Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen

Mit Tränendrüsenorganoiden kann man untersuchen, wie bestimmte Gene die Tränendrüsenhomöostase steuern. Darüber hinaus können die Organoide für die regenerative Medizin verwendet werden. Der Hauptvorteil der aus adulten Stammzellen gewonnenen Tränendrüsen-Organoid-Technologie besteht darin, dass sie das Wachstum und die Untersuchung gesunder und nicht transformierter Tränenepithelzellen ermöglicht.

Diese Organoide könnten schließlich zur Behandlung von Patienten mit trockenem Auge eingesetzt werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des für das Experiment erforderlichen Mediums und Materials, gefolgt von der Kombination aller Komponenten des Aufschlussmediums vor dem Experiment. Befeuchten Sie die Skalpelle mit diesem Medium, um zu vermeiden, dass Gewebestücke daran kleben bleiben.

Entnehmen Sie das Tränendrüsengewebe der Maus aus dem Medium, legen Sie es in die Petrischale und zerkleinern Sie es mit vorbenetzten Skalpellen. Sobald die Gewebestücke kleiner als 0,5 Kubikmillimeter sind, kratzen Sie sie mit dem Skalpell von der Petrischale ab und füllen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit dem Aufschlussmedium. Für eine sehr kleine Humanbiopsie wird sie direkt in das Verdauungsmedium gegeben, ohne sie zu zerkleinern.

Inkubieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen mit Gewebestücken bis zu 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. In der Zwischenzeit eine Pasteur-Pipettenspitze in einer Flamme verengen und im Basismedium vorbefeuchten. Um den Dissoziationsprozess zu erleichtern, pipettieren Sie die Hackfleischmischung alle fünf Minuten mit der vorbenetzten, verengten Pasteurpipette auf und ab.

Wenn unter dem Mikroskop viele Einzelzellen und kleine Klumpen sichtbar sind, stoppen Sie die Dissoziation durch Zugabe von 10 Millilitern des Basismediums. Nachdem Sie fünf Minuten lang bei 400 g heruntergeschleudert haben, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern des Basismediums, um das Waschen und Pelletieren der Zellen zu wiederholen. Entfernen Sie die großen, unverdauten Gewebestücke und verbleibenden Kollagenfasern, indem Sie die gehackte Mischung durch ein 70-Mikrometer-Sieb filtern.

Schleudern Sie das Eluat fünf Minuten lang bei 400 g. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern kalter extrazellulärer Matrix (ECM) für eine einzelne Tränendrüse der Maus und 50 Mikrolitern kalter ECM für eine menschliche Biopsie, ohne die Blasen zu erzeugen. Säen Sie bis zu 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Suspensionsplatte mit einem P200, um etwa 20 Mikroliter Tröpfchen in der Vertiefung zu erzeugen.

Legen Sie die Platte kopfüber für 20 bis 30 Minuten in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit sich die ECM verfestigen kann. Sobald das ECM erstarrt ist, fügen Sie etwa einen Milliliter Maus-Expansionsmedium bei Raumtemperatur pro Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu. Bereiten Sie einen Milliliter humanes Differenzierungsmedium frisch zu, das einzelne Komponenten enthält, die die Sekretion durch die Tränendrüsenorganoide induzieren.

Stellen Sie an einem automatisierten Hellfeld-Zeitraffermikroskop die abzubildenden Positionen in der Platte, das Zeitintervall von fünf Minuten und die Dauer von vier Stunden ein. Stellen Sie sicher, dass an jeder Position ein gesamtes ECM-Tröpfchen sichtbar ist. Bevor Sie mit der Bildgebung beginnen, entfernen Sie das Nährmedium aus den abzubildenden Vertiefungen, ohne die Platte vom Mikroskop zu nehmen, und ersetzen Sie es durch das frisch präparierte, gut resuspendierte humane Differenzierungsmedium, das Verbindungen wie Forskolin und Noradrenalin enthält.

Als Negativkontrolle wird eine Vertiefung mit aufgefrischtem Differenzierungsmedium eingeschlossen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen" am Mikroskop und analysieren Sie die Ergebnisse nach vier Stunden. Nachdem Sie die Organoide, wie im Text erwähnt, dissoziiert haben, verwerfen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in 80 Mikrolitern des Elektroporationspuffers. Bereiten Sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen die für das Experiment benötigten Plasmide vor. Geben Sie die Plasmide zu den Zellen und mischen Sie sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren.

