächsten Morgen mischen Sie die aufgetaute mRNA und EEgRNA auf Eis mit RNase-freien Spitzen, Röhrchen und Handschuhen auf eine Endkonzentration von 400 bzw. 200 Nanogramm pro Mikroliter.Um den pneumatischen Mikroinjektor zu konfigurieren, schließen Sie zunächst das Partialdruckventil der Luftpumpe. Öffnen Sie dann das Hauptventil, schrauben Sie die Gasflasche ab und stellen Sie den Druck des Partialdruckventils auf 0,2 Megapascal ein. Schalten Sie nun den Mikroinjektor ein und stellen Sie den Modus auf Timer.Stellen Sie den Parameter Druckventil auf 20 Pfund pro Quadratzoll und den Timer-Wert auf 0,040 Sekunden ein. Brechen Sie mit einer feinen Pinzette die Nadeln der gezogenen Glaskapillaren unter einem Stereomikroskop schräg auf. Geben Sie das mRNA/gRNA-Gemisch mit einer Microloader-Pipettenspitze in die Spitze einer Glaskapillare und befestigen Sie die Nadel am Mikromanipulator.Konfigurieren Sie den Druck- und Timer-Wert so, dass mit einer Mikrokappe ein Zwei-Nanoliter-Gemisch pro Injektion erzeugt wird. Nachdem Sie den Fisch 10 bis 15 Minuten lang gezüchtet haben, sammeln Sie die Eier in einem Sieb. Untersuchen Sie das Zellstadium und die Eiqualität unter dem Stereomikroskop.Wählen Sie einzellige Eizellen für die Injektion aus, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern. Legen Sie die Eizellen auf eine 1,5%ige Agarose-Injektionsplatte und injizieren Sie zwei Nanoliter der RNA-Mischung mit einem Mikroskop in die Zelle der Embryonen. Sammeln Sie die Eier in Petrischalen mit E3-Puffer und bebrüten Sie sie bei 28 Grad Celsius.Entfernen Sie die toten Eizellen und wechseln Sie den Kulturpuffer 48 Stunden nach der Befruchtung alle 12 Stunden. Nach 48 Stunden nach der Befruchtung werden drei Pools mit sechs zufällig ausgewählten injizierten Embryonen in ein PCR-Röhrchen gesammelt. Sobald sechs zufällig ausgewählte Kontrollembryonen entnommen wurden, verwenden Sie eine Pipette, um den verbleibenden E3-Puffer abzusaugen.Fügen Sie den Embryonen 40 Mikroliter 50 millimolare Natriumhydroxid hinzu. Legen Sie die Röhrchen für 20 Minuten in ein Metallbad bei 95 Grad Celsius und wirbeln Sie sie dann 15 Sekunden lang. Geben Sie vier Mikroliter eines molaren Trishydrochlorids bei einem pH-Wert von acht in jedes Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2000 g für 10 Sekunden bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand in ein neues PCR-Röhrchen. Entfernen Sie einen Mikroliter des Überstands aus dem PCR-Röhrchen und verwenden Sie ihn für die Sanger-Sequenzierung.Den restlichen Überstand dann bei 20 Grad Celsius lagern. Um die Sanger-Sequenzierungsdaten zu analysieren, laden Sie zunächst die Sequenzierungsdatei in das Feld "ab1-Datei hochladen" hoch. Geben Sie die gRNA-Sequenz mit 20 Basenpaaren in der Orientierung von 5's bis 3' in das Feld "gRNA"-Sequenz eingeben ein.Geben Sie die entsprechende Basisposition in die Felder 5'start und 3'ends ein. Erzielen Sie die Effizienz der Basisbearbeitung, indem Sie auf "Predictive Editing" klicken und die Qualität der Sequenzierungsdaten überprüfen. Ein Diamond-Blackfan-Anämie-Zebrafischmodell wurde konstruiert, indem das Adenin des Startcodons von Tsr2 in Guanin umgewandelt wurde.Die EditR-Analyse der Sequenzdaten zeigte eine AG-Überlappung an der Adeninbase des Tsr2-Startcodons. Der Phänotyp der beiden einen Tag alten Tsr2-Embryonen zeigte im Vergleich zu den Kontrollembryonen kleinere Augen. Auch bei den mutierten Embryonen wurde ein geschwollener Perikard beobachtet.Um eine effiziente Basenbearbeitung zu erreichen, halten Sie sich bitte strikt an das zuvor erwähnte Guideline-Design-Prinzip, das Voraussetzung für den Erfolg des Experiments ist. Genaue Modelle sind für die Untersuchung von Krankheiten, die mit Einzelnukleotidvarianten in Verbindung stehen, unerlässlich. Die Entwicklung des SprY-ABE8e bietet ein effektives Werkzeug für eine genaue Modellierung, das dazu beiträgt, die Erforschung von Krankheitsmechanismen und -behandlungen zu fördern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier präsentieren wir einen systematischen Ansatz für die Entwicklung physiologisch relevant, sensitive und...

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Der Zebrafisch ist ein hervorragendes Modellsystem für genetische und Entwicklungsstudien. Die Bead-Implantation ist eine wertvolle Gewebemanipulationstechnik, die verwendet werden kann, um Entwicklungsmechanismen zu untersuchen, indem Veränderungen in der lokalen zellulären Umgebung eingeführt werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Implantation von Mikrokügelchen im Zebrafischembryo durchgeführt wird.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Mitose ist für jeden lebenden Organismus von entscheidender Bedeutung und Defekte führen oft zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Mit diesem Bildgebungsprotokoll und dem Zebrafisch als Modellsystem können Forscher die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus und die Vielzahl von Defekten sichtbar machen, die entstehen, wenn mitotische Prozesse defekt sind.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um präzise Knock-in-Bearbeitungen in Zebrafischembryonen mit der CRISPR-Cas9-Technologie zu ermöglichen. Eine Phänotypisierungspipeline wird vorgestellt, um die Anwendbarkeit dieser Techniken zur Modellierung einer Long-QT-Syndrom-assoziierten Genvariante zu demonstrieren.

CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

RASopathien sind multisystemische genetische Syndrome, die durch eine Hyperaktivierung des RAS-MAPK-Signalwegs verursacht werden. Potenziell pathogene Varianten, die auf ihre Validierung warten, treten kontinuierlich auf, während schlechte präklinische Evidenz die Therapie einschränkt. Hier beschreiben wir unser in vivo-Protokoll zum Testen und Kreuzvalidieren von RASopathie-assoziierten ERK-Aktivierungsniveaus und ihrer pharmakologischen Modulation während der Embryogenese durch...

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

Erfahren Sie effizientes PAM-loses Baseneditieren mit zSpRY-ABE8e in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht präzise Krankheitsmodellierung für Einzelnukleotid-Varianten und unterstützt die Erforschung genetischer Erkrankungen.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

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