Name: Antikörperaufnahme-Assay zur Verfolgung der Notch/Delta-Endozytose während der asymmetrischen Teilung von radialen Zebrafisch-Gliavorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie einen Antikörperaufnahme-Assay zur Untersuchung der Notch/Delta-Endozytose in radialen Glia-Vorläuferzellen des embryonalen Zebrafisch-Gehirns. Diese Methode ermöglicht präzises Imaging und Tracking von Liganden während der asymmetrischen Zellteilung.

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Das Projekt wurde von NIH R01NS120218, dem UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation und Chan Zuckerberg Biohub unterstützt.

Für die Studie haben wir die AB-Wildtyp-Linie und die transgene Linie Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] verwendet. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of California, San Francisco, USA genehmigt (Zulassungsnummer: AN179000).
1. Präparation von Zebrafischembryonen
<ol><li>Stellen Sie am Nachmittag vor 17:00 Uhr Fischkreuzungsbecken mit einem weiblichen Wildtyp-Fisch und einem männlichen Tg [ef1a:Myr-Tdtomato]- Fisch auf, indem Sie sie in jedem Becken mit Trennwänden trennen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Trennwände am nächsten Morgen vor 11:00 Uhr von allen Kreuzungstanks. Seien Sie ruhig und stören Sie die Fische nicht bei der Paarung. Das Laichen erfolgt in der Regel innerhalb von 30 Minuten nach dem Entfernen der Trennwände. Die befruchteten Eier verbleiben auf dem Boden des Aquariums.<ol><li>Sammeln Sie befruchtete Eier aus den Tanks mit einem Netzfilter. Übertragen Sie die Eizellen, indem Sie sie in eine mit Eiwasser gefüllte Petrischale abwaschen, und untersuchen Sie die Embryonen unter einem Seziermikroskop mit 10- bis 20-facher Vergrößerung.</li>
	</ol></li>
	<li>Die befruchteten Embryonen werden mit Pasteurpipetten aus Glas mit großem Durchmesser in eine saubere Petrischale mit ca. 20 ml Embryonenmedium (100 ml 1.000-fache Stammlösung enthält 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H2O und 8,13 g MgSO 4,7H2O) übertragen. Bewahren Sie die Embryonen bei 28 °C auf. Bewahren Sie 50 befruchtete Embryonen pro Petrischale mit 30 ml Embryonenmedium bei 28,5 °C auf. HINWEIS: Ein Fischpaar produziert normalerweise 100-300 Embryonen, und die Befruchtungs- und Überlebensrate gesunder Embryonen liegt bei jeder Paarung bei über 95%.</li>
	<li>Am nächsten Morgen nehmen Sie die Embryonen um 8:00 Uhr aus dem Inkubator, wenn die Embryonen das Entwicklungsstadium von ~18-20 h nach der Befruchtung (hpf) erreicht haben. Beobachten Sie sie unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung, zunächst mit weißem Licht. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Zebrafischembryonen im Stadium von 20 Somiten.<ol><li>Entsorgen Sie tote Embryonen, die trüb oder geplatzt sind, unter dem Mikroskop mit einer Glaspipette.</li>
	</ol></li>
	<li>Schalten Sie die Leuchtstofflampe ein und wählen Sie die RFP-Filtereinstellung des Mikroskops. Wählen Sie dann die Embryonen mit starker roter Fluoreszenz aus und geben Sie sie in eine neue Schale mit Eiwasser.<ol><li>Dechorionisieren Sie die Embryonen manuell mit zwei feinen Pinzetten (die Pinzettenspitzen sollten scharf und unbeschädigt sein) unter weißem Licht (Materialtabelle).</li>
		<li>Halten Sie das Chorion mit einer Pinzette fest und machen Sie mit der anderen Pinzette einen Riss in das Chorion. Öffnen Sie den Riss vorsichtig mit der Pinzette und machen Sie ihn groß genug, damit der Embryo hindurchgehen kann, indem Sie den Embryo vorsichtig mit den Spitzen der anderen Pinzetten drücken.</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragen Sie die dechorionierten Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem embryonalem Medium, um sie vor der Mikroinjektion schnell zu spülen.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Mikroinjektion
