Name: Ein Mausmodell der chronischen Leberfibrose zur Untersuchung der Gallengangsatresie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung eines Mausmodells der chronischen Leberfibrose zur Untersuchung von Gallengangsatresie. Diese Methode simuliert akute und chronische Symptome und ermöglicht die Evaluation therapeutischer Interventionen wie Anti-Ly6G-Antikörper.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81974056) an R.Z. und der National Nature Youth Foundation of China (82101808) und des Science and Technology Planning Project of Guangzhou (Nr. 202102020196) an Z.L. unterstützt.

Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020) genehmigt, wo alle Tierversuche durchgeführt wurden.
1. Etablierung des chronisch fibrotischen BA-Mausmodells
HINWEIS: Alle Tiere wurden in einer spezifischen, pathogenfreien Umgebung (SPF) im selben Raum gehalten, und die Experimente wurden in einer konventionellen Umgebung durchgeführt. BALB/c-Mäuse am 12,5. Trächtigkeitstag (Alter: 10-12 Wochen; Gewicht 35-40 g) wurden in einem Raum ohne spezifische Krankheitserreger bei 25°C unter einem 12-stündigen Dunkel-Hell-Zyklus gehalten und erhielten freien Zugang zu autoklaviertem Futter und Wasser. Neugeborene Mäuse wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt (durchschnittliches Körpergewicht: 1,5-1,6 g) für das Maus-BA-Modell ausgewählt.
<ol><li>Bereiten Sie RRV wie zuvor berichtet vor16. HINWEIS: Aufgrund des schlechten Überlebensstatus der Modellmäuse müssen sie im Alter von 21 Tagen getrennt werden, um zu vermeiden, dass sie von anderen Mäusen im selben Käfig gebissen oder sogar getötet werden.</li>
	<li>Teilen Sie neugeborene Mäuse in drei Gruppen ein: die Kontrollgruppe, die RRV-Gruppe und die RRV + Anti-Ly6G-Gruppe. Injektion von 20 μl RRV (Titer: 1,5 x 106 PFU/ml) (RRV-Gruppe) oder Kochsalzlösung (Kontrollgruppe) innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt intraperitoneal an die neonatalen Mäuse. Um Gr-1+ -Zellen zu depsietieren, sollte jede Maus 4 h vor der RRV-Injektion mit einer intraperitonealen Injektion von 5 μg Anti-Ly6G-Antikörper vorbehandelt werden. HINWEIS: Die Anti-Ly6G-Antikörperlösung wird bei 2-8 °C gelagert und sollte nicht eingefroren werden. Nehmen Sie den Antikörper vor Gebrauch heraus und stellen Sie ihn zum Aufwärmen 30 Minuten lang auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Injizieren Sie alle 3 Tage bis zum 12. Tag nach der RRV-Injektion alle 3 Tage 10 μg Anti-Ly6G-Antikörper in den Bauch der Maus (Abbildung 1A).</li>
	<li>Überprüfen und notieren Sie täglich das Aussehen, das Gewicht und das Überleben aller Mäuse.</li>
</ol>2. Intraperitoneale Injektion der Mäuse
<ol><li>Entfernen Sie neugeborene Mäuse aus dem Käfig. Verwenden Sie eine 1-ml-Insulinspritze, um 20 μl RRV-Lösung oder 50 μl Anti-Ly6G-Antikörperlösung zu injizieren. Kneifen Sie die Halshaut der jungen Maus mit Zeigefinger und Daumen einer Hand zusammen und halten Sie die Hinterbeine der Maus sanft mit Ringfinger und Schwanzfinger, um den Bauch freizulegen.</li>
	<li>Heben Sie die Nadel schräg nach oben an. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 15° zur Haut in den mittleren Oberschenkel des rechten Hinterbeins der Maus ein. Nachdem Sie sich entlang des subkutanen Pfades bewegt haben, bis die Nadel die rechte Rippenkante der Maus erreicht, richten Sie die Nadel nach unten in die Bauchhöhle. Dann injizieren Sie die Flüssigkeit unter die Leber der Maus. HINWEIS: Neugeborene Mäuse haben ihren Magen und ihre Milz im linken Bauch. Wenn auf der linken Seite eine Nadel eingeführt wird, kann es leicht zu einem Durchstechen des Magens oder zu einer Milzblutung kommen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Nadel sofort nach der Injektion heraus und achten Sie auf Blutungen oder Undichtigkeiten an der Injektionsstelle. Wenn vorhanden, wischen Sie es mit einer autoklavierten Baumwolle ab. Setze die Maus in den Käfig ihrer Mutter zurück. Anmerkungen: Um den Einfluss von Flüssigkeitsleckagen während der Injektion auf die Versuchsergebnisse zu verringern, stellen Sie sicher, dass die Injektion sanft ist, entfernen Sie langsam die Nadel und drücken Sie 30 Sekunden lang mit einem Wattestäbchen auf die Injektionsstelle.</li>
</ol>3. Entnahme von Gewebeproben
<ol><li>An Tag 12 werden die Mäuse mit 4 % Isofluran-Inhalation betäubt und unter dem Mikroskop seziert. Führen Sie eine 1-ml-Insulinspritze in die linke Herzkammer ein, um Blut zu entnehmen. Nach der Blutentnahme werden die Mäuse durch Inhalation von 4% Isofluran für 10 Minuten eingeschläfert. Zentrifugieren Sie das Blut bei 400 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und trennen Sie das Serum für Leberfunktionsmessungen. HINWEIS: Die Blutentnahme muss zu Lebzeiten der Mäuse durchgeführt werden. Wenn die Mäuse sterben, wird das Blut in den Blutgefäßen zurückgehalten und kann nicht entnommen werden.</li>
	<li>Fotografieren Sie das allgemeine Erscheinungsbild der Leber und des Gallengangs. Anschließend werden die Leber und Milz der Maus mit Schere und Pinzette vom umgebenden Gewebe getrennt. HINWEIS: Die Leber und andere Gewebe werden gesammelt und bei −80 °C für die RNA- und Proteinextraktion reserviert oder in 10%igem Formalin für die Präparation histologischer Proben getränkt.</li>
