Adipozyten-spezifischer ATAC-Seq mit Fettgewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

ATAC-seq ist eine leistungsfähige Technik, um die regulatorischen Mechanismen der Genexpression zu verstehen. Fettgewebe ist mit dieser Technik jedoch aufgrund des hohen Lipidgehalts, der hohen mitochondrialen Kontamination und der zellulären Heterogenität schwierig. In diesem Protokoll wurde eine adipozytenspezifische ATAC-Sequenzierung mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung durchgeführt, die qualitativ hochwertige Daten mit minimaler mitochondrialer DNA-Kontamination liefert.

Diese Methode kann auch in anderen Geweben eingesetzt werden, in denen zelltypspezifische Cre-Mauslinien mit nukleären transgenen Reporterlinien zur Verfügung stehen. Beginnen Sie mit der Zellkernisolierung, indem Sie die Glas-Dounce-Homogenisatoren auf Eis mit einem Glas Dounce pro Probe kühlen. Geben Sie dann 7 Milliliter der NPB-Mischung in jedes Glas Dounce.

Geben Sie dann 50 bis 100 Milligramm gefrorenes Fettgewebe in das Glas Decounce und schneiden Sie es mit einer langen Schere in einige kleinere Stücke. Schlagen Sie 10 Mal mit einem losen Stößel für alle Proben und dann 10 Mal mit einem festen Stößel. Filtern Sie den Inhalt durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen, bevor Sie die filtrierten Homogenate zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.

Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern PBS-N durch sanftes, aber gründliches Klopfen mit den Fingern. Anschließend wird die Suspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen gefiltert und das Sieb mit 250 Mikrolitern PBS-N gespült. Überführen Sie die filtrierte Kernsuspension mit einer Mikropipette in ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortier- oder FACS-Röhrchen.

Bereiten Sie das Sammelröhrchen vor, indem Sie 500 Mikroliter PBS-N in das neue 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und es einige Male umdrehen, um alle Innenflächen mit dem Puffer zu benetzen. Drehen Sie die Röhrchen kurz, um die gesamte Flüssigkeit nach unten zu bringen, bevor Sie sie bis zum Sortieren auf Eis legen. Verwenden Sie für FACS die FSC-A/FSC-H-Anspritzung für Einzelstücke und FSC-A/SSC-A für die Entfernung von kleinem oder großem Schmutz.

Gate für die mCherry/GFP-positive Adipozytenkernpopulation und sammeln Sie 10.000 Kerne in jedem zuvor präparierten Sammelröhrchen. Für die Kernvorbereitung nach der Sortierung geben Sie 500 Mikroliter PBS-N in jedes Sammelröhrchen und mischen Sie es, indem Sie das Röhrchen einige Male umdrehen, bevor Sie die Sammelröhrchen bei 200 G für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vollständig.

Um 25 Mikroliter Tn5-Mastermischung herzustellen, mischen Sie 12,5 Mikroliter 2x Tagmentations-DNA-Puffer oder TD-Puffer, 1,25 Mikroliter Tn5-Transposase oder TDE I-Enzym und 11,25 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Als nächstes geben Sie 25 Mikroliter Tn5-Mastermischung zu jedem Zellkernpellet und resuspendieren es durch sanftes Pipettieren. Bei 600 U/min für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit einem Thermomischer inkubieren.

Fügen Sie 25 Mikroliter nukleasefreies Wasser zu den 25 Mikrolitern der Mischung der Tn5-Kernresuspension hinzu, so dass das endgültige Volumen 50 Mikroliter beträgt. Fügen Sie dann 250 Mikroliter Puffer PB und 5 Mikroliter 3 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,2 hinzu. Nachdem Sie die Mischung in eine Säule umgefüllt haben, die mit dem referenzierten Kit geliefert wurde, zentrifugieren Sie sie bei 17.900 G für 1 Minute bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, setzen Sie eine Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelröhrchen ein. 750 Mikroliter Puffer-PE mit absolutem Ethanol in das Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Säule, verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelröhrchen ein.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entsorgen Sie das Sammelröhrchen mit dem Durchfluss. Um die transponierten DNA-Fragmente zu amplifizieren, wird die PCR-Mastermischung ohne Zugabe eines eindeutigen Ad2 hergestellt. n Barcode-Fibel.

Führen Sie die PCR aus. Führen Sie die quantitative PCR oder qPCR durch. Überprüfen Sie die Amplifikationskurven und ermitteln Sie die Anzahl der zusätzlich benötigten PCR-Zyklen, indem Sie die Anzahl der Zyklen schätzen, die etwa 35 % des Maximums erreicht haben.