<ol><li>Verwenden Sie die Kapillaren (1,2 mm AD, 0,9 mm ID, mit Filament) zum Ziehen von feinen Injektionsnadeln auf einem Abzieher. Entwerfen und optimieren Sie das Zugprogramm gemäß dem Handbuch.</li>
	<li>Öffnen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette unter einem Stereo-Präpariermikroskop. Achten Sie darauf, dass der Durchmesser der Spitze etwa 10 μm und der Verjüngungswinkel etwa 30° beträgt.</li>
	<li>Vor der Injektion wird der monoklonale Anti-DLD-Antikörper der Maus mit dem Anti-Maus-IgG-Atto647N konjugiert.<ol><li>Mischen Sie für jedes Injektionsexperiment 0,5 μl des Anti-Dld-Antikörpers (0,5 mg/ml) mit 2 μl des Anti-Maus-IgG-Atto647N-Antikörpers (1 mg/ml) durch 5-10-maliges Pipettieren. Dann mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur (oder 2-3 Stunden auf Eis) inkubieren.</li>
		<li>Nach der Inkubation fügen Sie der Antikörpermischung 2,5 μl Blockierungspuffer (10 mg/ml Maus-IgG) und 0,5 μl 0,5 % Phenolrot hinzu und pipettieren Sie 10x, um gründlich zu mischen, um alle in der Mischung verbleibenden unkonjugierten Antikörper zu blockieren. HINWEIS: Bereiten Sie für jede Studie eine zusätzliche Mischung ohne den Anti-Dld-Antikörper vor und verwenden Sie sie als Kontrolle.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie 1%ige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt im Embryomedium vor. Die in Agarose enthaltene Mischung bei 70 °C erhitzen, bis die Masse durchsichtig wird.<ol><li>Aliquotieren Sie die Agaroselösung in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Aliquots in einem Heizblock bei ~40 °C auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Spülen Sie den Embryo in dem Röhrchen mit 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt 3 s lang aus.</li>
	<li>Legen Sie den Embryo zusammen mit einzelnen Tropfen Agarose (~30-40 μL) auf einen umgedrehten Petrischaledeckel aus Kunststoff, um jeden Embryo separat auf dem Deckel zu befestigen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Legen Sie die Embryonen flach seitlich in die Agarose und halten Sie diese Position, bis die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt ist.</li>
	<li>Montieren Sie 12 Embryonen in drei Reihen, einen nach dem anderen, wie oben. Bedecken Sie alle montierten Embryonen in der Agarose mit Eimedium.</li>
</ol>3. Mikroinjektion
<ol><li>Legen Sie die eingebetteten Embryonen unter das Stereomikroskop und bedecken Sie die Agarose mit Eiwasser.</li>
	<li>Stellen Sie den Luftdruckinjektor zusammen mit Mikromanipulatoren ein und platzieren Sie sie in der Nähe der Mikroskope, wie in Abbildung 1 gezeigt. Verwenden Sie die Stahlgasflasche mit gasförmigem Stickstoff (N2) unter hohem Druck als Luftquelle.<ol><li>Öffnen Sie das Gasventil erst, nachdem die Embryonen in die Agarose eingesetzt wurden. Legen Sie dann die vorbereitete Glasnadel mit 2 μl Antikörpermischung auf den Mikromanipulator, wie in Abbildung 1 gezeigt, wenn Sie das Frontfill-Modul des Mikroinjektors verwenden.</li>
		<li>Stellen Sie den Eingangsdruck auf ~80-90 psi und den Einspritzdruck auf ~20 psi ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit einem Mikrometer unter dem Mikroskop, wie zuvor beschrieben15. Stellen Sie die Dauer der Abstimmungszeit auf 10 ms bis 120 ms ein, je nach Größe der Nadelöffnung. Geben Sie jeden Injektionsimpuls ab, indem Sie auf das Paddel tippen. Stellen Sie das Injektionsvolumen jeder Abgabe auf ~4-5 nL ein.</li>