</ol>4. Fluoreszenzangiographie des extrahepatischen Gallengangs
<ol><li>Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, legen Sie die Leber, die Gallenblase und die extrahepatischen Gallengänge mit einer Schere und Wattestäbchen vollständig frei.</li>
	<li>Unter dem Haltungsmikroskop beobachten, 5-10 μl des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 (20 mg/ml) mit einer 1-ml-Insulinspritze in die Gallenblase injizieren und fotografieren. Dieser Prozess ist derselbe wie in einem früheren16. HINWEIS: Für die Gewebeentnahme und Fluoreszenzangiographie werden verschiedene Mäuse derselben Gruppe verwendet.</li>
</ol>5. H&E-Färbung
<ol><li>Tauchen Sie frisches Lebergewebe der Maus 24 Stunden lang in 10% Formalin.</li>
	<li>Nachdem Sie das Gewebe in Paraffin eingebettet haben, schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Paraffinmikrotom in Abschnitte mit einer Dicke von 4 μm und legen Sie zwei aufeinanderfolgende Abschnitte auf denselben Objektträger. Erfahrenes Personal ist erforderlich, um den Betrieb zu standardisieren, um Fingerschnitte zu vermeiden17.</li>
	<li>Legen Sie die Scheiben in ein Schneidegestell, entwachsen Sie sie in Xylol, hydratisieren Sie sie nacheinander in absolutem Ethanol, 95 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertem Wasser und weichen Sie sie jeweils 5 Minuten lang ein.</li>
	<li>Färben Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Hämatoxylinlösung und weichen Sie sie 5 s lang in 1%iger Salzsäure und 75%igem Alkohol ein. Spülen Sie die Abschnitte mit klarem Wasser ab und färben Sie sie 1 Minute lang mit Eosinlösung ein.</li>
</ol>6. Immunhistochemische Färbung CK19 und F4/80
<ol><li>Die ersten drei Schritte sind die gleichen wie die Schritte der Gewebeeinbettung, des Schneidens und des Entwachsens im H&E-Färbeabschnitt.</li>
	<li>Führen Sie eine Antigenreparatur mit Tris-EDTA-Puffer (10 mmol/l Tris-Base, 1 mmol/l EDTA-Lösung, pH 9,0) durch, erhitzen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in einem Mikrowellenherd bei 95 °C, nehmen Sie sie dann heraus und kühlen Sie sie auf natürliche Weise auf Raumtemperatur ab.</li>
	<li>Legen Sie die Gewebeabschnitte für 10 Minuten in 3%ige Wasserstoffperoxidlösung, um die endogene Peroxidase zu entfernen.</li>
	<li>Behandeln Sie die Scheiben mit 5%igem Ziegenserum, um unspezifische Bindungen zu blockieren.</li>
	<li>Den Schnitten wird ein primärer Anti-Maus-Zytokeratin 19 der Ratte oder ein monoklonaler Anti-Maus-Antikörper F4/80 der Ratte zugegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schnitte mit geeigneten Sekundärantikörpern für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwenden Sie 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) als chromogenes Mittel, um die chromogene Reaktion unter dem Mikroskop zu beobachten.</li>
	<li>Betrachten Sie die Schichten unter einem 40-fachen Mikroskop, um Bilder zu erhalten, und analysieren Sie sie bei Bedarf.</li>
</ol>7. Sirius-Rot-Färbung
<ol><li>Führen Sie die ersten drei Schritte der Gewebeeinbettung, des Schneidens und des Entwachsens durch, wie im Abschnitt H&E-Färbung beschrieben.</li>
	<li>Nachdem die Gewebeschnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt wurden, bedecken Sie jedes Gewebe 1 h lang mit 50 μl Sirius Red Farbstofflösung bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Trocknen Sie die Objektträger 4 Stunden lang auf natürliche Weise bei Raumtemperatur, geben Sie einen Tropfen neutralen Gummi auf jeden Objektträger und verwenden Sie ein Deckglas, um das Gewebe langsam zu bedecken, um Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Objektträger 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um das neutrale Gummi zu festigen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikroskopie mit polarisiertem Kontrastlicht, um die Details der Kollagenablagerung zu beobachten. Wählen Sie ein klares und geeignetes Sichtfeld und passen Sie die Helligkeit und den Weißabgleich des Gesichtsfelds des Mikroskops an. Nehmen Sie Bilder auf und analysieren Sie sie bei Bedarf unter einem 40-fachen Mikroskop.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In unserer Studie verwendeten wir Anti-Ly6G-Antikörper, um Gr-1+-Zellen in einem Mausmodell der mit RRV infizierten Gallengangsatresie zu eliminieren oder zu verringern, um das akute BA-Syndrom zu verbessern, die Überlebensrate zu verlängern und BA-Mäusen den Eintritt in die chronische Phase zu ermöglichen. Eine Reduzierung der Antikörperdosis kann zu einer chronischen BA mit Leberfibrose führen, was darauf hinweist, dass die Anzahl der Gr-1+-Zellen das Ergebnis der BA in der akuten und chronischen Phase verändert. In unserer vorherigen Studie wurden Gr-1+-Zellen nach der Verabreichung von Anti-Ly6G-Antikörpern reduziert und der Gesamtüberlebensstatus der BA-Mäuse verbessert15. Gleichzeitig wurde berichtet, dass Gr-1+-Makrophagen19, Gr-1+-Neutrophile20, Gr-1+-Myeloiden21 und Gr-1+-Granulozyten die Fibrose in einigen Tiermodellen verstärken können22. In dieser Studie waren die Gr-1+-Zellen in Mäusen jedoch mit niedrigen Dosen von Anti-Ly6G-Antikörpern teilweise dezimiert, und es blieben Kollagenablagerungen zurück. Infolgedessen kann mehr Zeit benötigt werden, um die Krankheit gründlicher zu behandeln.
