Name: Analyse der extrazellulären Vesikel-vermittelten Gefäßverkalkung mittels In-vitro- und In-vivo-Modellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Analyse extrazellulärer Vesikel-vermittelter Gefäßverkalkung mit In-vitro- und In-vivo-Modellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen bei Musculus-vascularis-glattzell-vermittelter Kalzifizierung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 und 5 T32GM132054-04) und der Florida Heart Research Foundation unterstützt. Wir danken Kassandra Gomez für ihre Hilfe bei der Synthese und Bildgebung der Hydrogele.

Die In-vivo-Arbeit wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Florida International University genehmigt und beaufsichtigt und entsprach den aktuellen Richtlinien der National Institutes of Health (NIH). Bei diesem Protokoll unterscheidet sich das Verfahren nicht je nach Belastung, Gewicht, Alter und Geschlecht der Maus. Die Art der untersuchten Verkalkung, Diäten und Behandlungen können die Dauer der Studie und das Gewicht der verwendeten Maus verändern und können von einem bestimmten Stamm und Geschlecht der in der Studie verwendeten Maus abhängen. Für dieses Protokoll wurden sowohl männliche als auch weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die mit einer Verkalkungsdiät gefüttert wurden. Die Mäuse wurden im Alter zwischen 20 und 24 Wochen getötet.
1. Isolierung und Exzision der Aorta
<ol><li>Fluoreszierende Marker<ol><li>Injizieren Sie den Mäusen achtundvierzig Stunden vor der Euthanasie 20 μM OsteoSense 680, ein fluoreszierendes Bildgebungsmittel, in der empfohlenen Dosis von 100 μl pro 25 g über eine intravenöse Injektion.</li>
		<li>Legen Sie unter den Abzug eine Styroporplatte mit vier T-Pins, einen mit einem Papiertuch ausgekleideten Eimer, ein mit einem Papiertuch gefülltes 50-ml-Röhrchen, ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, Dissektionswerkzeuge (siehe Materialtabelle) und Ethanol in eine Sprühflasche. Stellen Sie Becher mit PBS auf Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Blutabnahme<ol><li>Geben Sie 2 ml Isofluran in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das mit dem Papiertuch gefüllt ist. Legen Sie das Röhrchen in den Eimer und verschließen Sie es mit dem Deckel. VORSICHT: Isofluran sollte in einem gut belüfteten Raum ohne Umluft aufgrund der Toxizität einer kurzfristigen Exposition gehandhabt werden.</li>
		<li>Übertragen Sie jeweils eine Maus in den Eimer. Legen Sie die Maus nach der Sedierung in Rückenposition auf das Papiertuch. Halten Sie die Maus mit der Handfläche der nicht dominanten Hand und legen Sie die Ohren mit Daumen und Zeigefinger zurück.</li>
		<li>Entfernen Sie mit der Pinzette eines der Augen. Halten Sie die Maus über das 1,5-ml-Röhrchen, um mit der Blutentnahme zu beginnen, bei der 1 ml Blut entnommen werden sollte. Sobald das Blut nicht mehr abfließt, legen Sie die Maus zur weiteren Sedierung wieder in den Eimer.</li>
	</ol></li>
	<li>Euthanasie<ol><li>Legen Sie ein Papiertuch auf die Seziermatte. Sobald die Maus sediert ist, legen Sie die Maus in Rückenlage auf die Matte. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage mit einem T-Pin, um jedes Glied festzuhalten.</li>
		<li>Besprühen Sie den Bauch der Maus mit Alkohol. Heben Sie mit der Pinzette die Haut im Brustbereich an. Schneiden Sie mit der Schere die mediale Linie in die Brusthöhle ab. Sobald das Brustbein in der Mitte durchtrennt wurde, schneiden Sie das Zwerchfell auf beiden Seiten des Brustkorbs ab.</li>
		<li>Schneiden Sie bei Bedarf den vorderen Teil des Brustkorbs ab, um Herz und Lunge freizulegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Organentnahme<ol><li>Heben Sie mit einer Pinzette die Haut an und machen Sie einen Einschnitt entlang der Mittellinie. Entfernen Sie überschüssige Haut oder Fett. Entfernen Sie die Fortpflanzungsorgane und die Blase sowie jegliches Fett außerhalb der Mittellinie.</li>