	<li>Stechen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel durch die dorsale Dachplatte des Hinterhirns hinter dem r0/r1-Scharnierpunkt und injizieren Sie etwa 10 nL (zwei oder drei Impulse) Antikörpermischung, ohne das Gehirngewebe zu treffen. Beobachte das Fließen roter Flüssigkeiten in der Hirnkammer. Anmerkung: Der Hinterhirnventrikel befindet sich hinter der Hinterhirngrenze. Das injizierte phenolrothaltige Antikörpergemisch füllt die Hirnkammer vom Hinterhirn bis zum Vorderhirn sofort auf, indem es mit Liquor diffundiert.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Injektion die Nadelspitze schnell vom Embryo, indem Sie den Knopf des Mikromanipulators drehen. Für eine erfolgreiche Injektion verbleibt der rote Farbstoff der injizierten Mischung stabil in der Hirnkammer, ohne in die umgebende Agarose auszutreten.</li>
	<li>Bewegen Sie die Montageplatte unter das Mikroskop, um einen anderen montierten Embryo an einer geeigneten Position für Wiederholungen zu lokalisieren.<ol><li>Nachdem Sie sechs bis acht Embryonen injiziert haben, schälen Sie die Agarose mit einem mikrochirurgischen Messer, um die Embryonen aus der eingebetteten Agarose zu lösen. Übertragen Sie die mikroinjizierten Embryonen in eine frische Schale mit 30 ml Embryomedium und legen Sie sie für die nächsten Schritte bei Raumtemperatur auf.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Montage und Zeitraffer-Live-Aufnahme
<ol><li>Nach 30 Minuten werden die ausgewählten Embryonen in 10 ml Embryonenmedium übertragen. Fügen Sie 420 μl Tricain-Stamm (4 mg/ml) zu 10 ml Embryomedium hinzu, um die Embryonen zu betäuben.</li>
	<li>Um die Embryonen zu montieren, bereiten Sie eine 0,8%ige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt vor, die die gleiche Konzentration an Tricain im Röhrchen enthält. Bewahren Sie die Aliquots in einem Heizblock bei ~40 °C auf.</li>
	<li>Tauchen Sie die injizierten Embryonen mit einer Glaspipette 3 s lang in die warme Agarose. Nehmen Sie dann sofort die Embryonen mit derselben Glaspipette aus der Agarose und legen Sie die Embryonen mit einem Tropfen Agarose aus dem Röhrchen in die Mitte von 35-mm-Glasbodenkulturschalen. Legen Sie nur einen Embryo pro Tropfen auf das Glas.</li>
	<li>Richten Sie die Embryonen vorsichtig mit einer Fasersonde oder einer Ladespitze aus, um die dorsale Seite des embryonalen Gehirns so nah wie möglich am Glasboden zu halten. Stellen Sie die Position des Embryos sanft ein, um den Embryo zu dehnen, ohne sich zu kräuseln, während sich die Agarose allmählich verfestigt.</li>
	<li>Überprüfen Sie anschließend die Position des Embryos, indem Sie die Glasbodenschale umdrehen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte dorsale Vorderhirn mit den korrekt montierten Embryonen unter dem Mikroskop zu sehen ist.</li>
	<li>Fügen Sie 2-3 ml 28,5 °C vorgewärmtes embryonales Medium hinzu, das Tricain enthält, um den Embryo zu bedecken. Stellen Sie die Schüssel richtig auf den temperaturgesteuerten Tisch des konfokalen Mikroskops, wie in Abbildung 1 gezeigt. Stellen Sie die Temperatur der Bildkammer auf 28,5 °C ein. Der Embryo ist nun bereit für die Bildgebung.</li>
	<li>Führen Sie Zeitraffer-Live-Aufnahmen mit einem festen Zeitintervall mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv durch.<ol><li>Verwenden Sie die Bildgebungs- und Mikroskopsteuerungssoftware (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.</li>
		<li>Wählen Sie die Bildgebungskanäle von 564 nm und 647 nm für die Abbildung der Membranfluoreszenz von MyR-Tdtomato transgenen Zebrafischen und endosomalem anti-Dld-Atto647N in der Zelle (Abbildung 1).</li>
		<li>Stellen Sie die Laserleistung für beide Kanäle auf 30 % ein. Verwenden Sie für jeden Kanal eine Belichtungszeit pro z-Ebene von 200 ms.</li>
		<li>Verwenden Sie für jeden montierten Zebrafischembryo einen Scanning-Z-Schritt von 1 μm für insgesamt 20 z-Ebenen und einen Scanzyklus von 100 Zeitrahmen.</li>
