Name: Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Etablierung und Kultivierung von Tränendrüsenorganoiden aus Maus- und menschlichem Gewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Faktoren und regenerativer Ansätze bei Trockenheitserkrankungen.

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Wir danken Yorick Post für die anfängliche Entwicklung des Protokolls. Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine Auszeichnung der Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) und der Mark Foundation for Cancer Research an das SPECIFICANCER-Team unterstützt.

<ol><li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+development%3A+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li>
<li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+infection+of+the+external+eye%3A+The+role+of+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+Arzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
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<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li>
<li>Bannier-Hélaouët, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li>
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<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+Studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+complex+DNA+repair+%28DECODR%29%3A+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li>
<li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy%3A+Developmental+aspects+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li>
<li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+regeneration%3A+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
</ol>

Hans Clevers ist Leiter der Pharmaforschung und frühen Entwicklung bei Roche, Basel, und hält mehrere Patente im Zusammenhang mit der Organoid-Technologie.

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung und Verwendung von Tränendrüsenorganoiden für funktionelle Assays, Mutationsmodellierung und Transplantation. Bei der Etablierung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen ist die Gewebedissoziation von entscheidender Bedeutung. Wenn das Gewebe nicht ausreichend verdaut ist, ist die Organoidausbeute gering. Wenn das Gewebe überverdaut wird, sterben die Zellen ab und wachsen nicht als Organoide heraus. Jedes Gewebe sollte für eine bestimmte Zeit mit einem bestimmten Enzym verdaut werden, um ein optimales Organoidwachstumzu gewährleisten 14,17,18. Die Tränendrüse ist ein eher weiches Gewebe, bei dem ein Kollagenaseverdau von 5-10 min in Kombination mit pipettierbasierter mechanischer Dissoziation ausreicht, um kleine Gewebestücke zu isolieren. Wenn Einzelzellen für Anwendungen wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung gewonnen werden müssen, kann die Dissoziation länger durchgeführt werden, bis das Einzelzellstadium erreicht ist, aber die Dissoziation sollte gestoppt werden, sobald Einzelzellen erhalten werden, um eine Abnahme der Lebensfähigkeit zu begrenzen. Da die Dissoziation des Gewebes so wichtig ist, ist eine Überverdauung der wahrscheinlichste Grund für das Versagen der organoiden Etablierung der Tränendrüsen.
Die richtige Pflege von Tränendrüsenorganoiden ist wichtig für ihre Verwendung. Die Langzeiterhaltung ist ein Kennzeichen von Tränendrüsenorganoiden aus adulten Stammzellen im Vergleich zu Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen 7,17. Um eine langfristige Erhaltung zu erreichen, sollten regelmäßige Organoid-Spaltungen und Mediumwechsel durchgeführt werden. Andernfalls beginnen sich Organoide zu differenzieren und entwickeln ein vermindertes Stammzellpotenzial, was ihre langfristige Erhaltung behindert7. Auch in diesem Schritt kann eine Überverdauung die Stammzellen abtöten und die Aufrechterhaltung der Organoide beeinträchtigen. Für die regelmäßige Aufrechterhaltung ist eine organoide Dissoziation in einzelne Zellen nicht erforderlich. Um jedoch klonale Knock-out-Organoidlinien zu erzeugen, ist es wichtig, mit einzelnen Zellen zu beginnen. Ist dies nicht der Fall, bestehen die Organoide aus einem Mosaik von Zellen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund, was die Analyse des Effekts einer einzelnen, definierten Mutation unmöglich macht. Hier beschreiben wir die Verwendung eines C>T-Basiseditors zum Erzeugen von Stop-Codons. Dieser Genom-Editor beruht auf dem Vorhandensein von Arginin-, Glutamin- oder Tryptophan-Codons innerhalb von 12-18 Basen von einem NGG-PAM. Wenn diese Bedingungen beim Design einer gRNA nicht erfüllt sind, können konventionelle Cas9- oder C>T-Baseneditoren mit alternativen PAMs verwendet werden 7,18. Konventionelles Cas9 führt jedoch zu doppelsträngigen Brüchen, die bei der Reparatur11 zu Indels führen. Da beide Allele unterschiedliche Indels beherbergen können, ist bei der Klongenotypisierung zusätzliche Vorsicht geboten. Die Entfaltung der eingeführten Modifikationen sollte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass beide Allele Out-of-Frame-Indels enthalten und somit die Organoid-Klone für das Gen19 ausgeschaltet werden. Der Vorteil von C>T-Baseneditoren liegt darin, dass sie zur Modellierung von Punktmutationen verwendet werden können, die nicht zwangsläufig zu Stop-Codons führen. Sie können beispielsweise verwendet werden, um spezifische Pax6-Mutationen zu modellieren, die bei Patienten mit Aniridie gefunden wurden, um ihre Auswirkungen auf die Tränendrüsenphysiologie zu untersuchen20.
Die Tränendrüse sondert den wässrigen Teil des Tränenfilms1 ab. Die Tränensekretion kann in humanen Organoiden nach Differenzierung durch Wachstumsfaktorentzug und NOTCH-Hemmung rekapituliert werden. Unter diesen Bedingungen werden Organoide terminal differenziert und können nicht weiter aufrechterhalten werden. Differenzierte Tränendrüsenorganoide können jedoch die Entwicklung von tränenauslösenden Medikamenten im Zusammenhang mit der Erkrankung des trockenen Auges steuern, möglicherweise in Hochdurchsatz-Screenings. Der in diesem Protokoll vorgestellte Tränen-Assay ist derjenige, der derzeit die größte Änderung der Organoidgröße in kurzer Zeit liefert, was die Quantifizierung im Rahmen eines Arzneimittelscreenings erleichtert 7,9,17.
Die Stammzelltherapie ist vielversprechend für die Regeneration der Tränendrüsen bei Erkrankungen des trockenen Auges21. Aus adulten Stammzellen gewonnene Tränendrüsenorganoide könnten ein Ausgangsmaterial für solche Anwendungen sein. Das hier vorgestellte Protokoll führt zu einer Organoid-Transplantation der menschlichen Tränendrüse, meist in Form von Zysten. Ein geringes Organoid-Engraftment kann dadurch entstehen, dass Organoide an der falschen Stelle injiziert werden. Das Trainieren des Injektionsvorgangs mit einem Farbstoff ermöglicht die Verfolgung der Injektionsstelle und verbessert letztendlich die Injektionsgenauigkeit. Alternativ kann die Epidermis der Maus so eingeschnitten werden, dass sie direkten Zugang zur Tränendrüse hat, wie es bei Ratten vordem 22. Lebensjahr der Fall war. Diese Methode dauert länger, kann aber genauer sein. Andererseits integrierten sich die Organoide mit dem vorliegenden Protokoll nicht funktionell in die Tränendrüse der Maus. Ähnliche Ergebnisse wurden für das Tränendrüsentransplantat aus iPS-Zellen beobachtet22. Die Transplantationsmethode könnte weiter verbessert werden, indem die Tränendrüse vorab verletzt wird, ein Mausmodell des trockenen Auges verwendet wird und/oder die Organoide als Einzelzellen oder kleine Klumpen injiziert werden. Nichtsdestotrotz können aus adulten Stammzellen gewonnene Tränendrüsenorganoide und das dazugehörige Toolkit die Grundlage für zukünftige Anwendungen in der Tränendrüsenforschung und der regenerativen Medizin sein.