		<li>Bewegen Sie die gastrointestinalen (GI) Organe auf die rechte Seite und folgen Sie dem Darm in der Mittellinie. Sobald Sie es gefunden haben, heben Sie die Mittellinie an und schneiden Sie den Magen-Darm-Trakt bis zum Magen heraus.</li>
		<li>Schneiden Sie die Nieren aus, indem Sie sie von der Mittellinie wegheben. Schneiden Sie so nah wie möglich an der Niere.</li>
		<li>Beginnen Sie als nächstes mit der Entfernung der Leber, indem Sie die Lappen anheben und von der Mittellinie abschneiden.</li>
		<li>Herz und Aorta durchbluten. Injizieren Sie mit einer 10-ml-Spritze kaltes PBS in den rechten Ventrikel. Warten Sie, bis sich die Lunge aufgeblasen hat und weiß wird. Entfernen Sie die Lunge sowie überschüssiges Zwerchfell oder Brustkorb.</li>
	</ol></li>
	<li>Knochenabbau<ol><li>Öffnen Sie eine Schere weit und platzieren Sie sie im unteren Bereich der Maus über dem Schwanz. Schneiden Sie nach unten und beginnen Sie, die Wirbelsäule von der Haut zu heben. Entfernen Sie das Fett von den Seiten der Mittellinie. Sobald sich die Haut gelöst hat, entfernen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe, indem Sie direkt über dem Herzen schneiden. Wenn Sie zu einem Stereoskop transportieren, legen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe in ein Becherglas mit PBS im Eiskübel.</li>
		<li>Bewegen Sie die Wirbelsäule und die Organe in die Sezierschale. Mit eiskaltem PBS auffüllen. Befestigen Sie die Wirbelsäule und den Brustkorb mit Nadeln.</li>
		<li>Verwenden Sie unter dem Dissektionsmikroskop eine Pinzette, um das Herz vorsichtig anzuheben, und beginnen Sie, über der Wirbelsäule und unter der Aorta zu schneiden. Fahren Sie damit fort, bis die Unterseite der Wirbelsäule erreicht ist. Entfernen Sie die Wirbelsäule von der Sezierschale und stecken Sie das Herz und jegliches Fremdfett oder jeden Muskel fest.</li>
	</ol></li>
	<li>Microdissection<ol><li>Beginnen Sie mit dem Bereich direkt unter dem Herzen und identifizieren Sie die drei röhrenförmigen Strukturen: die Speiseröhre, die Hohlvene und die Aorta. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Hohlvene, um ein klares Gesichtsfeld der Aorta zu haben.</li>
		<li>Beginnen Sie mit der Mikrodissektionszezange und der Schere, das Fettgewebe anzuheben und so nah wie möglich an der Aorta zu schneiden. Achten Sie darauf, die Aorta nicht zu schneiden. Setzen Sie dies entlang der medialen Linie fort, bis alle Aorta sowie die Oberschenkelarterien freigelegt sind.</li>
		<li>Entfernen Sie am Herzen das gesamte Fettgewebe und legen Sie die drei Äste am Aortenbogen frei. Entfernen Sie die Aortenwurzel aus dem linken Ventrikel, indem Sie die Mikrodissektionsschere in den linken Ventrikel einführen und den Muskel um die Aorta herum durchtrennen.</li>
		<li>Sobald die Aorta isoliert und gereinigt ist, bilden Sie die Aorta mit einem Nahinfrarotscanner ab, um die Gefäßverkalkung sichtbar zu machen.</li>
		<li>Verwenden Sie das benutzerdefinierte MATLAB-Skript (Supplemental File 1), um das Gesamtsignal des Calcium-Tracers zu quantifizieren, das auf die gesamte gescannte Aortenfläche normalisiert wird. Das MATLAB-Skript funktioniert mit dem Toolbox-Add-In Bioinformatik. MATLAB wird zunächst aus dem Nahinfrarot-Scan der Aorten an den Speicherort der TIFF-Dateien geleitet, die einzelnen Dateien werden dann geöffnet und die Pixelintensitätswerte werden aus den TIFF-Dateien extrahiert.<ol><li>Sobald das Bild dem Benutzer mit einer Farbkarte angezeigt wird, wählen Sie die Aorta mit der größten Verkalkung als Skalenmaximum aus.</li>
			<li>Wenn MATLAB im Befehlsfenster fragt: "Wie viele Proben befinden sich im Bild?", geben Sie die Anzahl der Aorten im aktuellen Bild ein und wählen Sie jede Aorta einzeln aus. Sobald eine Aorta ausgewählt ist, erstellt MATLAB ein Binärbild mit einer Maske der Gesamtfläche der Aorta und ein weiteres Binärbild mit einer Maske des verkalkten Bereichs der Aorta. Die Werte aus diesen maskierten Bildern werden dann verwendet, um die gesamte verkalkte Fläche, die Gesamtfläche der Aorta, die prozentuale Fläche, die für die Verkalkung positiv ist, und die mittlere Intensität der verkalkten Fläche zu bestimmen.</li>