		<li>Stellen Sie das Zeitintervall zwischen den einzelnen Scanzyklen auf 20 s und den Scanmodus als Kanal, Slice ein.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
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<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
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<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir haben einen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt, mit dem der endosomale Notch/Delta-Transport in radialen Gliavorläuferzellen von Zebrafischen mit hoher Effizienz markiert und abgebildet werden kann. Im Vergleich zu früheren Methoden, die zur Verfolgung markierter Anti-DeltaD-Antikörper in Drosophila-SOP-Zellenverwendet wurden 7,8, verwendete unsere Methode die Mikroinjektion anstelle der Inkubation von Proben im konjugierten Antikörper. Fluoreszenzkonjugier...

Der Notch-Signalweg steuert die Entscheidung über das Zellschicksal und die Musterbildung während der Entwicklung in Metazoen1, und neuere Studien haben gezeigt, dass der Notch-Signalweg bei der Stammzellteilung hauptsächlich vom endozytären Transport abhängt 2,3. Endozytosiertes Notch/Delta kann den Notch-Signalweg im Zellkern aktivieren und die Transkription der Notch-Zielgene 4,5,6 verbessern. Directional Notch/Delta endosomaler Transport wurde erstmals in Drosophila-Sinnesorgan-Vorläuferzellen (SOP) während der asymmetrischen Zellteilung (ACD) beobachtet, was zu einer höheren Notch-Signalaktivität in pIIa als in pIIbführte 7,8. Antikörperaufnahme-Assays mit Anti-Delta- und Anti-Notch-Antikörpern wurden eingesetzt, um den endozytären Prozess in mitotischen SOP-Zellen zu überwachen. Notch/DeltaD-Endosomen bewegen sich während der Zytokinese zusammen mit einem Kinesin-Motorprotein zur zentralen Spindel und werden aufgrund der antiparallelen Anordnung der asymmetrischen Zentralspindel im letzten Moment der Zellteilung asymmetrisch in die pIIa-Zelle transloziert 3,8. Diese Studien haben Aufschluss über die molekularen Mechanismen gegeben, die die asymmetrische Teilung in Drosophila-SOP-Zellen regulieren, aber es ist unklar, ob ähnliche endozytäre Prozesse in radialen Gliavorläuferzellen (RGPs) von Wirbeltieren ablaufen.
Darüber hinaus sind die molekularen Mechanismen, die den asymmetrischen Notch/DeltaD-Signalweg während der RGP-Teilung von Wirbeltieren regulieren, nicht gut verstanden. Im Zebrafisch wurde berichtet, dass die Interaktion von Notch und Delta die Endozytose des DeltaD-Liganden9 erleichtert. Es ist nicht bekannt, ob die DeltaD-Endozytose die Wahl des Zellschicksals von Tochterzellen im sich entwickelnden Wirbeltiergehirn beeinflussen kann. Neuere Studien zeigen, dass die Injektion fluoreszenzkonjugierter Anti-DeltaD-Antikörper in das Neuralrohr Sara-Endosomen spezifisch in Neuroepithelzellen markieren könnte, und Anti-DeltaD-haltige Sara-Endosomen segregieren bevorzugt in proliferierende Tochterzellen10. Es wurde vermutet, dass der Notch-Signalweg von den Endosomen das Schicksal der Tochterzellen regulieren könnte. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass die meisten RGP-Zellen des Zebrafisches im sich entwickelnden Vorderhirn einer ACD unterziehen, und die Bestimmung des Schicksals der Tochterzellen hängt von der intralinearen Notch/DeltaD-Signaltransduktionab 11. Um die Natur des Intralineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in Zebrafisch-RGPs aufzuklären, haben wir den Anti-DeltaD-Antikörper-Aufnahme-Assay im sich entwickelnden Gehirn von Zebrafischen entwickelt. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich Live-Markierungen und Bildgebungen des endozytären DeltaD-Transports in mitotischen RGPs durchgeführt.