Die Tränendrüse ist das Drüsenepithel, das für die Produktion des größten Teils der wässrigen Schicht des Tränenfilmsverantwortlich ist 1. Die wässrige Schicht des Tränenfilms enthält nicht nur Wasser zur Schmierung der Augenoberfläche, sondern auch ein großes Repertoire an antimikrobiellen Komponenten, die die Augenoberfläche vor Infektionen schützen2. Wenn die Tränendrüse geschädigt oder entzündet ist, tritt eine Erkrankung des trockenen Auges auf, die zu Beschwerden für die Patienten führt und schließlich zum Verlust des Sehvermögens führen kann3. Im Laufe der Jahre wurden Modellsysteme zur Untersuchung der Tränendrüse, insbesondere der menschlichen Drüse, begrenzt 4,5,6. Dies hat zu einer Wissenslücke über die Tränendrüsenfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen beigetragen.
In jüngster Zeit wurden In-vitro-Modelle entwickelt, um die Tränendrüse in einer Schale zu untersuchen 7,8,9. Diese Tränendrüsen-Organoide werden aus adulten Stammzellen gewonnen, die als dreidimensionale Strukturen in einer extrazellulären Matrix gezüchtet werden, ergänzt mit einem Cocktail von Wachstumsfaktoren, die ihre Regenerationsfähigkeit in vitro aufrechterhalten 7. Der Vorteil von Organoiden, die aus adulten Stammzellen (ASC) gewonnen werden, besteht darin, dass sie sehr lange erhalten bleiben können, während gesunde Gewebemerkmale rekapituliert werden. Diese Art von Organoiden besteht ausschließlich aus Epithelzellen, im Gegensatz zu aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnenen Organoiden, die beispielsweise auch Stromazellen enthalten können. Im Gegensatz zu Organoiden, die aus pluripotenten Stammzellen (PSC) gewonnen werden, werden ASC-Organoide direkt aus adultem Gewebe gebildet und erfordern keine genetischen Modifikationen, um erweitert zu werden. ASC-Organoide weisen adulte Merkmaleauf 10.
Dieses Protokoll enthält einen Werkzeugkasten zur Gewinnung von Tränendrüsenorganoiden aus Maus- und menschlichem Primärgewebe. Das Protokoll beschreibt, wie die Funktionalität der Organoide durch einfaches Entziehen von Wachstumsfaktoren weiter verbessert werden kann und wie die Organoide durch die Durchführung eines Quelltests zur Sekretion von Tränenflüssigkeit angeregt werden können. Dieses Protokoll beinhaltet zusätzlich eine auf Elektroporation basierende Transfektionsmethode, um Mausorganoide unter Verwendung von CRISPR-abgeleiteten Baseneditoren genetisch zu verändern. Im Gegensatz zu herkömmlichem Cas9 erlaubt die Verwendung von Baseneditoren die Modifikation einzelner Basen im Genom, ohne einen doppelsträngigen Bruch zu erzeugen11,12. Abschließend wird die orthotope Transplantation von humanen Tränendrüsenorganoiden in immundefiziente Mäuse und die anschließende histologische Beurteilung des Transplantats beschrieben. Dieses Organoid-Toolkit für Tränendrüsen kann in der Forschung zur Regeneration und Funktion der Tränendrüsen sowie zur Modellierung genetischer und entzündlicher Erkrankungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Safe-Lock Zentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidin tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS: 868272-85-9 , ACHTUNG, 6 g/L Lösung kann aliquotiert bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>5x grüner GoTaq Flexi Puffer</td><td>Promega</td><td>M891A</td><td>Bei -20 > lagern; C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Bei -20 °C lagern; C, Bestand bei 30 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>Lagern bei 4 > C</td></tr><tr><td>Agarplatten mit Ampicillin</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav VAPOUR-Line lite</td><td>VWR Chemikalien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Bei -20 &/Grad lagern; C, 50x</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine Insulinnadel 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Tischmikroskop DMI1</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>MP biomedizinisch</td><td>160069</td><td>Bei 4 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>BTXpress</td><td>BTX</td><td>MDS450805</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kassetten</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>Kryokonservierungsmedium, Anweisungen befolgen</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure-Monohydrat</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS: 5949-29-1</td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9407</td><td>Aliquots bei 20 mg/ml, 20x, lagern bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 50 mL</td><td>Corning</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24 mm x 50 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; zer</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Basalmembran-Extrakt (BME), Wachstumsfaktor reduziert, Typ 2 - extrazelluläre Matrix</td><td>R& D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>Lagern bei -20 &deg; C, bei 4 Grad halten; C für bis zu 1 Monat</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>Lagern bei -20 &deg; C, Lager bei 10 mM, 1000x</td></tr><tr><td>Dinatriumhydrogenphosphat wasserfrei</td><td>VWR Chemikalien</td><td>28026.292</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>CAS:10028-24-7</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>Aliquote bei 50 U/ml, lagern bei -20 &deg; C bis zum Gebrauch, 400x</td></tr><tr><td>Einweg-Skalpell Steril N&deg; 10</td><td>Swann Morton</td><td>3033838</td><td></td></tr><tr><td>DM4000 Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 25 mM</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td>Alle 4 Nukleotide miteinander mischen, lagern bei -20 > C</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>Easy Siebe 70 &; Mikro; m</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+/HRP Maus</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206; 5000</td><td>VORSICHT, Zur Herstellung anderer Ethanolverdünnungen verwenden</td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>VORSICHT</td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>VORSICHT</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Live-Imaging Hellfeldmikroskop</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Lagern bei -20 &deg; C, Lagerbestand bei 100 mg/mL im Basismedium, 100x</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH, Fidschi Entwickler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496</td><td>CAS: 50-00-0, VORSICHT</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>Bei -20 &deg; C, Lagerbestand bei 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>Lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>VWR Chemikalien</td><td>10047105</td><td>Bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>lagern HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Bei 4 Grad lagern; C, 100x</td></tr><tr><td>Histocore H und C, Gewebeeinbettungsmaschine</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Meidax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humanes nukleoläres Antigen Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure 5 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10605882</td><td>CAS: 7647-01-0, VORSICHT</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 30%</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS: 7722-84-1, VORSICHT</td></tr><tr><td>Hygromycin B-Gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>Bestand in 100 mg/&micro; L, 1000x</td></tr><tr><td>Hygromycin-Resistenz kassettenhaltiges Plasmid</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf et al., Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td><td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 25 mM</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>Lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mikrotom RM2235</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midiprep DNA-Isolationskit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep DNA-Isolationskit</td><td>ThermoFisher wissenschaftliches</td><td>K210003</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Lagern bei -20 &deg; C, Lager bei 500 mM, 400x</td></tr><tr><td>NEPA21 Elektroporator</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Lagern bei -20 &deg; C, Lagerbestand bei 1M, 100x</td></tr><tr><td>NOD Scid Gamma (NSG) Mäuse</td><td>Hubrecht Institute Kolonie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noggin konditioniertes Medium</td><td>U-Protein Express</td><td>Custom Order</td><td>Store bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Noradrenaline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7257</td><td>Lagern bei -20 °; C, vorrätig bei 100 mM</td></tr><tr><td>Ofen</td><td>Memmert</td><td></td><td>Set bei 58 μd; C</td></tr><tr><td>P20, P200 und P1000 Pipetten</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>VWR Chemikalien</td><td>10048502</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten, glasverstopft</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Bei -20 > lagern; C</td></tr><tr><td>Pertex</td><td>Klinipath</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000X, lagern bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>Bei -20 &deg lagern; C, Lagerbestand bei 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Petrischale, 10 cm</td><td>Greiner</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA-Extraktionslösung</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>Aliquote lagern bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>R-Spondin 3 konditioniertes Medium</td><td>U-Protein Express</td><td>Custom Order</td><td>Lagern bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCAAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folien</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>Klebstoff, gemahlen</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Merck</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS: 26628-22-8, VORSICHT</td></tr><tr><td>Natriumcytrat-Dihydrat</td><td>J.T. Baker</td><td>0280</td><td>CAS: 6132-04-3</td></tr><tr><td>Standard Forward Primer: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Subklonierungseffizienz kompetente Zellen DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>Suspensionszellkulturplatten (24 Well)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 Wells</td></tr><tr><td>Suspensionszellkulturplatten (12 Well)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665102</td><td>12 Wells</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TAE-Puffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td>Bestand bei 50x, verdünnt auf 1x mit Reinstwasser</td></tr><tr><td>Transposase-haltiges Plasmid</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf et al., Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>bei 4 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>U6_Forward Grundierung: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS: 1330-20-7, VORSICHT</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Bei -20 & deg lagern; C, Lager bei 10 mM, 1000x</td></tr></tbody></table>