			<li>Um eine Aorta auszuwählen, erstellen Sie ein Kästchen um die interessierende Aorta auf der neuesten Abbildung auf dem Bildschirm, indem Sie mit einem Linksklick vier Ecken auswählen und ein Kästchen um das Bild erstellen. Um das Feld zu schließen, doppelklicken Sie auf die erste Ecke. HINWEIS: Der Schwellenwert kann je nach verwendetem Verkalkungsmodell unterschiedlich sein. Es ist Sache des Benutzers, zu bestimmen, welcher Wert ein positives Signal für die Gefäßverkalkung bestimmt. Sobald der Schwellenwert für ein Experiment festgelegt ist, muss er während der gesamten Dauer des Experiments gleich bleiben.</li>
		</ol></li>
		<li>Sobald die quantitativen Daten extrahiert sind, führen Sie eine Einweg-ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey durch, um die Signifikanz zwischen den Gruppen zu zeigen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolierung und Extraktion von EVs aus Aorten
HINWEIS: Sobald die Aorten isoliert und entfernt wurden, können EVs aus dem Gewebe extrahiert werden. Unter Verwendung einer Verdauungslösung und mehrerer Zentrifugenzyklen können EVs gesammelt und für viele verschiedene Techniken verwendet werden, einschließlich Verkalkungstests, Gelelektrophorese und Immunblotting13. Das Protokoll zum Isolieren und Extrahieren von Elektrofahrzeugen lautet wie folgt:
<ol><li>Unmittelbar nach dem Scannen der Aorten werden zwei bis drei Aorten gepoolt, um eine ausreichende Proteinkonzentration zu erhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Verdauungslösung vor, die 0,25 M Saccharose, 0,12 M Natriumchlorid (NaCl), 0,01 M Kaliumchlorid (KCl), 0,02 M Trishydrochlorid und 600 U/ml Kollagenase13 enthält.</li>
	<li>Inkubieren Sie zwei bis drei gepoolte Aorten in 1,5 ml Verdauungslösung für 2 h bei 37 °C. Sammeln Sie die Lösung. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.000 × g für 15 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand für weitere 30 Minuten bei 33.000 × g , um Mikrovesikel zu entfernen. Sammeln und bewerten Sie den Überstand auf das Verkalkungspotenzial (siehe Abschnitt 3). HINWEIS: Befolgen Sie die folgenden Schritte, wenn eine Gelelektrophorese und ein Protein-Immunblotting der EVs durchgeführt werden sollen.</li>
	<li>Ultrazentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 × g für 1 h, um die interessierenden EVs zu isolieren.</li>
	<li>Während der Überstand einer Ultrazentrifugation unterzogen wird, bereiten Sie die RIPA-Lyse und den Extraktionspuffer (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie den Proteasehemmer hinzufügen und wirbeln, bis er aufgelöst ist.</li>
	<li>Sobald die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie den Überstand ab und lassen Sie das Pellet übrig, das die EVs enthält. Suspendieren Sie das Pellet in der vorbereiteten RIPA-Lyse- und Proteasehemmer-Mischung. Die Proben sind bereit für die Gelelektrophorese und das Western Blotting.</li>
</ol>3. Beurteilung des Verkalkungspotentials extrazellulärer Vesikel mit lichtstreuender Absorption
HINWEIS: Um die Mineralbildung von EVs in Echtzeit zu messen, haben wir einen Assay verwendet, der ursprünglich entwickelt wurde, um die Mineralbildung aus Wachstumsplattenknorpel-EVs aus Zellkulturenzu untersuchen 14. Da die Calciumphosphatablagerung das Kennzeichen der Verkalkung ist, ist eine Erhöhung der Lichtstreuabsorption als Folge der Bildung von Calciumphosphatverbindungen ein Hinweis auf das Verkalkungspotenzial14. In vitro VSMC-Modelle eignen sich für die Messung des Verkalkungspotenzials von Elektrofahrzeugen. Bei dieser Technik kann ein Plattenleser mit einem kurzwelligen Filter die in vitro Verkalkung von EVs quantifizieren. Der Absorptionswert wird bei 340 nm aufgezeichnet, und eine höhere Absorption weist auf eine stärkere Bildung von Calciumphosphatmineralien hin. Das Protokoll für den Lichtstreuabsorptionstest lautet wie folgt:
<ol><li>Zentrifugieren Sie das konditionierte gesammelte Medium von VSMCs bei 1.000 × g für 5 Minuten, um Zelltrümmer14 zu entfernen.</li>