Die Anwendung des Anti-Ly6G-Antikörpers verringerte die Entzündung, bewahrte teilweise die Gallengänge und verhinderte einen akuten BA-induzierten Tod bei Mäusen. Allerdings traten nur 20 bis 30 Prozent der Mäuse in die chronische Phase der BA ein; Dies kann mit dem Zeitpunkt und der Anzahl der Injektionen von Anti-Ly6G-Antikörpern zusammenhängen. Wir müssen diesen wichtigen Punkt weiter untersuchen, um die Erfolgsquote zu verbessern. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass nicht nur Gr-1+ -Zellen, sondern auch andere Immunzellen eine wichtige Rolle spielen können, wie z.B. NK-Zellen, T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen.
Was das Protokoll betrifft, so müssen einige Details beachtet werden. (i) Um das Auslaufen von injizierten Medikamenten zu vermeiden, verwenden wir eine 1-ml-Insulinspritze mit einer Nadel mit einem Durchmesser von 0,33 mm, da der Nadeldurchmesser klein und das Nadelloch in der Spritze klein ist, was dazu beiträgt, die Möglichkeit eines Auslaufens von Medikamenten zu verringern. (ii) Vor der Injektion sollte die Maus fixiert werden, um zu verhindern, dass sie sich bewegt, ein Auslaufen von Medikamenten vermieden wird und somit die experimentelle Wirkung weiter gewährleistet wird. (iii) Während der Medikamenteninjektion injizierten wir das Medikament so weit wie möglich in die Oberfläche oder den unteren Rand der Mausleber, so dass das Medikament in den Bauchraum gelangte und vollständig mit der Leber in Kontakt kam, um seine Wirkung zu entfalten. (iv) Die Injektion erfolgt in der Regel vom rechten Oberschenkel der Maus, da sich der Magen und die Milz der neugeborenen Maus im linken Bauch befinden und der Magen mit Milch gefüllt ist. Wenn die Nadel von der linken Seite eingeführt wird, kann sie leicht den Magen durchstechen, wodurch Milch in den Bauch fließt, oder die Milz durchstechen, was zu Blutungen führt.
CD177 ist ein Homolog von Ly6G, und die Expression von CD177 bei BA-Patienten wurde untersucht. CD177 kann als Marker für die Frühdiagnose von BA bei Kindern verwendet werden, was darauf hindeutet, dass CD177+ -Zellen eine wichtige Rolle im Verlauf von BA23 spielen. Durch die Analyse der RNA-Sequenzierungsdaten fand unser Team heraus, dass CD177-Zellen die dominierende Population der Gr-1+ -Zellen waren; Cd177−/− BALB/ c-Mäuse, die mit RRV geimpft wurden, zeigten einen verzögerten Beginn von BA und eine reduzierte Morbidität und Mortalität18. Daher hat unser chronisches BA-Mausmodell offensichtliche Vorteile für die Untersuchung der Pathogenese und des Krankheitsverlaufs von BA; Es bietet auch ein geeignetes Tiermodell für die Untersuchung potenzieller Behandlungen für BA.