Richten Sie den Elektroporator mit den Parametern für Porenimpuls und Übertragungsimpuls ein. Legen Sie die Zellen mit den Plasmiden in eine Elektroporationsküvette. Messen Sie sofort den Widerstand, der zwischen 0,3 Ampere und 0,55 Ampere liegen sollte, und elektroporieren Sie sofort.

Sobald Sie fertig sind, übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 400 Mikroliter Elektroporationspuffer hinzu, der mit einem Rho-Kinase-Inhibitor ergänzt wird. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur erholen. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g.

Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, werden die Zellen mit 200 Mikrolitern ECM beschichtet. Fügen Sie nach dem Erstarren das Maus-Expansionsmedium hinzu. Für die Organoidpräparation werden die Organoide der menschlichen Tränendrüse etwa drei Tage vor dem Transplantationstag gespalten.

Um die Organoide aus der EZM zu extrahieren, geben Sie Dispase in das Nährmedium, um eine Endkonzentration von 0,125 Einheiten pro Milliliter zu erreichen, und resuspendieren Sie die ECM-Tröpfchen gründlich, um sie mit einem P1000 aufzubrechen. Legen Sie die Platte für 30 Minuten wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Resuspendieren Sie die Organoide in 10 Milliliter Basismedium, um das Enzym auszuwaschen.

Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 400 g pelletiert haben, resuspendieren Sie sie in 50 Mikrolitern kaltem menschlichem Expansionsmedium, das mit 5 % ECM angereichert ist. Legen Sie die Organoid-Suspension auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort. Für die orthotope Transplantation bei Mäusen wird die Organoidsuspension in einer Insulinnadel abgesaugt.

Wenn die Maus schläft, legen Sie sie schnell auf die Seite, so dass die Haupttränendrüse zugänglich ist. Injizieren Sie fünf Mikroliter der Organoid-Suspension direkt durch die Haut in die Tränendrüse. Warten Sie, bis sich die Maus erholt hat, und beurteilen Sie täglich das Vorhandensein von transplantationsbedingten Beschwerden, insbesondere im Auge.

Nach der Dissektion der Tränendrüse der Maus erzeugte die enzymatische und mechanische Verdauung kleine Gewebefragmente, einschließlich der Acini und der Gänge. Bei der erfolgreichen Ableitung von Tränendrüsen-Organoiden der Maus wurden nach sieben Tagen zystische Organoide mit einem Durchmesser von etwa 500 Mikrometern gefunden. Menschliche Tränendrüsenorganoide wuchsen innerhalb von drei bis vier Tagen als Zysten und erreichten nach der Gewebeisolierung innerhalb von 10 bis 14 Tagen eine ausgewachsene Größe.

Nach fünf Tagen bzw. sieben Tagen im Differenzierungsmedium wurden die Tränendrüsenorganoide der Maus und des Menschen dichter. Die Anwendung des zyklischen AMP-Aktivators Forskolin oder des Neurotransmitters Noradrenalin führte innerhalb von weniger als drei Stunden zu einer organoiden Schwellung. Bei erfolgreicher Elektroporation wuchsen Organoide heraus, die gegen Hygromycin resistent sind.

Die wachsenden Organoid-Klone, die größer als 300 Mikrometer sind, wurden vor ihrer Differenzierung gepflückt. Die PCR-Amplifikation des Pax6-Locus, auf den die Guide-RNA abzielt, ergab für alle ausgewählten Klone eine Bande von 367 Basenpaaren. Ein homozygoter Knockout-Tränendrüsenklon der Maus aus sechs sequenzierten Mäusen wurde mit Hilfe der Guide-RNA erhalten, die auf Pax6 abzielt.

Einige Klone wuchsen gut, aber einige Organoid-Klone gingen nach der Ernte verloren oder begannen sich zu differenzieren. Von den 10 ausgewählten Organoid-Klonen wuchsen sieben gut heraus. Das Organoid-Engraftment wurde einen Monat nach der Injektion der Organoide in die Tränendrüse der Maus durch Färbung auf einen humanspezifischen Marker, das humane nukleoläre Antigen, bestätigt.

Eine Sache, auf die Sie achten sollten, ist, weder das Gewebe noch die Organoide zu überverdauen. Andernfalls könnten die Zellen absterben, was die Organoid-Etablierungsrate verringern würde. Tränendrüsenorganoide können histologisch analysiert werden.

Auf diese Weise kann man einen Einblick in ihre zelluläre Zusammensetzung erhalten.