	<li>Der Überstand wird 30 Minuten lang bei 33.000 × g zentrifugiert, der Überstand aufgefangen und in ein neues Röhrchen überführt. HINWEIS: Das Vorhandensein von EVs im gesammelten Überstand kann durch dynamische Lichtstreuung (DLS) oder Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bestätigt werden</li>
	<li>Bereiten Sie eine 300 mM Natriumphosphat monobasisch (NaH2PO4) sterile Lösung vor. Filtern Sie die Lösung, um bei Bedarf sterile Bedingungen zu gewährleisten.</li>
	<li>Fügen Sie 1% (v/v) von 300 mM NaH2PO4 zu den EV-Proben hinzu und pipettieren Sie die Lösung vorsichtig, um sie gut zu mischen. 200 μl der Mischungslösung werden auf eine 96-Well-Platte übertragen. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte im Mikroplatten-Reader bei 37 °C.</li>
	<li>Stellen Sie den Plattenleser so ein, dass er alle 1 Minute die Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm aufzeichnet.</li>
</ol>4. Beurteilung der Verkalkungsmineralbildung von extrazellulären Vesikeln mit Kollagen-Hydrogelen
HINWEIS: Die Aggregation von EVs und die Bildung von Mikroverkalkungen werden durch Kollagenhydrogele beobachtet. Diese Hydrogele wirken wie ein Gerüst, das die in vivo15 beobachtete Kollagendichte nachahmt. Dies zeigt die Wirkung von Kollagen auf das Verkalkungswachstum. Das Protokoll zur Beurteilung der Mineralbildung von EVs in Hydrogelen lautet wie folgt:
<ol><li>Tag 1<ol><li>Bereiten Sie eine 2,5 mg/ml Kollagenlösung in DMEM vor. Fügen Sie dem Kollagen/DMEM-Gemisch langsam 5 M Natriumhydroxid hinzu, bis die Farbe rot wird. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert der Lösung ungefähr 7 beträgt. HINWEIS: Wenn die Lösung lila wird und zu einfach wird, starten Sie den Vorgang neu.</li>
		<li>Pipettieren Sie 300 μl der 2,5 mg/ml Kollagenlösung mit einem pH-Wert von 7 in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammerglases. Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 72 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 4<ol><li>Geben Sie 300 μl DMEM als Kontrolle in die Vertiefungen.</li>
		<li>Fügen Sie 300 μl der zuvor entnommenen EV-Mediumproben zu den verbleibenden Bohrlöchern hinzu.</li>
		<li>Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 6 Tage.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 10<ol><li>Bereiten Sie 2,5 μl Osteosense 680EX mit 22,5 μl DMEM vor.</li>
		<li>Pipettieren Sie 2,5 μl der Mischung aus Osteosense und DMEM in jede Vertiefung. Inkubation bei 37 °C und 5% CO2 kontrollierter Luftfeuchtigkeit für 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 11<ol><li>Stellen Sie die Hydrogele mit Filtern dar, die für die Osteosense-Fluoreszenz geeignet sind. Stellen Sie sie mit einem inversen Mikroskop durch den Boden einer Deckglaskammer oder von oben mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand ab.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Anzahl der Verkalkungen und die Verkalkungsgröße in den gesammelten Bildern mithilfe der in ImageJ verfügbaren Partikelanalyseoptionen.<ol><li>Verwenden Sie das Bild | Anpassen | Schwellenwertbefehl , um die Bilder so zu binarisieren, dass nur das Osteosense-Signal weiß erscheint. Verwenden Sie die Option Analysieren | Befehl Partikel analysieren , um Informationen für jede Verkalkung im Bild zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass Sie für jedes Bild, das auf Konsistenz analysiert wird, dieselben Schwellenwertparameter verwenden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Bei der Durchführung des Protokolls ist es wichtig, die kritischen Schritte zu beachten, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Während der Isolierung der murinen Aorta ist es wichtig, dass die Perfusion richtig durchgeführt wird. Bei der Injektion des PBS muss darauf geachtet werden, dass der rechte Ventrikel nicht punktiert wird. Dies würde dazu führen, dass die Flüssigkeit direkt aus dem Ventrikel austritt und nicht durch die Lunge zirkuliert, wodurch Blut in der Aorta zurückbleibt. Sobald die Perfusion ordnungsgemäß...