Der fluoreszenzmarkierte Anti-DeltaD-Antikörper wird entlang des Vorderhirnventrikels effizient in die RGPs internalisiert. Es hat die Entdeckung des gerichteten Transports von DeltaD-Endosomen in den asymmetrisch teilenden RGPs erheblich erleichtert12,13. Im Vergleich zu früheren Antikörperaufnahmeprotokollen, die für Drosophila notum-Kulturen und das Rückenmark des Zebrafisches entwickelt wurden 10, hat dieses Protokoll eine lang anhaltende und hocheffiziente Anti-DeltaD-Markierung in der Zellschicht des Hirnventrikels erreicht, insbesondere mit weniger als10 nL mikroinjizierter Antikörpermischung. Die Injektion des Hinterhirnventrikels ist sehr praktisch für die Anwendung des Antikörperaufnahmetests im sich entwickelnden Gehirn, da der Hinterhirnventrikel in Zebrafischembryonen gut erweitert und im frühen Entwicklungsstadium mit Liquor cerebrospinalis gefüllt ist14. Durch die Injektion des Antikörpergemisches in die Hinterhirnkammer, ohne wichtige sich entwickelnde Gewebe zu verletzen, hat das Protokoll eine mögliche Schädigung der Bildgebungszone im Vorderhirn so weit wie möglich minimiert. Die reduzierte Dosis des injizierten Primärantikörpers hat auch mögliche Nebenwirkungen einer Störung des endogenen Delta-Notch-Signalwegs in vivo vermieden. Dieses Protokoll kann leicht mit anderen pharmakologischen oder genetischen Störungen kombiniert, in verschiedenen Entwicklungsstadien eingesetzt und möglicherweise an das erwachsene Gehirn sowie an aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene 2D/3D-Gehirnorganoide angepasst werden. Zusammenfassend hat das Protokoll es möglich gemacht zu verstehen, wie und wann eine Notch-Signalasymmetrie während der ACD entsteht. Die größte Herausforderung für die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls besteht darin, eine präzise Abgabe geeigneter Konzentrationen des Antikörpers auf der Grundlage spezifischer experimenteller Bedingungen zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>35mm Kulturschale mit Glasboden&nbsp;</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Luftdruck-Injektor&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG-Atto647N&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren, 1,2 mm AD, 0,9 mm ID, mit Filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield</td><td>Nikin N</td><td>/A</td><td>Nikon&nbsp; Ti Inverses Fluoreszenzmikroskop mit CSU-W1 großem Sichtfeldkonfokal.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont Medical Pinzette Style 5</td><td>Thomas Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown P897 Abzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Dld&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG blockierender Puffer von Zenon</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&nbsp; &nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

antikörperaufnahme-assay zur verfolgung der notch/delta-endozytose während der asymmetrischen teilung von radialen zebrafisch-gliavorläuferzellen

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