Verwenden Sie die Berechnungen, um die PCR für die verbleibenden 45 Mikroliter der PCR-Reaktion durchzuführen. Bei den früheren Verfahren werden die amplifizierten DNA-Fragmente mit 20 Mikrolitern EB-Puffer eluiert. Übertragen Sie die eluierte DNA in ein neues PCR-Röhrchen und stellen Sie das Volumen durch Zugabe von 80 Mikrolitern Puffer-EB auf 100 Mikroliter ein. Als nächstes fügen Sie 55 Mikroliter SPRI-Kügelchen hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur trennen Sie es 5 Minuten lang auf einem Mini-Magnetständer.

Wenn Sie fertig sind, geben Sie 150 Mikroliter des Überstands in ein neues PCR-Röhrchen, fügen Sie 95 Mikroliter SPRI-Kügelchen hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Reaktion 5 Minuten lang, bevor Sie die Kügelchen auf dem Mini-Magnetständer trennen. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie die Perlen 1 Minute lang mit 200 Mikrolitern 70%igem Ethanol.

Wiederholen Sie zwei weitere Wäschen. Nach der letzten Wäsche die Röhrchen 1 Minute lang bei 1000 g zentrifugieren. Pipettieren Sie das restliche Ethanol heraus und trocknen Sie das Pellet bei 37 Grad Celsius für 2 Minuten auf einem PCR-Gerät mit geöffnetem Deckel.

Nach dem Trocknen resuspendieren Sie das Pellet in 20 Mikrolitern Puffer EB durch Pipettieren und inkubieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Trennen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang auf dem Mini-Magnetständer, bevor Sie 18 Mikroliter des Überstands, der die endgültige Bibliothek enthält, in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen. mCherry-markierte und GFP-markierte Adipozytenkerne unterschieden sich von den anderen Zelltypen, die aus dem Fettgewebe einer Adipoq-NuTRAP-Maus isoliert wurden.

Abhängig von der Art des Fettdepots wurde ein Unterschied von ca. 50 % bei eWAT, 30 % bei iWAT und 65 % bei BAT in den Adipozytenfraktionen beobachtet. Die Proben, die mehr als 15 PCR-Zyklen erforderten, wiesen auf Proben von geringer Qualität hin. Die Größenverteilungsanalyse der ATAC-seq-Bibliotheken zeigte mehrere Peaks, die der nukleosomenfreien Region (NFR) entsprechen, sowie Mono-, Di- und Mehrkernosomen mit durchschnittlichen Größen von etwa 500 bis 800 Basenpaaren.

Proben von schlechter Qualität zeigten in der Regel überwiegend NFR ohne oder mit wenigen nukleosomalen Peaks. Die Qualitätskontrolltests durch die qRT-PCR-Analyse zeigten eine 10- bis 20-fache Anreicherung mit den positiven genomischen Elementen in der Nähe von Adipozyten-Markergenen wie Adipoq, Fabp4, Plin1 und Pnpla2, während bei der Negativkontrolle keine Anreicherung gezeigt wurde. Die Anreicherung mit dem thermogenen Gen Ucp1 wurde spezifisch in BAT beobachtet.

Die mitochondrialen Reads betrugen weniger als 2 % und der Anteil unter den Peaks betrug etwa 18 % bis 44 %Mehrere starke Peaks mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen wurden in der Nähe von Adipozyten-Markergenen wie Adipoq, Fabp4 und Plin1 aus allen Fettdepots gefunden. Starke ATAC-seq-Peaks wurden am braunen Adipozytenmarker Ucp1-Locus in der BAT-Probe beobachtet. Der kritischste Faktor für dieses Protokoll ist die Qualität des Zellkerns.

Es ist wichtig, qualitativ hochwertige Gewebeproben zu verwenden und die Kerne während des gesamten Experiments schonend zu behandeln, insbesondere während der Resuspension nach dem Zentrifugieren und Sortieren. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Protokoll auf transgenen Reportermäusen mit nuklearer Markierung beruht. Hier wurden NuTRAP-Mäuse verwendet, aber jedes ähnliche System kann verwendet werden.

Mit unseren FACS-Daten kann man eine computergestützte Mehrfachanalyse durchführen, um wichtige transkriptomische Faktoren zu finden, die die Genexpression in biologischen Umgebungen regulieren.