Analyse der extrazellulären Vesikel-vermittelten Gefäßverkalkung mittels In-vitro- und In-vivo-Modellen

Dieses Protokoll bietet eine Methode, die verwendet werden kann, um Behandlungen für Gefäßverkalkungen, die der wichtigste Prädiktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind, zu bewerten und in Zukunft zu entwickeln. Die Fähigkeit, EVs zu isolieren, ermöglicht es uns, die Mechanismen, die zur Gefäßverkalkung führen, und die phänotypische Veränderung der glatten Gefäßmuskelzellen weiter zu untersuchen. Diese Technik gibt Einblick in frühe molekulare Mechanismen der durch Gefäßzellen vermittelten Verkalkung glatter Muskelzellen.

Wenn man dies versteht, können therapeutische Optionen für den verstandenen Mechanismus untersucht werden. Alle EVs von Interesse können mit dieser Methode untersucht werden. Es ist nicht exklusiv für glatte Gefäßmuskelzellen, Osteoblasten oder Gefäßverkalkungen.

Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und machen Sie einen Einschnitt entlang der Mittellinie. Entfernen Sie überschüssige Haut oder Fett. Entfernen Sie dann die Fortpflanzungsorgane, die Blase und das Fett außerhalb der Mittellinie.

Bewegen Sie dann die Magen-Darm-Organe auf die rechte Seite und folgen Sie dem Darm in der Mittellinie. Sobald Sie gefunden sind, heben Sie die Mittellinie an und schneiden Sie den Magen-Darm-Trakt bis zum Magen heraus. Schneiden Sie die Nieren aus, indem Sie sie von der Mittellinie wegheben.

Schneiden Sie so nah wie möglich an der Niere. Entfernen Sie die Leber, indem Sie die Lappen anheben und von der Mittellinie abschneiden. Dann perfusionieren Sie das Herz und die Aorta, indem Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze kaltes PBS in den rechten Ventrikel injizieren.

Warten Sie, bis sich die Lunge aufgeblasen hat und weiß wird. Entfernen Sie die Lunge und überschüssiges Zwerchfell oder Brustkorb. Um den Knochen zu entfernen, öffnen Sie eine Schere weit und platzieren Sie sie im unteren Bereich der Maus über dem Schwanz.

Schneiden Sie nach unten, heben Sie die Wirbelsäule von der Haut ab und entfernen Sie das Fett von den Seiten der Mittellinie. Sobald sich die Haut gelöst hat, entfernen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe, indem Sie direkt über dem Herzen schneiden. Legen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe in ein Becherglas PBS im Eiskübel, wenn Sie sie zu einem Stereoskop transportieren.

Nachdem Sie die Wirbelsäule und die Organe in die Sezierschale bewegt haben, füllen Sie sie mit eiskaltem PBS und fixieren Sie die Wirbelsäule und den Brustkorb mit Nadeln. Heben Sie das Herz unter dem Präpariermikroskop vorsichtig mit einer Pinzette an und beginnen Sie mit dem Schneiden über der Wirbelsäule und unter der Aorta. Fahren Sie damit fort, bis die Unterseite der Wirbelsäule erreicht ist.

Entfernen Sie die Wirbelsäule von der Sezierschale und stecken Sie das Herz und jegliches Fremdfett oder Muskel fest. Beginnen Sie mit dem Bereich direkt unter dem Herzen, identifizieren Sie die Speiseröhre, die Hohlvene und die Aorta. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Hohlvene, um ein klares Gesichtsfeld der Aorta zu haben.

Beginnen Sie mit der Mikrodissektionszezange und der Schere mit dem Anheben des Fettgewebes und schneiden Sie so nah wie möglich an der Aorta. Setzen Sie dies entlang der medialen Linie fort, bis alle Aorta und die Oberschenkelarterien freigelegt sind. Entfernen Sie am Herzen das gesamte Fettgewebe, das die drei Äste am Aortenbogen freilegt.

Entfernen Sie die Aortenwurzel aus dem linken Ventrikel, indem Sie die Mikrodissektionsschere in den linken Ventrikel einführen und den Muskel um die Aorta herum durchtrennen. Sobald die Aorta isoliert und gereinigt ist, bilden Sie die Aorta mit einem Nahinfrarotscanner ab, um die Gefäßverkalkung sichtbar zu machen. Quantifizieren Sie mit dem benutzerdefinierten MATLAB-Skript das Gesamtsignal des Calcium-Tracers, normalisiert auf die gesamte gescannte Aortenfläche.

Leiten Sie das MATLAB aus dem Nahinfrarot-Scan der Aorten an den Speicherort der TIF-Dateien, öffnen Sie die einzelnen Dateien und extrahieren Sie die Pixelintensitätswerte aus den TIF-Dateien. Wählen Sie die Aorta mit der größten Verkalkung als Skalenmaximum auf dem farbig abgebildeten Bild aus. Wenn der Befehl Wie viele Proben befinden sich im Bild im Fenster angezeigt wird, geben Sie die Anzahl der Aorten im aktuellen Bild ein, und wählen Sie jede Aorta einzeln aus.