Die asymmetrische Zellteilung (ACD), bei der zwei Tochterzellen mit unterschiedlichem Schicksal entstehen, ist grundlegend für die Erzeugung zellulärer Vielfalt. In den sich entwickelnden Organen sowohl von Wirbellosen als auch von Wirbeltieren erzeugen asymmetrisch sich teilende Vorläuferzellen einesich selbst erneuernde und einesich differenzierende Tochter. Im embryonalen Zebrafischgehirn durchlaufen radiale Gliavorläuferzellen (RGPs) - die wichtigsten neuralen Stammzellen von Wirbeltieren - meist eine ACD, um ein RGP und ein differenzierendes Neuron zu gebären. Die optische Klarheit und die leichte Zugänglichkeit von Zebrafischembryonen machen sie ideal für In-vivo-Zeitrafferaufnahmen, um direkt zu visualisieren, wie und wann die Asymmetrie des Notch-Signalwegs während der ACD hergestellt wird. Neuere Studien haben gezeigt, dass die dynamische Endozytose des Notch-Liganden DeltaD eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Zellschicksals während der ACD spielt und durch den evolutionär konservierten Polaritätsregulator Par-3 (auch bekannt als Pard3) und den Dynein-Motorkomplex reguliert wird. Um die in vivo Transportmuster von Notch-Signal-Endosomen in mitotischen RGPs sichtbar zu machen, haben wir diesen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt. Mit Hilfe des Assays haben wir die Dynamik von DeltaD-haltigen Endosomen während der RGP-Teilung aufgedeckt.

In Abbildung 2A zeigten die Embryonen, denen Atto647N injiziert wurde, ohne an den primären Antikörper zu binden, eine Hintergrundfluoreszenz im Hirnventrikel. In den Zellen sind nur sehr wenige verschlungene fluoreszierende Partikel zu beobachten. Die anti-Dld-Atto647N injizierten Zebrafischembryonen zeigten große Mengen internalisierter fluoreszierender Partikel in den meisten Zellen des sich entwickelnden Vorderhirns (Abbildung 2A, rechtes Bild). Nach dem Zoo...

In dieser Arbeit wird ein Antikörper-Aufnahme-Assay für die Bildgebung des Intra-Lineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in sich teilenden radialen Gliavorläuferzellen des embryonalen Zebrafischgehirns entwickelt.

Antikörperaufnahme-Assay zur Verfolgung der Notch/Delta-Endozytose während der asymmetrischen Teilung von radialen Zebrafisch-Gliavorläuferzellen

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

Der Notch-Signalweg steuert die Sulfatentscheidung und die Musterbildung während der Entwicklung in Metazoen. Wir haben einen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt, um den Notch-Liganden delta-D zu markieren und seinen endozytären Transport in radialen Gliavorläuferzellen im sich entwickelnden Vorderhirn von Zebrafischen abzubilden. Die ventrikuläre Injektion des versteckten Gehirns des Zebrafisches ermöglicht die selektive Aufnahme von Anti-Dld-Atto-647N durch myototische radiale Gliavorläuferzellen, die die in der Entwicklung befindlichen Hirnventrikel auskleiden, mit hoher Effizienz und lang anhaltender Wirkung.Dieses Protokoll kann leicht mit anderen pharmakologischen oder genetischen Störungen kombiniert werden, die in verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet werden und möglicherweise an das erwachsene Gehirn sowie an aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene 2D- oder 3D-Gehirnorganoide angepasst werden. Nachdem Sie die befruchteten Embryonen erzeugt und 18 bis 20 Stunden lang inkubiert haben, nehmen Sie sie aus dem Inkubator. Betrachten Sie sie unter einem Epifluoreszenzmikroskop mit weißem Licht zunächst bei 20-facher Vergrößerung.Entsorgen Sie tote Embryonen, die unter dem Mikroskop trüb oder geplatzt erscheinen, mit einer Glaspipette. Schalten Sie dann die Leuchtstofflampe ein und wählen Sie die RFP-Filtereinstellung des Mikroskops. Wählen Sie die Embryonen mit starker roter Fluoreszenz aus und geben Sie sie in eine neue Schale mit Eiwasser.Nun entchorionisieren Sie die Embryonen manuell mit zwei feinen Pinzetten unter weißem Licht. Halten Sie das Chorion mit einer Pinzette fest und machen Sie mit der anderen Pinzette einen Riss in das Chorion. Öffnen Sie den Riss vorsichtig mit der Pinzette und machen Sie ihn groß genug, damit der Embryo hindurchgehen kann, indem Sie den Embryo vorsichtig mit den Spitzen der anderen Pinzette drücken.