Die Verkalkung ist der wichtigste Prädiktor für die Mortalität und Morbidität von Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. Die Verkalkung verändert die Mechanik der Arterienwände aufgrund der Ansammlung von Calcium- und Phosphatmineralien2. Bei Arteriosklerose kann die Verkalkung den lokalen Stress verschlimmern und zu einer Plaqueruptur führen, die die Hauptursache für Herzinfarkte ist. Die mediale Verkalkung, die häufig auf eine chronische Nierenerkrankung zurückzuführen ist, ist weiter verbreitet und führt zu einer erheblichen arteriellen Versteifung, Funktionsstörung und Herzüberlastung 2,3. Derzeit gibt es keine therapeutischen Möglichkeiten zur Behandlung oder Vorbeugung von Gefäßverkalkungen.
Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) nehmen einen Osteoblasten-ähnlichen Phänotyp an und setzen kalkifizierende extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, die entstehende Mineralien keimen und so die Verkalkung vorantreiben 4,5,6. Dieser Prozess ähnelt der physiologischen Mineralisierung von Osteoblasten im Knochen7. Obwohl der Endpunkt der Mineralisierung in der Gefäßwand und der Knochenmatrix ähnlich ist, unterscheiden sich die Mechanismen, durch die die kalzifizierenden EVs entstehen, in den beiden Geweben8. Es gibt viele Arten von Modellen, die zur Untersuchung der Gefäßverkalkung verwendet werden. In vitro ahmen Zellkulturmodelle den osteogenen Übergang von VSMCs und die anschließende Mineralbildung mit spezialisierten Medien nach.
Bei der Untersuchung der In-vivo-Verkalkung hängt das verwendete Modell von der Art der zu untersuchenden Verkalkung ab. Hyperlipidämische Mausmodelle werden häufig verwendet, um atherosklerotische Verkalkungen zu untersuchen, die in lipidreichen Plaques fokaler erscheinen9. Im Gegensatz dazu ist die mediale Verkalkung im gesamten Gefäßsystem weiter verbreitet und wird häufig unter Verwendung von Modellen für chronische Nierenerkrankungen untersucht, die eine adeninreiche Diät verwenden, um Nierenversagen zu induzieren, oder chirurgische Techniken, um signifikante Teile der Nieren zu entfernen10,11. Aggressive Modelle der Gefäßverkalkung haben eine Kombination aus hyperlipidämischen und chronischen Nierenerkrankungsmodellen verwendet12. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Beurteilung der Gefäßverkalkung in murinen Aorten sowohl für die mediale als auch für die atherosklerotische Verkalkung, die Extraktion von EVs aus der Aortenwand und die Beobachtung des Mineralisierungspotenzials in den EVs, die aus In-vitro-Zellkulturmodellen gewonnen wurden. Zukünftige Studien können diese Verfahren in mechanistischen Analysen von Gefäßverkalkungen und zur Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen einsetzen.

