Entwicklung eines ⁶⁸Gallium-markierten D-Peptid-PET-Tracers für die Bildgebung der programmierten Expression des Todesliganden 1

Bei dieser Methode wird das D-Peptid DPA verwendet, das mit Gallium-68 markiert ist. Der Radiotracer Gallium-68 zur Markierung der DPA ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der PDL-1-Expression im gesamten Körper auf nicht-invasive Weise. Die Verwendung von D-Peptiden verleiht dem Radiotracer eine Hyperresistenz gegen proteolytischen Abbau und verlängert seine metabolische Halbwertszeit erheblich.

Insbesondere kann die Technik zur Bewertung verschiedener Krankheiten eingesetzt werden, wobei spezifische Ziele entdeckt und Radiotracer mit guter Telefonanrufkinetik entwickelt werden. Die Technik kann auch auf die Behandlung von PDL-1-positiven Tumoren angewendet werden, während DPA mit anderen Radionukleotiden wie Lutetium-177 und Actinium-225 markiert wird. Das Verfahren wird von Wu Jiang, einem Forscher aus meinem Labor, demonstriert.

Für die radioaktive Markierung des Peptid-D-Dodecapeptid-Antagonisten (DPA) pipettieren Sie fünf Mikroliter des vorbereiteten Stammpuffers, der DPA enthält, in einen 1,5-Milliliter-Polypropylenbehälter mit einem Schraubverschluss und fügen Sie 400 Mikroliter 68-Galliumtrichlorid in den Behälter hinzu. Die Mischung fünf Sekunden lang vorziehen. Messen Sie den pH-Wert der Mischung mit pH-Teststreifen und stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 molaren Natriumhydroxid auf 4 bis 4,5 ein.

Die Lösung wird fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Reaktionsgemisch unter den im Text genannten Bedingungen einer Radio-HPLC unterzogen, um die radioaktive Markierungsausbeute zu analysieren. Um die Tracerstabilität bei PBS zu testen, fügen Sie 10 Mikroliter Gallium-68-markiertes DPA in Natriumacetatlösung zu 990 Mikrolitern PBS hinzu.

Die Mischung bei 37 Grad Celsius für ein, zwei und vier Stunden unter leichtem Rühren inkubieren. Zu jedem Zeitpunkt werden 200 Mikroliter der Lösung gesammelt und mittels Radio-HPLC analysiert. Um die Tracerstabilität im Mäuseserum zu testen, fügen Sie 10 Mikroliter Gallium-68-markiertes DPA in Natriumacetatlösung zu 90 Mikrolitern des frisch zubereiteten Mäuseserums hinzu und inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für ein, zwei und vier Stunden unter leichtem Rühren.

Sammeln Sie dann zu jedem genannten Zeitpunkt 20 Mikroliter der Lösung und fügen Sie 100 Mikroliter Acetonitrilwassermischung in das gesammelte Aliquot hinzu. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 g für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius. Analysieren Sie den Überstand mittels Radio-HPLC.

Kultivieren Sie die U-87 MG-Zellen in 12-Well-Platten, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist. Entfernen Sie dann das Medium und waschen Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern PBS. Verdünnen Sie das Gallium-68-markierte DPA in frischem Medium auf eine Konzentration von 74 Kilobecquerel pro Milliliter.

Geben Sie dann 0,5 Milliliter des verdünnten Gallium-68-markierten DPA-Puffers in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen mit Gallium-68-markiertem DPA bei 37 Grad Celsius für die Dauer von 10, 30, 40 und 120 Minuten. Nach der Inkubation wird das Medium mit einer Pipette abgesaugt und die Zellen dreimal mit 0,5 Millilitern PBS gewaschen.

Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter 0,5 molare Natronlauge pro Vertiefung hinzu, um die Zellen zu lysieren. Nach 30 Sekunden werden die viskosen Zelllysate in 1,5-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Waschen Sie die Platte, indem Sie zweimal 0,4 Milliliter PBS pro Vertiefung hinzufügen, und sammeln Sie die Waschlösung in den genannten 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Starten Sie den eingebauten Computer des automatischen Gammazählers und legen Sie die Röhren in das eingebaute Regal. Nachdem Sie alle Proben auf das Förderband geladen haben, drücken Sie den Startknopf. Die Ergebnisse werden in der internen Software berechnet, während die Anzeige die zerfallskorrelierte Anzahl pro Minute (CPM) jedes Röhrchens aufzeichnet.