Übertragen Sie die dechorionierten Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem embryonalem Medium, um sie vor der Mikroinjektion schnell zu spülen. Nachdem Sie feine Injektionsnadeln an einem Abzieher gezogen haben, öffnen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette unter einem Stereodissektionsmikroskop. Machen Sie den Durchmesser der Spitze auf etwa 10 Mikrometer und den Verjüngungswinkel auf etwa 30 Grad.Mischen Sie nun 0,5 Mikroliter des Anti-Dld-Antikörpers mit zwei Mikrolitern des Anti-Maus-Antikörpers L G Atto-647N durch fünfmaliges Pipettieren, um sie zu konjugieren, und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation fügen Sie der Antikörpermischung 2,5 Mikroliter Blockierungspuffer und 0,5 Mikroliter 0,5%Phenolrot hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren, um alle in der Mischung verbleibenden unkonjugierten Antikörper zu blockieren. Als nächstes bereiten Sie 1%Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt im Embryomedium vor.Erhitzen Sie die Agarose-haltige Mischung bei 70 Grad Celsius, bis die Mischung durchsichtig wird. Nachdem Sie die Agaroselösung aliquotiert haben, bewahren Sie sie in einem Wärmeblock bei 40 Grad Celsius auf. Spülen Sie den Embryo drei Sekunden lang in dem Röhrchen aus, das 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt enthält.Legen Sie den Embryo auf einen umgekehrten Petrischaledeckel aus Kunststoff mit einzelnen Agarosetropfen, um jeden Embryo separat zu montieren. Legen Sie die Embryonen flach seitlich in die Agarose und halten Sie diese Position, bis die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt ist. Bedecken Sie alle montierten Embryonen in der Agarose mit Eimedium.Legen Sie die eingebetteten Embryonen unter das Stereomikroskop und bedecken Sie die Agarose mit Eiwasser. Stellen Sie den Luftdruckinjektor mit Mikromanipulatoren ein und platzieren Sie sie in der Nähe der Mikroskope. Verwenden Sie die Stahlgasflasche, die gasförmigen Stickstoff unter hohem Druck enthält, als Luftressource.Sobald die Embryonen in die Agarose eingesetzt wurden, öffnen Sie das Gasventil. Während Sie das Frontfill-Modul des Mikroinjektors verwenden, laden Sie die vorbereitete Glasnadel mit zwei Mikrolitern Antikörpermischung auf den Mikromanipulator. Stellen Sie nun den Eingangsdruck auf 80 bis 90 Pfund pro Quadratzoll und den Einspritzdruck auf 20 Pfund pro Quadratzoll ein.Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit einem Mikrometer unter dem Mikroskop. Stellen Sie die Dauer der Abstimmungszeit entsprechend der Größe der Nadelöffnung von 10 bis 120 Millisekunden ein. Tippen Sie auf das Paddel, um jeden Injektionsimpuls abzugeben, und stellen Sie das Injektionsvolumen jeder Injektion auf vier bis fünf Nanoliter ein.Stechen Sie dann die Spitze der Mikroinjektionsnadel durch die dorsale Dachplatte des Hinterhirns, hinter dem Rondimer-Null-Eins-Scharnierpunkt, und injizieren Sie etwa 10 Nanoliter Antikörpermischung, ohne das Hirngewebe zu treffen. Beobachtete den Fluss roter Flüssigkeiten in der Hirnkammer. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadelspitze schnell vom Embryo, indem Sie den Knopf des Mikromanipulators drehen.Für eine erfolgreiche Injektion verbleibt der rote Farbstoff der injizierten Mischung stabil in der Hirnkammer, ohne in die umgebende Agarose auszutreten. Bewegen Sie die Montageplatte unter das Mikroskop, um einen anderen montierten Embryo an einer geeigneten Position für Wiederholungen zu lokalisieren. Nachdem Sie sechs bis acht Embryonen injiziert haben, schälen Sie die Agarose mit einem mikrochirurgischen Messer, um die Embryonen aus der eingebetteten Agarose zu lösen.Übertragen Sie die mikroinjizierten Embryonen in eine frische Schale mit 30 Millilitern Embryomedium und legen Sie sie für die nächsten Schritte auf Raumtemperatur. Nach 30 Minuten werden die ausgewählten Embryonen in 10 Milliliter Embryomedium übertragen. Um die Embryonen zu montieren, bereiten Sie Agarose mit 0,8 % niedrigem Schmelzpunkt vor, die die gleiche Konzentration an Trican im Röhrchen enthält.Tauchen Sie die injizierten Embryonen mit einer Glaspipette drei Sekunden lang in die warme Agarose. Dann werden die Embryonen sofort mit der gleichen Glaspipette aus der Agarose entnommen und die Embryonen mit einem Tropfen Agarose aus dem Röhrchen in die Mitte von 35-Millimeter-Glasbodenkulturschalen gelegt. Richten Sie die Embryonen vorsichtig mit einer Fasersonde oder einer Belastungsspitze aus, um die dorsale Seite des embryonalen Gehirns so nah wie möglich am Glasboden zu halten.Drehen Sie die Position des Embryos vorsichtig, um den Embryo zu dehnen, ohne sich zu kräuseln, während sich die Agarose allmählich verfestigt. Überprüfen Sie anschließend die Position des Embryos, indem Sie die Glasbodenschale umdrehen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte dorsale Vorderhirn mit den korrekt montierten Embryonen unter dem Mikroskop zu sehen ist.Fügen Sie zwei bis drei Milliliter 28,5 Grad Celsius warmes embryonales Medium hinzu, das Trican enthält, um den Embryo zu bedecken. Stellen Sie die Schüssel richtig auf den temperaturgesteuerten Tisch des konfokalen Mikroskops und stellen Sie die Temperatur der Bildgebungskammer auf 28,5 Grad Celsius ein. Der Embryo ist nun bereit für die Bildgebung.Die injizierten Atto-647N-Embryonen zeigten eine Hintergrundfluoreszenz im Hirnventrikel. Die anti-Dld-Atto-647N injizierten Zebrafischembryonen zeigten große Mengen internalisierter fluoreszierender Partikel in den meisten Zellen des sich entwickelnden Vorderhirns. Zeitrafferaufnahmen zeigten die Bewegung intrazellulärer Anti-Dld-Atto-647N-Endosomen während der Zellteilung.Die meisten mitotischen radialen Gliavorläuferzellen zeigten eine anteriore oder posteriore asymmetrische Segregation von anti-Dld-Atto-647N-Endosomen in zwei Tochterzellen. Die Asymmetrie stabilisierte sich gegen Ende der Anaphase, was zu einer asymmetrischen Vererbung von Notch-Signal-Endosomen durch die Tochterzellen führte. Stellen Sie sicher, dass die Nadel an der richtigen Stelle in den versteckten Markenventrikel eingeführt wurde, und prüfen Sie, ob nach der Mikroinjektion eine Leckage vorliegt.Neben der Markierung des Notch-Delta-Signalwegs ist das Protokoll auch für die Markierung anderer Membranproteine oder extrazellulärer Proteine mit ähnlichen Strategien geeignet, wenn ein guter Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne verfügbar ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Antikörperaufnahme-Assay zur Verfolgung der Notch/Delta-Endozytose während der asymmetrischen Teilung von radialen Zebrafisch-Gliavorläuferzellen (Video) | JoVE Journal

Antikörperaufnahme-Assay zur Verfolgung der Notch/Delta-Endozytose während der asymmetrischen Teilung von radialen Zebrafisch-Gliavorläuferzellen

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