Gallengangsatresie (BA) ist eine schwere hepatobiliäre Erkrankung, die häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auftritt. Konkret handelt es sich um eine obliterative Cholangiopathie mit Neugeborenengelbsucht und blassem Stuhl1. Seine klinischen Merkmale sind eine entzündliche Zerstörung der intrahepatischen und extrahepatischen Gallengänge und eine progressive Fibrose, die sich schließlich zu Leberversagen entwickelt2. Laut Statistik ist die Inzidenz von BA in asiatischen Ländern höher als in europäischen und amerikanischen Ländern, und die Inzidenz von BA in asiatischen Ländern liegt bei 1:8.000. Die Ätiologie der BA umfasst Virusinfektionen, abnorme Gallengangsentwicklung, Immunstörungen und genetische Variationen3. Die Kasai-Chirurgie ist die am häufigsten angewandte Methode zur Verbesserung der Cholestase bei Kindern mit BA, aber letztendlich kann dies das Fortschreiten der Fibrose nicht verhindern4. Die derzeitige Behandlung von BA beruht hauptsächlich auf einer Lebertransplantation, die durch den Mangel an Leberquellen begrenzt ist. Eine eingehende Untersuchung der Pathogenese von BA ist das direkteste Mittel, um die Herausforderungen dieser Krankheit zu lösen. Studien zur Pathogenese der BA stützen sich jedoch hauptsächlich auf BA-Tiermodelle, und es ist entscheidend, ein geeignetes Tiermodell auszuwählen.
Die meisten histopathologischen Studien der BA haben gezeigt, dass Gallengangshyperplasie (BDP), Gallenthrombose und Pfortaderfibrose die wichtigsten pathologischen Merkmale der BA sind, und dass gleichzeitig andere pathologische Merkmale unterschiedlichen Grades vorliegen, wie z. B. portale entzündliche Zellinfiltration und Hepatozytenschwellung 5,6. Gegenwärtig gibt es eine Vielzahl von Mausmodellen, die BA nachahmen, wie z. B. das chronische 3,5-Die-Thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)-gefütterte Mausmodell mit segmentaler Gallengangsobstruktion und Periolangitis unter Beteiligung der extrahepatischen Gallengänge7 und das Mausmodell der Leberfibrose mit einer intraperitonealen Injektion von Tetrachlorkohlenstoff8. Das Modell der Gallengangsligatur (BDL) ist gekennzeichnet durch Gelbsucht und schnelle Pfortaderfibrose9. Das mit Alpha-Naphthylisothiocyanat (ANIT) gefütterte Mausmodell weist eine auf den intrahepatischen Gallengang beschränkte Cholangitis und eine Hepatozytenschädigung auf10. Ein Mausmodell mit verlängerter Gelbsucht wird durch eine verzögerte Inokulation des Rhesusrotavirus (RRV) induziert11. Obwohl es eine Vielzahl von Tiermodellen gibt, insbesondere Mausmodelle, hat jedes Modell seine eigenen Grenzen. Sie können nur einen Teil der Krankheitsmerkmale der BA simulieren, wie z. B. eine akute Entzündung oder Leberfibrose im Prozess der Gallengangsatresie, und es gibt kein Modell, das mit dem Krankheitsverlauf und den pathologischen Merkmalen der BA in hohem Maße übereinstimmt.
Das klassische BA-Mausmodell wird durch RRV induziert, und dieses Modell ist das Modell, das BA beim Menschen am ähnlichsten ist. Während RRV-induzierte BA-Modellmäuse ähnliche klinische Symptome und pathologische Merkmale wie einige der extrahepatischen Gallengangsatresie aufweisen, fehlt in diesem Modell die Leberfibrose, was die eingehende Untersuchung der BA-Mechanismen und die Entwicklung neuer Therapien stark einschränkt12. Daher wurde in dieser Studie ein neuartiges BA-Mausmodell für chronische Leberfibrose entwickelt. Der Anti-Ly6G-Antikörper wurde vor der RRV-Impfung am Tag der Geburt intraperitoneal injiziert. Anschließend wurden viermal 5-10 μg Anti-Ly6G-Antikörper injiziert, wobei zwischen den einzelnen Injektionen ein Abstand von 2 Tagen lag. Die BA-Symptome der Mäuse verbesserten sich, die Überlebenszeit wurde verlängert und die Mäuse traten in das Stadium der chronischen Fibrose ein. Dieses Modell simuliert nicht nur die akute Phasenreaktion von BA, sondern ahmt auch die Prozesse der Leber und der progressiven Fibrose nach. Daher ist es ein geeigneteres Tiermodell für die mechanistische Untersuchung von BA und könnte eine theoretische Grundlage für die Entwicklung zukünftiger Behandlungen für BA bieten.