etablierung, erhaltung, differenzierung, genetische manipulation und transplantation von tränendrüsenorganoiden von mäusen und menschen

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Die Tränendrüse ist ein wesentliches Organ für die Homöostase der Augenoberfläche. Durch die Herstellung des wässrigen Teils des Tränenfilms schützt es das Auge vor Austrocknungsstress und äußeren Verletzungen. Über die Tränendrüsen-(Patho-)Physiologie ist wenig bekannt, da es an adäquaten in vitro Modellen mangelt. Die Organoid-Technologie hat sich als nützliche experimentelle Plattform für mehrere Organe erwiesen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung und Aufrechterhaltung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen vor, beginnend mit Tränendrüsenbiopsien. Durch die Modifikation der Kulturbedingungen verbessern wir die Funktionalität der Tränendrüsenorganoide. Die Organoidfunktionalität kann durch einen "weinenden" Assay untersucht werden, bei dem die Tränendrüsenorganoide ausgewählten Neurotransmittern ausgesetzt werden, um die Tränenfreisetzung in ihrem Lumen auszulösen. Wir erklären, wie man dieses Phänomen abbilden und quantifizieren kann. Um die Rolle von Genen zu untersuchen, die für die Tränendrüsenhomöostase von Interesse sind, können diese genetisch verändert werden. Wir beschreiben ausführlich, wie man Tränendrüsenorganoide mit Hilfe von Baseneditoren genetisch modifizieren kann - vom Guide-RNA-Design bis zur Genotypisierung von Organoidklonen. Schließlich zeigen wir, wie das regenerative Potenzial menschlicher Tränendrüsenorganoide durch orthotope Implantation in der Maus untersucht werden kann. Zusammen bietet dieses umfassende Toolset Ressourcen für die Verwendung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen zur Untersuchung der Tränendrüsenphysiologie.