Entnehmen Sie die U-87 MG-Zellen gemäß dem im Text erwähnten Protokoll und saugen Sie die Zellen in eine 0,5-Milliliter-Spritze ab. Nehmen Sie als Nächstes BALB/c Nude-Mäuse und injizieren Sie die Zellen subkutan, wobei eine Anzahl von zwei Tumoren pro Maus beibehalten wird. Überwachen Sie das Tumorwachstum nach der Injektion, bis das Tumorvolumen 100 bis 300 Kubikmillimeter beträgt.

Um eine PET-Bildgebung durchzuführen, injizieren Sie die Tracer intravenös durch einen vorinstallierten Schwanzvenenkatheter. Erstellen Sie mit der Referenzsoftware einen Scan-Workflow auf einem Host-Computer, erstellen Sie anschließend einen Lernordner und legen Sie das Erfassungsprotokoll gemäß den Richtlinien des Herstellers fest. Führen Sie 60 Minuten lang dynamische Scans auf jeder Maus im 3D-Listenmodus durch.

Definieren Sie als Nächstes ein Histogrammprotokoll und ein Rekonstruktionsprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie Hannings Filter mit einem Nyquist-Cutoff von 0,5 Zyklen pro Pixel, um dynamische PET-Bilder für 25 bis 30 Minuten und 55 bis 60 Minuten durch gefilterte Rückprojektion zu rekonstruieren. Generieren Sie MIP-Bilder mit maximaler Intensität für alle Mäuse.

Verabreichung von Gallium-68-markiertem DPA an die U-87 MG mit BALB/c Nacktmäusen durch Schwanzveneninjektion. Nach der Euthanasie wird die Brustwand des Tieres seziert und das Herz geöffnet. Entnehmen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze Blut und pressen Sie das Blut aus der Spritze in ein Radio-Immunoassay-Röhrchen (RIA) mit einem Durchmesser von 13 Millimetern für den Gamma-Zähler.

Entfernen Sie die wichtigsten Organe und Tumore und legen Sie sie in ähnliche RIA-Röhrchen für den Gamma-Zähler. Wiegen Sie alle wichtigen Organe, die im Text erwähnt werden. Messen Sie die Radioaktivität in den gesammelten Organen mit einem automatischen Gammazähler und korrigieren Sie die Werte.

Berechnen Sie den Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm nassem Gewebe. Die Gallium-68-markierte DPA wies eine hohe radiochemische Verunreinigung auf. Es war sowohl im PBS- als auch im Mausserum sehr stabil und zeigte nach der vierstündigen Inkubation keine Gallium-68-Zersetzung oder Peptidhydrolyse.

Etwa 60 % der U-87 MG-Zellen wurden durch Durchflusszytometrie auf den Tod des Liganden eins oder PDL-1-positiv programmiert, und die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte eine starke Expression von PDL-1 in den U-87 MG-Zellen. U-87 MG-Zellen zeigten eine zeitabhängige Aufnahme von Gallium-68-markiertem DPA, die sich nach Verwendung eines PDL-1-Inhibitors, BMS-202, als Blocker signifikant reduzierte. Die geschätzte Bindungsaffinität für BMS-202 betrug 43,8 Nanomol pro Liter, wenn Gallium-68-markiertes DPA als Konkurrent verwendet wurde.

Ganzkörper-PET-Bilder zeigten eine hohe Gallium-68-markierte DPA-Akkumulation im Tumor nach 30 und 60 Minuten Injektion. Ein paralleles Experiment zeigte 60 Minuten nach der Injektion eine geringe Gallium-68-markierte DPA-Akkumulation in den Bon-1-Tumoren der Negativkontrolle. Darüber hinaus zeigte die immunhistochemische Färbung, dass die U-87 MG-Zellen eine beträchtliche PDL-1-Expression aufwiesen, nicht jedoch der Bon-1-Tumor.

Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung zeigte eine ähnliche Zellmorphologie zwischen den beiden Tumorgeweben. Die Ex-vivo-Bioverteilungsstudie zeigte eine schnelle Beseitigung von Radioaktivität und Blut in den meisten analysierten Organen, einschließlich Herz, Leber, Lunge und Muskeln. Die Niere akkumulierte die höchste Menge an Radioaktivität, während der Tumor zu allen Zeitpunkten die zweithöchste Traceraufnahme aufwies.

Die Struktur des D-Peptids ist der wichtigste Schritt, indem eine effiziente Methode zur Markierung von DPA mit Gallium-68 verwendet wird. Diese Technik ebnete den Weg für die Nutzung des PET-Tests als wirksames Radiopharmazeutika zur Behandlung verschiedener Krebsarten, sowohl als PET-Tracer als auch als Radiodiagnostika.