<table><tbody><tr><td>8-Well-Deckglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409PK</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 G 1 Zoll Nadel</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen, hohe Konzentration, Rattenschwanz</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>gebogene Pinzette</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschale</td><td>Living Systems Instrumentierung</td><td>DD-90-S</td><td></td></tr><tr><td>Sezierpfanne und Wachs</td><td>United Scientific Supplies</td><td>DSPA01-W</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cytiva</td><td>SH30022. </td><td></td>FS</tr><tr><td>Isofluran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR</td><td>DLx</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere gebogen (24 mm Klinge)&nbsp;</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierfederschere (13 mm Klinge)</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierfederschere (5 mm Klinge)</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierpinzette (0,10 x 0,06 mm Spitze)</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B11229</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680EX</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteaseinhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fischer Chemikalie</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lyse- und Extraktionspuffer</td><td>G Biosciences</td><td>786-489</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fischer Chemikalie</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Thermo Scientific</td><td>A4782602</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Multimode Reader</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte, 96-Well-Thermo</td><td>Fisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins</td><td>United Scientific liefert</td><td>TPIN02-PK/100</td><td></td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>Fischer Chemikalie</td><td>BP153</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der extrazellulären vesikel-vermittelten gefäßverkalkung mittels in-vitro- und in-vivo-modellen

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache der Welt, und Gefäßverkalkung ist der wichtigste Prädiktor für kardiovaskuläre Ereignisse. Derzeit gibt es jedoch keine Behandlungs- oder Therapiemöglichkeiten für die Gefäßverkalkung. Die Verkalkung beginnt in spezialisierten extrazellulären Vesikeln (EVs), die durch die Aggregation von Calcium- und Phosphationen als Keimbildungsherde dienen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Gewinnung und Bewertung der Verkalkung in murinen Aorten und zur Analyse der zugehörigen extrahierten EVs. Zunächst wird eine grobe Dissektion der Maus durchgeführt, um relevante Organe wie Nieren, Leber und Lunge zu entnehmen. Dann wird die murine Aorta isoliert und von der Aortenwurzel bis zur Oberschenkelarterie herausgeschnitten. Zwei bis drei Aorten werden dann gepoolt und in einer Verdauungslösung inkubiert, bevor sie einer Ultrazentrifugation unterzogen werden, um die interessierenden EVs zu isolieren. Als nächstes wird das Mineralisierungspotenzial der EVs durch Inkubation in einer phosphatreichen Lösung und Messung der Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 340 nm bestimmt. Schließlich werden Kollagen-Hydrogele verwendet, um die Bildung und Reifung von verkalkten Mineralien zu beobachten, die von den EVs in vitro erzeugt werden.

Sobald die Aorten extrahiert sind, zeigt die Bildgebung mit einem optischen Nahinfrarot-Scanner eine visuelle Darstellung der Aorta sowie der Gefäßverkalkung (Abbildung 1). Die Pixelintensitätswerte innerhalb des gescannten Fluoreszenzbildes stellen die Verteilung der Verkalkung dar und werden hier mit einer farbigen Heatmap dargestellt. Zu den Quantifizierungsmethoden gehören die Identifizierung eines positiven Schwellenwerts und die Angabe der prozentualen Fläche der Aorta mit Werten, die ...

In diesem Artikel wird die Methodik zur Gewinnung und Bewertung der Gefäßverkalkung durch Isolierung von murinen Aorten und anschließender Extraktion verkalkter extrazellulärer Vesikel zur Beobachtung des Mineralisierungspotenzials vorgestellt.

Analyse der extrazellulären Vesikel-vermittelten Gefäßverkalkung mittels In-vitro- und In-vivo-Modellen