Das Gr-1-Molekül ist ein myeloider Zelloberflächenmarker, der ursprünglich in neutrophilen Granulozyten exprimiert wurde13. Der Abbau von Anti-Ly6G-Antikörpern reduziert die zirkulierenden Neutrophilen um mehr als 90 % und verändert die von anderen Immunzellen aktivierte Antwort. Die Funktionen von Gr-1+ -Zellpopulationen wurden in verschiedenen Studien mit spezifischen abfangenden Antikörpern beschrieben, wobei unterschiedliche Auswirkungen auf Zytokine und den vermittelten Immunschutz festgestellt wurden14. Wir haben die Funktion von Gr-1+ Zellen in RRV-inokulierten BA-Mausmodellen untersucht. Da jedoch keine Expression des Gr-1-Moleküls beim Menschen nachgewiesen wurde, wurde ein ähnliches Molekül, CD177, bei BA-Patienten untersucht15. Unsere Daten belegen die Bedeutung von Gr-1+ Zellpopulationen, insbesondere in der chronisch fibrotischen Phase der Erkrankung, und liefern ein geeignetes Tiermodell, um mögliche BA-Therapien zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Balb/c Maus</td><td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td><td>20221000112</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus Ly6G</td><td>Bio X</td><td>Zellklon 1A8</td><td>West Lebanon, NH</td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus Cytokeratin 19</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>Klon TROMA III</td><td>Iowa City, IA</td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus F4/80</td><td>R& D Systems</td><td>MAB5580</td><td>Minneapolis, MN</td></tr><tr><td>RRV-Stamm&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>MMU 18006</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Leica Lichtmikroskopie</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI8+DFC7000T</td><td>Wetzlar, Deutschland</td></tr><tr><td>Hitachi Pre-Analytical Process Automation System</td><td>Hitachi</td><td>7600 Klinischer Analysator</td><td>Tokio, Japan</td></tr><tr><td>Isofluran Anästhetikum</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin 123</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83702</td><td></td></tr><tr><td>Sirius Rot Farbstoff</td><td>Leagene</td><td>DC0041</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinmikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Neutralgummi</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td></td></tr></tbody></table>

ein mausmodell der chronischen leberfibrose zur untersuchung der gallengangsatresie

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Die Gallengangsatresie (BA) ist eine tödlich verlaufende Erkrankung mit obstruktiver Gelbsucht und die häufigste Indikation für eine Lebertransplantation bei Kindern. Aufgrund der komplexen Ätiologie und der unbekannten Pathogenese gibt es noch keine wirksamen medikamentösen Behandlungen. Derzeit ist das klassische BA-Mausmodell, das durch Rhesus-Rotavirus (RRV) induziert wird, das am häufigsten verwendete Modell zur Untersuchung der Pathogenese von BA. Dieses Modell zeichnet sich durch Wachstumsverzögerung, Gelbsucht der Haut und Schleimhäute, Tonstuhl und dunkelgelben Urin aus. Die Histopathologie zeigt eine schwere Leberentzündung und Obstruktion der intrahepatischen und extrahepatischen Gallenwege, die den Symptomen der humanen BA ähneln. Die Lebern von Mäusen im Endstadium in diesem Modell haben jedoch keine Fibrose und können die Eigenschaften der Leberfibrose bei klinischer BA nicht vollständig simulieren. In der vorliegenden Studie wurde ein neuartiges BA-Mausmodell für chronische Leberfibrose entwickelt, indem viermal 5-10 μg Anti-Ly6G-Antikörper injiziert wurden, mit Abständen von 2 Tagen nach jeder Injektion. Die Ergebnisse zeigten, dass einige der Mäuse nach dem Zeitraffer erfolgreich eine chronische BA mit typischer Fibrose bildeten, was bedeutet, dass diese Mäuse ein geeignetes Tiermodell für die virusinduzierte Leberfibrose-mechanistische Studie von BA und eine Plattform für die Entwicklung zukünftiger BA-Behandlungen darstellen.

Den Mäusen wurden innerhalb von 24 h nach der Geburt intraperitoneal 5 μg Anti-Ly6G-Antikörper injiziert und 4 h später intraperitoneal 20 μL RRV injiziert. Anschließend wurden bis zum 12. Tag alle 3 Tage 10 μg Anti-Ly6G-Antikörper injiziert (Abbildung 1A). Die mediane Überlebenszeit in der RRV-Gruppe betrug 13 Tage. Im Gegenteil, die meisten Mäuse, die mit dem Antikörper behandelt wurden, entwickelten eine leichte Gelbsucht, und es wurde kein Gewichtsverlust beobachtet (Abbildung 1C). Etwa 20%-30% der Mäuse hatten das BA-Syndrom mit langfristiger Gelbsucht und niedrigem Körpergewicht, überlebten aber mehr als 42 Tage. Nach der Behandlung mit Anti-Ly6G-Antikörpern verringerte sich die Anzahl der Gr-1+-Zellenum 15, und die Mäuse traten in das Stadium der chronischen Fibrose ein, die als chronische BA bezeichnet wird. Die Proben wurden an Tag 12 und Tag 42 entnommen, und Gewebeschnitte, die mit Sirius Red gefärbt waren, zeigten einen allmählichen Anstieg der Leberfibrose. Die chronischen BA-Mäuse, die 42 Tage überlebten, wurden für detaillierte Analysen verwendet. Neben der geringen Größe zeigten die Ohren, Füße und die Schwanzhaut eine ausgeprägte Gelbsucht (blaue Pfeile in Abbildung 1E). Am 6. Tag nach der RRV-Injektion wurde die Kotfarbe der Mäuse heller und die Urinfarbe dunkler; Dies unterschied sich signifikant von der Kontrollgruppe an Tag 12, als die Mäuse der RRV-Gruppe weißen Kot und dunkelgelben Urin aufwiesen. An Tag 42 zeigten Urin und Kot der chronisch BA-Mäuse ebenfalls deutliche Merkmale einer Gelbsucht (Abbildung 1D,E). Die Lebern der BA-Mäuse wurden entnommen und mit denen der Kontrollen verglichen. Die Lebern waren kleiner (Abbildung 2B), nekrotische Läsionen waren mit bloßem Auge sichtbar (Abbildung 2A, schwarzes Dreieck) und ein Segment der Gallengangsatresie wurde auch extrahepatisch beobachtet (Abbildung 2A, weiße Sternchen).