Nach der Dissektion der Tränendrüse der Maus (Abbildung 2A) erzeugte die enzymatische und mechanische Verdauung kleine Gewebefragmente, zwischen denen die Acini und Gänge unterschieden werden konnten (Abbildung 2B). Die verbleibenden großen Gewebestücke würden die EZM destabilisieren, was das anfängliche Organoidwachstum verringern würde. Die Ableitung der Tränendrüsenorganoide der Maus war erfolgreich, als zystische Organoide mit einem Durchmesser von ~500 μm nach ~7 Tagen gefunden wurden, dem Stadium, in dem die Organoide bereit waren, gespalten zu werden (Abbildung 2C). Selbst wenn die gesamte Organoid-Ableitung erfolgreich ist, können einige Organoide zu wachsen beginnen, bevor sie schließlich aufhören. Menschliche Tränendrüsenorganoide wuchsen innerhalb von 3-4 Tagen als Zysten heraus und erreichten nach der Gewebeisolierung innerhalb von 10-14 Tagen ihre volle Größe (Abbildung 2D). Sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen schlug die Organoid-Ableitung manchmal fehl, da keine oder nur wenige Organoide herauswuchsen. Dies wurde in der Regel durch eine Überverdauung des Gewebes verursacht. Die Tränendrüsenorganoide der Maus konnten mindestens 40-fach und die menschlichen Organoide mindestens 20-fach durchgelassen werden. Die Passage wurde im Durchschnitt alle 7-10 Tage durchgeführt, abhängig vom Organoidwachstum.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Abbildung 2: Etablierung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen. (A) Fotografien der verschiedenen Stadien der Tränendrüsendissektion der Maus. Der Pfeil zeigt auf die Tränendrüse unter ihrer Schutzmembran. (B) Hellfeldaufnahmen von Tränendrüsenzellen der Maus direkt nach der Gewebeverdauung, mit Einschüben, die einen Acinus und einen Ductus zeigen. (C) Hellfeldbilder einer erfolgreichen und einer erfolglosen Tränendrüsen-Organoid-Ableitung der Maus. (D) Hellfeldbilder des menschlichen Organoid-Auswuchses über einen Zeitraum von 14 Tagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Tränendrüsenorganoide enthalten einen großen Anteil an Stammzellen, wenn sie im Expansionsmedium kultiviert werden. Um ihr Differenzierungsniveau zu erhöhen, haben wir ein Maus- und ein menschliches Differenzierungsmedium mit reduziertem Wachstumsfaktorgehalt eingerichtet. Nach 5 Tagen bzw. 7 Tagen im Differenzierungsmedium wurden die Tränendrüsenorganoide der Maus und des Menschen dichter (Abbildung 3A-B). Diese morphologische Veränderung korrelierte mit erhöhten funktionellen Eigenschaften. Die Applikation des zyklischen AMP-Aktivators Forskolin oder des Neurotransmitters Noradrenalin führte innerhalb von weniger als 3 h zu einer organoiden Schwellung (d. h. apikaler Wassersekretion) (Abbildung 3C). Wenn die Schwellung länger als 3-4 h dauerte, deutete dies darauf hin, dass die Organoide nicht ausreichend differenziert waren und/oder keine funktionellen Marker, wie z.B. Rezeptoren für Neurotransmitter, exprimierten.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Abbildung 3: Differenzierung von Tränendrüsenorganoiden von Maus und Mensch und funktioneller Quellungstest in humanen Organoiden. (A) Hellfeldbilder von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen, die 7 Tage lang in Expansionsmedium und nach 2 Tagen in Expansionsmedium für 5 Tage in Expansionsmedium kultiviert wurden. (B) Hellfeldbilder von menschlichen Tränendrüsenorganoiden, die 11 Tage lang in Expansionsmedium und nach 2 Tagen in Expansionsmedium 9 Tage lang in Expansionsmedium kultiviert wurden. (C) Hellfeldbilder von differenzierten menschlichen Tränendrüsenorganoiden, die über einen Zeitraum von 3 h mit frischem Differenzierungsmedium (Kontrolle) mit 1 μM Forskolin und 100 μM Noradrenalin exponiert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Um Pax6 in Tränendrüsenorganoiden der Maus auszuschalten, wurde mittels PCR und Ligation ein Plasmid erzeugt, das die ausgewählte Pax6-gerichtete gRNA enthielt (Abbildung 4A). Dieses gRNA-haltige Plasmid wurde zusammen mit den Piggy-Bac-Plasmiden (Hygromycin-Resistenz-Transposon-haltige und Transposase-enthaltende