Sobald eine Aorta ausgewählt ist, erstellt MATLAB Binärbilder mit einer Maske der Gesamtfläche und der verkalkten Fläche der Aorta. Die Werte aus diesen maskierten Bildern werden dann verwendet, um die gesamte verkalkte Fläche, die Gesamtfläche der Aorta, die prozentuale Fläche, die für die Verkalkung positiv ist, und die mittlere Intensität der verkalkten Fläche zu bestimmen. Unmittelbar nach dem Scannen der Aorten werden zwei bis drei Aorten gepoolt, um eine ausreichende Proteinkonzentration zu erhalten.

Inkubieren Sie zwei bis drei gepoolte Aorten in 1,5 Millilitern Verdauungslösung für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie die Lösung und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei 1.000 g, um Zelltrümmer zu entfernen. Um die Mikrovesikel zu entfernen, zentrifugieren Sie den Überstand erneut 30 Minuten lang bei 33.000 g.

Sammeln und bewerten Sie den Überstand auf Verkalkungspotenzial. Nachdem Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation aus dem konditionierten gesammelten Medium entfernt haben, schleudern Sie den gesammelten Überstand 30 Minuten lang bei 33.000 g. Sammeln Sie den Überstand und füllen Sie ihn in ein neues Röhrchen um.

Dann fügen Sie 1% von 300 Millimol Natriumdihydrogenphosphat zu den extrazellulären Vesikelproben hinzu und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren. Übertragen Sie 200 Mikroliter der Mischungslösung auf eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie die 96-Well-Platte im Mikroplatten-Reader bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie den Plattenleser so ein, dass er jede Minute die Absorption bei einer Wellenlänge von 340 Nanometern aufzeichnet.

Pipettieren Sie 300 Mikroliter der Kollagenlösung in jede Vertiefung eines Kammerglases mit acht Vertiefungen und inkubieren Sie 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation 300 Mikroliter DMEM als Kontrolle in die Vertiefungen geben. Fügen Sie 300 Mikroliter der zuvor gesammelten extrazellulären Vesikelmediumproben zu den verbleibenden Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie sechs Tage lang, wie zuvor gezeigt.

Am 10. Tag pipettieren Sie 2,5 Mikroliter der Mischung aus OsteoSense und DMEM in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Am Ende der Inkubation werden die Hydrogele mit Filtern für die OsteoSense-Fluoreszenz mit einem inversen Mikroskop durch den Boden einer Deckglaskammer oder von oben mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand abgebildet. Beurteilen Sie die Anzahl der Verkalkungen und die Verkalkungsgröße sowie die gesammelten Bilder mit den in ImageJ verfügbaren Partikelanalyseoptionen.

Navigieren Sie dann zu Bild, wählen Sie Anpassen und klicken Sie auf Schwellenwert, um die Bilder so zu binarisieren, dass nur das OsteoSense-Signal weiß angezeigt wird. Verwenden Sie dann den Befehl "Analysieren" und klicken Sie auf "Partikel analysieren", um Informationen zu jeder Verkalkung im Bild abzurufen. Verwenden Sie für jedes analysierte Bild dieselben Schwellenwertparameter, um die Konsistenz zu gewährleisten.

Die optische Nahinfrarot-Scanner-Bildgebung der präparierten Aorten zeigte ein höheres OsteoSense-Signal in der gesamten Aorta einer Maus mit chronischer Nierenerkrankung als die beiden Aorten von Kontrollmäusen. Das konditionierte Medium, das aus glatten Gefäßmuskelzellen gewonnen wurde, die in einem prokalzifizierenden Medium kultiviert wurden, zeigte bei 340 Nanometern eine höhere Absorption als das Kontrollmedium. Der Absorptionsanstieg trat in der Pro-Kalk-Probe 1,5-fach schneller auf als in einer Kontrollprobe.

Das konditionierte Medium aus Zellen, die unter kalknahen Bedingungen kultiviert wurden, enthielt mineralische Ablagerungen. Bei der Mikrodissektion der Aorta ist es wichtig, das Fett, das die Aorta umgibt, sorgfältig zu schneiden. Sie möchten, dass so viel wie möglich von der Aorta analysiert wird, aber das kann ziemlich mühsam sein.

Sobald EVs isoliert sind, könnten zusätzliche Tests, wie z. B. ein alkalischer Phosphatase-Aktivitätstest oder ein Immunkörper, durchgeführt werden. Diese Tests würden die Mechanismen und Proteine, die in EVs vorhanden sind, weiter aufzeigen.