Die Analyse von Lebergewebeschnitten zeigte, dass eine niedrig dosierte Anti-Ly6G-Therapie die Pfortaderentzündung verringerte. An Tag 42 wurde jedoch noch eine entzündliche Zellansammlung in den Lebergewebeschnitten beobachtet (Abbildung 3A). Die Sirius-Rot-Färbung zeigte an Tag 12 nach der RRV-Injektion einen leichten Anstieg der Kollagenablagerung in der Pfortaderregion. Darüber hinaus wurden nach der Behandlung mit dem Anti-Ly6g-Antikörper keine signifikanten Veränderungen der Kollagenexpression beobachtet, jedoch war die Kollagenexpression in BA-Gewebeproben an Tag 42 signifikant erhöht (Abbildung 3B). Bei der Untersuchung unter dem Polarisationsmikroskop wurde festgestellt, dass sich Kollagenfasern im angrenzenden Lebergewebe angesammelt hatten. In den BA-Gewebeproben wurde an Tag 42 eine beträchtliche Ablagerung von Kollagen, überwiegend grün, beobachtet (Abbildung 3C), und die Kollagenablagerung nahm bei Mäusen, die 42 Tage ohne Gewichtszunahme überlebten, weiter zu. Mit der Reduktion der portalen Entzündung wurden an Tag 12 CK19+ Gallengangszellen beobachtet. An Tag 42 waren jedoch kaum reife Gallengänge nachweisbar, obwohl ein Anstieg der CK19+ Gallengangszellen zu beobachten war (Abbildung 4A, rote Pfeile zeigen Gallengangsepithelzellen). Bei extrahepatischen Gallengängen bei Mäusen mit chronischer BA zeigte die serielle Dissektion der Pfortaderregion von Mäusen, dass die extrahepatischen Gallengänge blockiert waren und entzündliche Infiltrate von Makrophagen aufwiesen (Abbildung 4B, schwarze Pfeile zeigen Makrophagen an).
Im Vergleich zu RRV allein verringerte die Behandlung mit einer niedrigen Dosis von Anti-Ly6G-Antikörpern die Leberschädigung in Bezug auf die Leberenzymspiegel am Tag 12 nach der RRV-Impfung. Die Alanin-Aminotransferase- und alkalische Phosphatase-Spiegel in der Leber waren in der chronischen BA-Gruppe höher als in der normalen Kontrollgruppe. Die ausgeprägtesten Veränderungen wurden in den Bilirubinspiegeln gefunden, wobei RRV + Anti-Ly6G-Mäuse reduzierte TBIL-, DBIL- und IBIL-Spiegel bei akuter BA im Gegensatz zu RRV allein aufwiesen. Bei Mäusen mit chronischer BA waren die TBIL-, DBIL- und IBIL-Spiegel erhöht (Abbildung 5), was darauf hindeutet, dass die Leberfunktion im Stadium der chronischen Fibrose der BA signifikant reduziert war.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> Abbildung 1: Die Auswirkungen der Behandlung mit Anti-Ly6G-Antikörpern in einem Mausmodell der mit RRV infizierten Gallengangsatresie . (A) Schematische Darstellung niedriger Dosen von Antikörpern zur Induktion einer akuten und chronischen Phase BA bei Mäusen mit Pfeilen, die den Zeitpunkt der Injektion des Antikörpers und RRV anzeigen. (B) Überlebenskurven der Mäuse in der normalen Kontrollgruppe (Fortsetzung), der Rhesus-Rotavirus-Gruppe (RRV) und der RRV + Anti-Ly6G-Antikörpergruppe. (C) Körpergewichtskurven der Mäuse in jeder Gruppe. (D) Repräsentative Bilder der Mäuse und ihres Kots und Urins in jeder Gruppe an Tag 12. (E) Repräsentative Bilder der Mäuse und ihres Kots und Urins in jeder Gruppe an Tag 42. Die blauen Pfeile zeigen die gelben Ohren und den gelben Schwanz an. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Zhang et al.15 abgedruckt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> Abbildung 2: Die Auswirkungen einer Anti-Ly6G-Antikörperbehandlung auf die Leber in einem Mausmodell der mit RRV infizierten Gallengangsatresie . (A) Vergleich der Leberanatomie und der extrahepatischen Gallengangsfluoreszenzangiographie zwischen chronischen BA-Mäusen (rechts) und gesunden Mäusen an Tag 42. (B) Vergleich der Lebergröße zwischen chronischen BA-Mäusen und gesunden Mäusen. Das schwarze Dreieck deutet auf eine Lebernekrose bei Mäusen mit chronischer BA hin. Das weiße Sternchen weist auf eine extrahepatische Gallengangsatresie hin. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Zhang et al.15 abgedruckt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> Abbildung 3: Lebergewebeschnitte der Mäuse der normalen Kontrollgruppe (Fortsetzung), der Rhesus-Rotavirus-Gruppe (RRV) und der RRV + Anti-Ly6G-Antikörpergruppe an Tag 12 und Tag 42 . (A) Bilder von Lebergewebeschnitten, die mit Hämatoxylin und Eosin (H&amp;E) gefärbt waren. (B) Die Sirius-Rot-Färbung zeigte eine Kollagenablagerung (PSR). (C) Weitere Beobachtung der Schichten mittels Polarisationsmikroskopie (Pol. Licht). Abkürzung: PV = Pfortader. Maßstabsbalken = 50 μm. Diese Abbildung wurde von Zhang et al.15 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> Abbildung 4: Immunhistochemische Färbung von Lebergewebeschnitten aus der normalen Kontrollgruppe (Fortsetzung), der Rhesus-Rotavirus-Gruppe (RRV) und der RRV + Anti-Ly6G-Antikörpergruppe an Tag 12 und Tag 42 . (A) Die Expression des Gallengangsepithelzellmarkers (CK19) in verschiedenen Behandlungsgruppen. (B) Die Infiltration von Entzündungszellen von Makrophagen wurde in verschiedenen Behandlungsgruppen nachgewiesen. Abkürzung: PV = Pfortader. Der rote Pfeil zeigt Epithelzellen des Gallengangs an. Der schwarze Pfeil deutet auf Makrophagen hin. Maßstabsbalken = 50 μm. Diese Abbildung wurde von Zhang et al.15 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> Abbildung 5: Vergleich der Leberfunktion bei Mäusen in verschiedenen Behandlungsgruppen. Nach dem Experiment wurde Mäuseblut entnommen und in der Laborabteilung des Krankenhauses untersucht. Jede Gruppe bestand aus drei bis fünf Mäusen. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001. Abkürzungen: ALT = Alanin-Aminotransferase; AST = Aspartat-Aminotransferase; ALP = alkalische Phosphatase; TBIL = Gesamtbilirubin; DBIL = direktes Bilirubin; IBIL = indirektes Bilirubin. Diese Abbildung wurde von Zhang et al.15 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Wir haben ein Mausmodell für chronische Leberfibrose etabliert, das ein geeignetes Tiermodell für die virusinduzierte Leberfibrose-mechanistische Untersuchung der Gallengangsatresie (BA) und eine Plattform für zukünftige BA-Behandlungen darstellt.

Ein Mausmodell der chronischen Leberfibrose zur Untersuchung der Gallengangsatresie

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Wir haben diese Methode erfolgreich eingesetzt, um ein Mausmodell zu erstellen, das besser mit den pathologischen Veränderungen der Gallengangsatresie übereinstimmt. Mit dieser Technik können die Symptome einer akuten und chronischen Gallengangsatresie simuliert werden, was für die zukünftige Erforschung von Krankheitsmechanismen hilfreich ist. Nach dem Einsatz von Antikörpern wurde die Überlebenszeit der Mäuse verlängert und die Symptome gelindert, was auf die therapeutische Wirkung von Antikörpern bei Gallengangsatresie hindeutet.Nach der Einteilung der neugeborenen Mäuse in verschiedene Gruppen, wie im Manuskript beschrieben, wird jede Maus vier Stunden vor der Rhesus-Rotavirus- oder RRV-Injektion mit einer intraperitonealen Injektion von fünf Mikrogramm Anti-Ly6G-Antikörpern vorbehandelt, um Gr1-positive Zellen zu depletieren. Innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt injizieren Sie der neugeborenen Maus intraperitoneal 20 Mikroliter Rhesusrotaviren oder Kochsalzlösung. Verabreichen Sie nach der RRV-Injektion 20 Mikrogramm Anti-Ly6G-Antikörper in den Bauch der Maus.Überprüfen und notieren Sie täglich das Aussehen, das Gewicht und das Überleben aller Mäuse. Für die intraperitoneale Injektion legen Sie den Bauch der jungen Maus frei, indem Sie die Halshaut mit Zeigefinger und Daumen einer Hand einklemmen und die Hinterbeine der Maus mit Ringfinger und Schwanzfinger sanft halten. Heben Sie die Spritzennadel in einer Neigung nach oben an und führen Sie die Nadel in einem 15-Grad-Winkel zur Haut in den mittleren Oberschenkel des rechten Hinterbeins der Maus ein.Während Sie die Nadel entlang des subkutanen Pfades bewegen, bis sie den rechten Rippenrand der Maus erreicht, richten Sie die Nadel nach unten in die Bauchhöhle und injizieren Sie die Flüssigkeit unter die Leber der Maus. Ziehen Sie die Nadel sofort nach der Injektion heraus. Achten Sie auf Blutungen oder Undichtigkeiten an der Injektionsstelle.Nachdem Sie die Maus am 12. Tag betäubt haben, sezieren Sie sie unter einem Mikroskop. Führen Sie eine Ein-Milliliter-Insulinspritze in die linke Herzkammer ein, um Blut zu entnehmen. Zentrifugieren Sie das Blut bei 400 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und trennen Sie das Serum für Leberfunktionsmessungen.Präparieren Sie die Leber und Milz der Maus mit einer Schere und Pinzette vom umgebenden Gewebe. Fotografieren Sie das allgemeine Erscheinungsbild der Leber und des Gallengangs. Nach der Inhalationsnarkose die Leber, die Gallenblase und die extrahepatischen Gallengänge mit einer Schere und Wattestäbchen freilegen.Injizieren Sie unter einem Haltungsmikroskop fünf bis 10 Mikroliter des Fluoreszenzfarbstoffs Rhodamin 123 mit einer Ein-Milliliter-Insulinspritze in die Gallenblase und machen Sie Fotos. Tauchen Sie frisches Lebergewebe