Plasmide) und dem C&gt;T-Basen-Editor Cas9 in in in Einzelzellen dissoziierten Tränendrüsenorganoiden der Maus elektroporiert. Nach 3 Tagen, als sich die Organoide erholt hatten, wurden sie Hygromycin ausgesetzt, um Klone auszuwählen, die die Hygromycin-Resistenzkassette enthalten hatten. In erfolgreichen Elektroporationen wuchsen Organoide heraus, die gegen Hygromycin resistent waren (Abbildung 4B). Die wachsenden Organoid-Klone, die größer als ~300 μm waren, wurden ausgewählt, idealerweise bevor sie begannen, sich spontan zu differenzieren (Abbildung 4C). Die DNA wurde aus einem Teil des Organoids extrahiert, während der Rest in Kultur blieb. Die PCR-Amplifikation des Pax6-Locus, auf den die gRNA abzielt, ergab eine 367 bp-Bande für jeden der ausgewählten Klone (Abbildung 4D). Nach der Sequenzierung des amplifizierten Locus wurden Klone behalten, die homozygot C &gt; T editiert wurden (n = 1). Andererseits wurden Klone, die nicht editiert (n = 4), heterozyg editiert oder falsch editiert (n = 1) waren, verworfen (Abbildung 4E). Insgesamt wurde mit dieser gRNA, die auf Pax6 abzielt, ein homozygoter Knock-out-Tränendrüsenklon der Maus aus sechs sequenzierten Sequenzen erhalten. Einige Klone wuchsen gut, aber einige Organoid-Klone gingen nach der Ernte verloren oder begannen sich zu differenzieren (Abbildung 4F). Von den 10 ausgewählten Organoid-Klonen wuchsen 7 gut heraus.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Abbildung 4: Base Editing-vermittelter Knock-out von Pax6 in Tränendrüsenorganoiden der Maus. (A) Sanger-Sequenzierungsspur von pFYF1320 nach korrekter Integration der gRNA, die auf den Pax6-Locus abzielt. (B) Hellfeldbilder von Tränendrüsenorganoiden der Maus 5 Tage nach Hygromycin-Exposition nach Elektroporation. Die Organoide wurden in Maus-Expansionsmedium kultiviert. Auf der linken Seite ist ein Beispiel für eine fehlgeschlagene Elektroporation zu sehen, bei der kein Klon herauswächst, der gegen Hygromycin resistent ist. Rechts sehen Sie ein Beispiel für eine erfolgreiche Elektroporation, bei der mehrere Hygromycin-resistente Organoid-Klone überlebt haben. (C) Hellfeldbilder von Klonen, die ausgewählt werden sollten, und Klone, die nicht ausgewählt werden sollten. (D) Agarose-Gel, das die Amplifikation des Pax6-Locus zeigt, der mit der gRNA anvisiert wird. In Grün ist das Band mit der erwarteten Größe von 367 bp hervorgehoben. (E) Sanger-Sequenzierungsspur von drei Organoid-Klonen, die gegen Hygromycin resistent waren. Der oberste Klon ist unbearbeitet. Der mittlere Klon ist ein homozygoter C&gt;T-Klon und somit ein homozygoter Knock-out. Der untere Klon weist zwei heterozygote Punktmutationen auf und ist entweder ein heterozygoter Knock-out oder ein gemischter Klon und wurde falsch editiert. (F) Hellfeldbilder der ausgewählten Organoid-Klone mit unterschiedlichem Auswuchs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Um schließlich eine organoide orthotope Transplantation der menschlichen Tränendrüsen bei Mäusen durchzuführen, wurden Organoide verwendet, die 3 Tage im Voraus gespalten wurden (&lt; 100 μm Durchmesser). Die Organoidtransplantation wurde 1 Monat nach der Injektion der Organoide in die Tränendrüse der Maus durch Färbung auf einen humanspezifischen Marker, das humane nukleoläre Antigen, bestätigt (Abbildung 5). Das Fehlen einer punktförmigen Färbung in allen Abschnitten der Tränendrüse der Maus deutete auf ein Fehlen einer humanen Organoidtransplantation hin.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Abbildung 5: Transplantation von menschlichen Tränendrüsenorganoiden in die Tränendrüse der Maus. Färbung der transplantierten Tränendrüsen der Maus für den humanen Nukleolenmarker zur Überwachung des Transplantats 1 Monat nach der Transplantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung der Medien und Puffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt, wie Tränendrüsenorganoide, die aus primärem Maus- und menschlichem Gewebe gewonnen werden, hergestellt, erhalten, genetisch verändert, differenziert, funktionell charakterisiert und transplantiert werden.

Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Mit Tränendrüsenorganoiden kann man untersuchen, wie bestimmte Gene die Tränendrüsenhomöostase steuern. Darüber hinaus können die Organoide für die regenerative Medizin verwendet werden. Der Hauptvorteil der aus adulten Stammzellen gewonnenen Tränendrüsen-Organoid-Technologie besteht darin, dass sie das Wachstum und die Untersuchung gesunder und nicht transformierter Tränenepithelzellen ermöglicht.Diese Organoide könnten schließlich zur Behandlung von Patienten mit trockenem Auge eingesetzt werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des für das Experiment erforderlichen Mediums und Materials, gefolgt von der Kombination aller Komponenten des Aufschlussmediums vor dem Experiment. Befeuchten Sie die Skalpelle mit diesem Medium, um zu vermeiden, dass Gewebestücke daran kleben bleiben.Entnehmen Sie das Tränendrüsengewebe der Maus aus dem Medium, legen Sie es in die Petrischale und zerkleinern Sie es mit vorbenetzten Skalpellen. Sobald die Gewebestücke kleiner als 0,5 Kubikmillimeter sind, kratzen Sie sie mit dem Skalpell von der Petrischale ab und füllen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit dem Aufschlussmedium. Für eine sehr kleine Humanbiopsie wird sie direkt in das Verdauungsmedium gegeben, ohne sie zu zerkleinern.Inkubieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen mit Gewebestücken bis zu 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. In der Zwischenzeit eine Pasteur-Pipettenspitze in einer Flamme verengen und im Basismedium vorbefeuchten. Um den Dissoziationsprozess zu erleichtern, pipettieren Sie die Hackfleischmischung alle fünf Minuten mit der vorbenetzten, verengten Pasteurpipette auf und ab.Wenn unter dem Mikroskop viele Einzelzellen und kleine Klumpen sichtbar sind, stoppen Sie die Dissoziation durch Zugabe von 10 Millilitern des Basismediums. Nachdem Sie fünf Minuten lang bei 400 g heruntergeschleudert haben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern des Basismediums, um das Waschen und Pelletieren der Zellen zu wiederholen. Entfernen Sie die großen, unverdauten Gewebestücke und verbleibenden Kollagenfasern, indem Sie die gehackte Mischung durch ein 70-Mikrometer-Sieb filtern.Schleudern Sie das Eluat fünf Minuten lang bei 400 g. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern kalter extrazellulärer Matrix (ECM) für eine einzelne Tränendrüse der Maus und 50 Mikrolitern kalter ECM für eine menschliche Biopsie, ohne die Blasen zu erzeugen. Säen Sie bis zu 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Suspensionsplatte mit einem P200, um etwa 20 Mikroliter Tröpfchen in der Vertiefung zu erzeugen.Legen Sie die Platte kopfüber für 20 bis 30 Minuten in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit sich die ECM verfestigen kann. Sobald das ECM erstarrt ist, fügen Sie etwa einen Milliliter Maus-Expansionsmedium bei Raumtemperatur pro Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu. Bereiten Sie einen Milliliter humanes Differenzierungsmedium frisch zu, das einzelne Komponenten enthält, die die Sekretion durch die Tränendrüsenorganoide induzieren.Stellen Sie an einem automatisierten Hellfeld-Zeitraffermikroskop die abzubildenden Positionen in der Platte, das Zeitintervall von fünf Minuten und die Dauer von vier Stunden ein. Stellen Sie sicher, dass an jeder Position ein gesamtes ECM-Tröpfchen sichtbar ist. Bevor Sie mit der Bildgebung beginnen, entfernen Sie das Nährmedium aus den abzubildenden Vertiefungen, ohne die Platte vom Mikroskop zu nehmen, und ersetzen Sie es durch das frisch präparierte, gut resuspendierte humane Differenzierungsmedium, das Verbindungen wie Forskolin und Noradrenalin enthält.Als Negativkontrolle wird eine Vertiefung mit aufgefrischtem Differenzierungsmedium eingeschlossen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen" am Mikroskop und analysieren Sie die Ergebnisse nach vier Stunden. Nachdem Sie die Organoide, wie im Text erwähnt, dissoziiert haben, verwerfen Sie den Überstand.Resuspendieren Sie die Zellen in 80 Mikrolitern des Elektroporationspuffers. Bereiten Sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen die für das Experiment benötigten Plasmide vor. Geben Sie die Plasmide zu den Zellen und mischen Sie sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren.Richten Sie den Elektroporator mit den Parametern für Porenimpuls und Übertragungsimpuls ein. Legen Sie die Zellen mit den Plasmiden in eine Elektroporationsküvette. Messen Sie sofort den Widerstand, der zwischen 0,3 Ampere und 0,55 Ampere liegen sollte, und elektroporieren Sie sofort.Sobald Sie fertig sind, übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 400 Mikroliter Elektroporationspuffer hinzu, der mit einem Rho-Kinase-Inhibitor ergänzt wird. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur erholen. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g.Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, werden die Zellen mit 200 Mikrolitern ECM beschichtet. Fügen Sie nach dem Erstarren das Maus-Expansionsmedium hinzu. Für die Organoidpräparation werden die Organoide der menschlichen Tränendrüse etwa drei Tage vor dem Transplantationstag gespalten.Um die Organoide aus der EZM zu extrahieren, geben Sie Dispase in das Nährmedium, um eine Endkonzentration von 0,125 Einheiten pro Milliliter zu erreichen, und resuspendieren Sie die ECM-Tröpfchen gründlich, um sie mit einem P1000 aufzubrechen. Legen Sie die Platte für 30 Minuten wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Resuspendieren Sie die Organoide in 10 Milliliter Basismedium, um das Enzym auszuwaschen.Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 400 g pelletiert haben, resuspendieren Sie sie in 50 Mikrolitern kaltem menschlichem Expansionsmedium, das mit 5 % ECM angereichert ist. Legen Sie die Organoid-Suspension auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort. Für die orthotope Transplantation bei Mäusen wird die Organoidsuspension in einer Insulinnadel abgesaugt.Wenn die Maus schläft, legen Sie sie schnell auf die Seite, so dass die Haupttränendrüse zugänglich ist. Injizieren Sie fünf Mikroliter der Organoid-Suspension direkt durch die Haut in die Tränendrüse. Warten Sie, bis sich die Maus erholt hat, und beurteilen Sie täglich das Vorhandensein von transplantationsbedingten Beschwerden, insbesondere im Auge.Nach der Dissektion der Tränendrüse der Maus erzeugte die enzymatische und mechanische Verdauung kleine Gewebefragmente, einschließlich der Acini und der Gänge. Bei der erfolgreichen Ableitung von Tränendrüsen-Organoiden der Maus wurden nach sieben Tagen zystische Organoide mit einem Durchmesser von etwa 500 Mikrometern gefunden. Menschliche Tränendrüsenorganoide wuchsen innerhalb von drei bis vier Tagen als Zysten und erreichten nach der Gewebeisolierung innerhalb von 10 bis 14 Tagen eine ausgewachsene Größe.Nach fünf Tagen bzw. sieben Tagen im Differenzierungsmedium wurden die Tränendrüsenorganoide der Maus und des Menschen dichter. Die Anwendung des zyklischen AMP-Aktivators Forskolin oder des Neurotransmitters Noradrenalin führte innerhalb von weniger als drei Stunden zu einer organoiden Schwellung. Bei erfolgreicher Elektroporation wuchsen Organoide heraus, die gegen Hygromycin resistent sind.Die wachsenden Organoid-Klone, die größer als 300 Mikrometer sind, wurden vor ihrer Differenzierung gepflückt. Die PCR-Amplifikation des Pax6-Locus, auf den die Guide-RNA abzielt, ergab für alle ausgewählten Klone eine Bande von 367 Basenpaaren. Ein homozygoter Knockout-Tränendrüsenklon der Maus aus sechs sequenzierten Mäusen wurde mit Hilfe der Guide-RNA erhalten, die auf Pax6 abzielt.Einige Klone wuchsen gut, aber einige Organoid-Klone gingen nach der Ernte verloren oder begannen sich zu differenzieren. Von den 10 ausgewählten Organoid-Klonen wuchsen sieben gut heraus. Das Organoid-Engraftment wurde einen Monat nach der Injektion der Organoide in die Tränendrüse der Maus durch Färbung auf einen humanspezifischen Marker, das humane nukleoläre Antigen, bestätigt.Eine Sache, auf die Sie achten sollten, ist, weder das Gewebe noch die Organoide zu überverdauen. Andernfalls könnten die Zellen absterben, was die Organoid-Etablierungsrate verringern würde. Tränendrüsenorganoide können histologisch analysiert werden.Auf diese Weise kann man einen Einblick in ihre zelluläre Zusammensetzung erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Tränendrüse (LG) ist ein Verzweigungs Organ, das die wässrigen Bestandteile der Tränen notwendig für die Aufrechterhaltung der Vision und Augengesundheit produziert. Hier beschreiben wir murine LG Dissektion und ex vivo Kulturtechniken zu entziffern Signalwege in LG Entwicklung beteiligt.