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode, die verwendet werden kann, um Behandlungen für Gefäßverkalkungen, die der wichtigste Prädiktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind, zu bewerten und in Zukunft zu entwickeln. Die Fähigkeit, EVs zu isolieren, ermöglicht es uns, die Mechanismen, die zur Gefäßverkalkung führen, und die phänotypische Veränderung der glatten Gefäßmuskelzellen weiter zu untersuchen. Diese Technik gibt Einblick in frühe molekulare Mechanismen der durch Gefäßzellen vermittelten Verkalkung glatter Muskelzellen.Wenn man dies versteht, können therapeutische Optionen für den verstandenen Mechanismus untersucht werden. Alle EVs von Interesse können mit dieser Methode untersucht werden. Es ist nicht exklusiv für glatte Gefäßmuskelzellen, Osteoblasten oder Gefäßverkalkungen.Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und machen Sie einen Einschnitt entlang der Mittellinie. Entfernen Sie überschüssige Haut oder Fett. Entfernen Sie dann die Fortpflanzungsorgane, die Blase und das Fett außerhalb der Mittellinie.Bewegen Sie dann die Magen-Darm-Organe auf die rechte Seite und folgen Sie dem Darm in der Mittellinie. Sobald Sie gefunden sind, heben Sie die Mittellinie an und schneiden Sie den Magen-Darm-Trakt bis zum Magen heraus. Schneiden Sie die Nieren aus, indem Sie sie von der Mittellinie wegheben.Schneiden Sie so nah wie möglich an der Niere. Entfernen Sie die Leber, indem Sie die Lappen anheben und von der Mittellinie abschneiden. Dann perfusionieren Sie das Herz und die Aorta, indem Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze kaltes PBS in den rechten Ventrikel injizieren.Warten Sie, bis sich die Lunge aufgeblasen hat und weiß wird. Entfernen Sie die Lunge und überschüssiges Zwerchfell oder Brustkorb. Um den Knochen zu entfernen, öffnen Sie eine Schere weit und platzieren Sie sie im unteren Bereich der Maus über dem Schwanz.Schneiden Sie nach unten, heben Sie die Wirbelsäule von der Haut ab und entfernen Sie das Fett von den Seiten der Mittellinie. Sobald sich die Haut gelöst hat, entfernen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe, indem Sie direkt über dem Herzen schneiden. Legen Sie die Wirbelsäule und die intakten Organe in ein Becherglas PBS im Eiskübel, wenn Sie sie zu einem Stereoskop transportieren.Nachdem Sie die Wirbelsäule und die Organe in die Sezierschale bewegt haben, füllen Sie sie mit eiskaltem PBS und fixieren Sie die Wirbelsäule und den Brustkorb mit Nadeln. Heben Sie das Herz unter dem Präpariermikroskop vorsichtig mit einer Pinzette an und beginnen Sie mit dem Schneiden über der Wirbelsäule und unter der Aorta. Fahren Sie damit fort, bis die Unterseite der Wirbelsäule erreicht ist.Entfernen Sie die Wirbelsäule von der Sezierschale und stecken Sie das Herz und jegliches Fremdfett oder Muskel fest. Beginnen Sie mit dem Bereich direkt unter dem Herzen, identifizieren Sie die Speiseröhre, die Hohlvene und die Aorta. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Hohlvene, um ein klares Gesichtsfeld der Aorta zu haben.Beginnen Sie mit der Mikrodissektionszezange und der Schere mit dem Anheben des Fettgewebes und schneiden Sie so nah wie möglich an der Aorta. Setzen Sie dies entlang der medialen Linie fort, bis alle Aorta und die Oberschenkelarterien freigelegt sind. Entfernen Sie am Herzen das gesamte Fettgewebe, das die drei Äste am Aortenbogen freilegt.Entfernen Sie die Aortenwurzel aus dem linken Ventrikel, indem Sie die Mikrodissektionsschere in den linken Ventrikel einführen und den Muskel um die Aorta herum durchtrennen. Sobald die Aorta isoliert und gereinigt ist, bilden Sie die Aorta mit einem Nahinfrarotscanner ab, um die Gefäßverkalkung sichtbar zu machen. Quantifizieren Sie mit dem benutzerdefinierten MATLAB-Skript das Gesamtsignal des Calcium-Tracers, normalisiert auf die gesamte gescannte Aortenfläche.Leiten Sie das MATLAB aus dem Nahinfrarot-Scan der Aorten an den Speicherort der TIF-Dateien, öffnen Sie die einzelnen Dateien und extrahieren Sie die Pixelintensitätswerte aus den TIF-Dateien. Wählen Sie die Aorta mit der größten Verkalkung als Skalenmaximum auf dem farbig abgebildeten Bild aus. Wenn der Befehl Wie viele Proben befinden sich im Bild im Fenster angezeigt wird, geben Sie die Anzahl der Aorten im aktuellen Bild ein, und wählen Sie jede Aorta einzeln aus.Sobald eine Aorta ausgewählt ist, erstellt MATLAB Binärbilder mit einer Maske der Gesamtfläche und der verkalkten Fläche der Aorta. Die Werte aus diesen maskierten Bildern werden dann verwendet, um die gesamte verkalkte Fläche, die Gesamtfläche der Aorta, die prozentuale Fläche, die für die Verkalkung positiv ist, und die mittlere Intensität der verkalkten Fläche zu bestimmen. Unmittelbar nach dem Scannen der Aorten werden zwei bis drei Aorten gepoolt, um eine ausreichende Proteinkonzentration zu erhalten.Inkubieren Sie zwei bis drei gepoolte Aorten in 1,5 Millilitern Verdauungslösung für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie die Lösung und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei 1.000 g, um Zelltrümmer zu entfernen. Um die Mikrovesikel zu entfernen, zentrifugieren Sie den Überstand erneut 30 Minuten lang bei 33.000 g.Sammeln und bewerten Sie den Überstand auf Verkalkungspotenzial. Nachdem Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation aus dem konditionierten gesammelten Medium entfernt haben, schleudern Sie den gesammelten Überstand 30 Minuten lang bei 33.000 g. Sammeln Sie den Überstand und füllen Sie ihn in ein neues Röhrchen um.Dann fügen Sie 1% von 300 Millimol Natriumdihydrogenphosphat zu den extrazellulären Vesikelproben hinzu und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren. Übertragen Sie 200 Mikroliter der Mischungslösung auf eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie die 96-Well-Platte im Mikroplatten-Reader bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie den Plattenleser so ein, dass er jede Minute die Absorption bei einer Wellenlänge von 340 Nanometern aufzeichnet.Pipettieren Sie 300 Mikroliter der Kollagenlösung in jede Vertiefung eines Kammerglases mit acht Vertiefungen und inkubieren Sie 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation 300 Mikroliter DMEM als Kontrolle in die Vertiefungen geben. Fügen Sie 300 Mikroliter der zuvor gesammelten extrazellulären Vesikelmediumproben zu den verbleibenden Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie sechs Tage lang, wie zuvor gezeigt.Am 10. Tag pipettieren Sie 2,5 Mikroliter der Mischung aus OsteoSense und DMEM in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Am Ende der Inkubation werden die Hydrogele mit Filtern für die OsteoSense-Fluoreszenz mit einem inversen Mikroskop durch den Boden einer Deckglaskammer oder von oben mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand abgebildet. Beurteilen Sie die Anzahl der Verkalkungen und die Verkalkungsgröße sowie die gesammelten Bilder mit den in ImageJ verfügbaren Partikelanalyseoptionen.Navigieren Sie dann zu Bild, wählen Sie Anpassen und klicken Sie auf Schwellenwert, um die Bilder so zu binarisieren, dass nur das OsteoSense-Signal weiß angezeigt wird. Verwenden Sie dann den Befehl "Analysieren" und klicken Sie auf "Partikel analysieren", um Informationen zu jeder Verkalkung im Bild abzurufen. Verwenden Sie für jedes analysierte Bild dieselben Schwellenwertparameter, um die Konsistenz zu gewährleisten.Die optische Nahinfrarot-Scanner-Bildgebung der präparierten Aorten zeigte ein höheres OsteoSense-Signal in der gesamten Aorta einer Maus mit chronischer Nierenerkrankung als die beiden Aorten von Kontrollmäusen. Das konditionierte Medium, das aus glatten Gefäßmuskelzellen gewonnen wurde, die in einem prokalzifizierenden Medium kultiviert wurden, zeigte bei 340 Nanometern eine höhere Absorption als das Kontrollmedium. Der Absorptionsanstieg trat in der Pro-Kalk-Probe 1,5-fach schneller auf als in einer Kontrollprobe.Das konditionierte Medium aus Zellen, die unter kalknahen Bedingungen kultiviert wurden, enthielt mineralische Ablagerungen. Bei der Mikrodissektion der Aorta ist es wichtig, das Fett, das die Aorta umgibt, sorgfältig zu schneiden. Sie möchten, dass so viel wie möglich von der Aorta analysiert wird, aber das kann ziemlich mühsam sein.Sobald EVs isoliert sind, könnten zusätzliche Tests, wie z. B. ein alkalischer Phosphatase-Aktivitätstest oder ein Immunkörper, durchgeführt werden. Diese Tests würden die Mechanismen und Proteine, die in EVs vorhanden sind, weiter aufzeigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Färbetechnik zur Beurteilung der arteriellen medialen Verkalkung der vaskulären glatten Muskelzellen in vitro. Die von-Kossa-Methode nutzt eine photochemische Reaktion, um metallisches Silber an den Verkalkungsstellen abzuscheiden und eine schwarze Färbung zu verleihen.

Von-Kossa-Färbung von glatten Zellen der Aortengefäßmuskulatur: Eine in vitro-Technik zur Beurteilung der Verkalkung der arteriellen Medialschicht

Quelle: Hakim, M. A. et al., Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Maus-Hirn-Parenchyms. J. Vis. Exp. (2022). Dieses Video zeigt die funktionelle Analyse einer arteriolären Endothelröhre, die aus einem Mausgehirn isoliert wurde. Es werden die Schritte zur Messung des intrazellulären Kalziumspiegels und des Membranpotentials sowohl zu Studienbeginn als auch als Reaktion auf pharmakologische Stimulation beschrieben.

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Analyse der extrazellulären Vesikel-vermittelten Gefäßverkalkung mittels In-vitro- und In-vivo-Modellen

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