der Maus 24 Stunden lang in 10%Formalin. Sobald das Gewebe in Paraffin eingebettet ist, schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Paraffinmikrotom in Abschnitte mit einer Dicke von vier Mikrometern und legen Sie zwei aufeinanderfolgende Abschnitte auf denselben Objektträger.Legen Sie dann die Scheiben in ein Schneidegestell, entwachsen Sie sie in Xylol und hydratisieren Sie sie nacheinander fünf Minuten lang in absolutem Ethanol, 95 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertem Wasser. Färben Sie die Abschnitte fünf Minuten lang mit Hämatoxylinlösung und weichen Sie sie fünf Sekunden lang in 1%iger Salzsäure und 75%igem Alkohol ein. Nachdem Sie die Abschnitte mit klarem Wasser abgespült haben, färben Sie sie eine Minute lang mit Eosinlösung.Bereiten Sie die Gewebeschnitte für die Färbung vor, wie zuvor gezeigt, und führen Sie eine Antigenreparatur mit Tris-EDTA-Puffer durch. Erhitzen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang in der Mikrowelle bei 95 Grad Celsius, nehmen Sie sie dann heraus und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab. Um die endogene Peroxidase zu entfernen, legen Sie die Gewebeschnitte für 10 Minuten in 3%iges Wasserstoffperoxid und behandeln Sie die Scheiben mit 5%igem Ziegenserum, um die unspezifische Bindung zu blockieren.Als nächstes wird der primäre Anti-Maus-Antikörper Cytokeratin 19 der Ratte oder der monoklonale Anti-Maus-Antikörper F4/80 der Ratte in die Schnitte gegeben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Inkubieren Sie die Schnitte mit geeigneten Sekundärantikörpern für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie 3,3-Prime-Diaminobenzidin als chromogenes Mittel, um die chromogene Reaktion unter dem Mikroskop zu beobachten.Betrachten Sie die Schichten unter einem 40-fachen Mikroskop, um Bilder zu erhalten und sie bei Bedarf zu analysieren. Sobald die Gewebeschnitte präpariert und mit Hämatoxylin gegengefärbt sind, bedecken Sie jedes Gewebe eine Stunde lang mit 50 Mikrolitern Sirius-Rot-Farbstofflösung bei Raumtemperatur. Trocknen Sie die Objektträger vier Stunden lang auf natürliche Weise bei Raumtemperatur, geben Sie einen Tropfen neutralen Gummi auf jeden Objektträger und verwenden Sie ein Deckglas, um das Taschentuch abzudecken, um Blasen zu vermeiden.Lassen Sie die Objektträger 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um das neutrale Zahnfleisch zu festigen. Beobachten Sie die Details der Kollagenablagerung mit Hilfe der Polarisationskontrastlichtmikroskopie. Wählen Sie ein klares und geeignetes Sichtfeld und passen Sie die Helligkeit und den Weißabgleich des Gesichtsfelds des Mikroskops an.Erfassen Sie Bilder und analysieren Sie diese bei Bedarf unter einem 40-fachen Mikroskop. Nach RRV-Injektion betrug die mediane Überlebenszeit in der RRV-Gruppe 13 Tage. Die meisten Mäuse, die mit dem Antikörper behandelt wurden, entwickelten eine leichte Gelbsucht und es wurde kein Gewichtsverlust beobachtet.Die Lebern von BA-Mäusen zeigten nekrotische Läsionen und ein extrahepatisches Segment der Gallengangsatresie. Die Größe der Leber ist kleiner als die der Kontrollen. Die histologische Analyse zeigte, dass eine niedrig dosierte Anti-Ly6G-Therapie die Pfortaderentzündung verringerte.In den Leberschnitten wurde auch an Tag 42 noch eine entzündliche Zellansammlung beobachtet. An Tag 12 kam es zu einem leichten Anstieg der Kollagenablagerung in der Pfortaderregion. An Tag 42 war die Kollagenexpression signifikant erhöht, und es wurde eine erhebliche Kollagenablagerung im BA-Gewebe festgestellt.Die CK19-positiven Zellen wurden an Tag 12 beobachtet. An Tag 42 vermehrten sich CK19-positive Zellen, aber es gab nur wenige reife Gallengänge. Der extrahepatische Gallengang in chronisch BA-Mäusen war blockiert und wies entzündliche Infiltrate von Mikrophagen auf.Die ALT- und ALP-Spiegel in der Leber waren in der chronischen BA-Gruppe höher als in der normalen Kontrollgruppe. Der Gesamtbilirubinspiegel, das direkte Bilirubin und das indirekte Bilirubin waren erhöht, was darauf hindeutet, dass die Leberfunktion im Stadium der chronischen Fibrose der BA signifikant reduziert war. Die Injektion sollte mit Vorsicht erfolgen, um die Mäuseleber nicht zu durchstechen. Nach der Injektion sollten wir uns etwa 10 Sekunden Zeit nehmen, um den Zustand der Maus zu beobachten und das Blut aus der Wunde zu entfernen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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