Manipulation der Murine Lakrimal

Die Tränendrüse (LG) hat zwei Zelltypen, die α-glatte Muskelaktin (αSMA) ausdrücken: Myoepithelialzellen (MECs) und Pericytes. MECs sind ektodermaler Herkunft, der in vielen Drüsengeweben zu finden ist, während die Periicyten vaskuläre glatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs sind. Dieses Protokoll isoliert MECs und Periicytes von murinen LGs.

Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Die dreidimensionale, serumfreie Kulturmethode für adulte Tränendrüsenstammzellen (LG) ist für die Induktion der Bildung und Differenzierung von LG-Organoiden in Acinare oder duktale Zellen gut etabliert.

Dreidimensionales, serumfreies Kultursystem für Tränendrüsenstammzellen

Hier präsentieren wir eine Methode zur Etablierung eines Mausmodells des wässrig-defizienten trockenen Auges durch Exzidierung der extraorbitalen und infraorbitalen Tränendrüsen und bewerten die Veränderungen der Augenoberfläche beim wässrigen Mangel-Trockenauge.

Etablierung eines Mausmodells für den Kammerwassermangel Trockenes Auge

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

Dieses Protokoll zeigt, wie man gesunde, undifferenzierte humane embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu halten.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Adult Herzmuskelzellen sind primäre Zellen, die aus tierischen Herzen isoliert und kultiviert für mehrere Tage. Innerhalb dieses Zeitraums Kultur adenoviralen Gentransfer können verwendet werden, um genetisch kodierte Biosensoren (GEBS) oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Beide Ansätze erlauben zellulären Untersuchungen mittels der konfokalen Mikroskopie.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der...

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Erfahren Sie die Etablierung und Kultivierung von Tränendrüsenorganoiden aus Maus- und menschlichem Gewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Faktoren und regenerativer Ansätze bei Trockenheitserkrankungen.

Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen (Video) | JoVE Journal

Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen

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