Name: Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Kryo-STEM-Tomographie Organelle in intakten Zellen mit Nanometerauflösung visualisiert. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht 3D-Bildgebung mikrometerdicker biologischer Proben.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir sind sehr dankbar für die kontinuierliche und konstante Unterstützung durch den Autor und Betreuer des SerialEM-Softwarepakets, David Mastronade, und Günther Resch. P.K. wurde vom Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF) durch ein Schrödinger-Stipendium J4449-B gefördert. Zum Zwecke des Open Access haben die Autoren eine CC-BY-Lizenz für das öffentliche Urheberrecht auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. M.E. und S.G.W. würdigen die Förderung durch die Israel Science Foundation, Grant Nr. 1696/18, und durch das Horizon 2020 Twinning-Projekt der Europäischen Union, ImpaCT (Grant Nr. 857203). M.E. bedankt sich für die Förderung durch den ERC im Projekt CryoSTEM (Grant Nr. 101055413). M.E. ist Inhaber des Sam and Ayala Zacks Professorial Chair und Leiter des Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Das Labor von M.E. hat von der historischen Großzügigkeit der Familie Harold Perlman profitiert. Wir bedanken uns auch für die Förderung durch die Europäische Union. Die geäußerten Ansichten und Meinungen sind jedoch nur die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die der Europäischen Union oder der Exekutivagentur des Europäischen Forschungsrats wider. Weder die Europäische Union noch die Bewilligungsbehörde können dafür verantwortlich gemacht werden.

<ol><li>Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons+of+cryo-tomography+to+larger+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterizing+cells+using+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterizing cells using tomography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+cryo+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+nucleation+of+hemozoin+at+the+digestive+vacuole+membrane+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+heme+detoxification+in+the+malaria+parasite+by+in+situ+correlative+X-ray+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Sviben, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuole-like+compartment+concentrates+a+disordered+calcium+phase+in+a+key+coccolithophorid+alga%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga.</a> Nature Communications. 7, 11228(2016).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).</li>
<li>Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+visual+proteomics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards visual proteomics at high resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187(2021).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+ferritin+crystallization+revealed+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography.</a> Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).</li>
<li>Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy%3A+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Imaging+and+Electron+Physics%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy: biological applications.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).</li>
<li>Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSTEM+tomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CryoSTEM tomography in biology.</a> Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition-A+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+theoretical+basis+and+limitations+of+cryo-STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens.</a> Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+remote+data+collection+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63923(2022).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62383(2021).</li>
<li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+electron+tomography+of+cells+using+SerialEM+and+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Imaging%3A+Electron+Tomography+and+Related+Techniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTOMO%3A+An+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> Journal of Structural Biology. (6), 100068(2022).</li>
<li>Seifer, S., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClusterAlign%3A+A+fiducial+tracking+and+tilt+series+alignment+tool+for+thick+sample+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Imaging%22%5BJournal%5D)">ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography.</a> Biological Imaging. 2, 7(2022).</li>
<li>Waugh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+deconvolution+processing+for+STEM+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).</li>
<li>Kirchenbuechler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-STEM+tomography+of+intact+vitrified+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts.</a> AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lazić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+structures+from+iDPC-STEM+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution.</a> Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).</li>
<li>Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+STEM+with+simultaneous+phase+and+depth+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).</li>
<li>Ophus, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+scanning+transmission+electron+microscopy+%284D-STEM%29%3A+from+scanning+nanodiffraction+to+ptychography+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+phase+retrieval+of+biological+specimens+using+cryo-electron+ptychography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography.</a> Nature Communications. 11 (1), 2773(2020).</li>
<li>Nellist, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principles+of+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">The principles of STEM imaging.</a> Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).</li>
<li>Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+isolated+protein-bound+metal+ions+by+single-particle+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Das Protokoll soll biowissenschaftlichen Mikroskopikern helfen, die daran interessiert sind, eine 3D-Ansicht von intrazellulären Organellen in Regionen der Zelle zu erhalten, die für die konventionelle TEM-Tomographie nicht zugänglich sind. Das gleiche Protokoll kann auch für die STEM-Tomographie von Kunststoffschnitten verwendet werden, wobei die Belichtungsbeschränkungen gelockert werden. Das Protokoll sollte als Ausgangspunkt und nicht als eine Reihe harter Regeln betrachtet werden. In der Tat liegt die Stärke von MINT in seiner Flexibilität; Es gibt nicht den einen richtigen Weg, es zu bedienen.
Wir betonen, dass sich STEM per se nur auf die gescannte Sonde bezieht und nicht die Bildentstehung definiert. Der Kontrast hängt in erster Linie von der Konfiguration der Detektoren ab. Die einfacheren Methoden verwenden Detektoren mit axialer Symmetrie, entweder eine Scheibe, die auf der optischen Achse zentriert ist, oder einen Ring, der sie umgibt. Im Allgemeinen nehmen wir, wenn die Beleuchtung direkt auf den Detektor trifft, ein BF-Bild auf, bei dem die (elektronenstreuende) Probe dunkel erscheint; Umgekehrt, wenn der Detektor nur gestreute Elektronen sammelt, nehmen wir ein DF-Bild auf, in dem die dichte Probe hell erscheint. Wenn geeignete Hardware verfügbar ist, kann SerialEM diese beiden Signale gleichzeitig erfassen und aufzeichnen. Es stehen noch ausgefeiltere Konfigurationen zur Verfügung, die von Detektoren mit mehreren Segmenten bis hin zu vollständig pixeligen Kameras reichen. Eine Phasenkontrastbildgebung kann beispielsweise durch die Auswertung der Differenz zwischen außeraxialen Detektorelementen32,33 erreicht werden. Die Erfassung des gesamten 2D-Streumusters (Beugung) pro Pixel definiert die als 4D STEM34 bekannte Methode, die die Rekonstruktion mehrerer Bildkontraste aus denselben Originaldaten ermöglicht. Das vierdimensionale STEM ermöglicht die Elektronenptychographie, die eine weitere Möglichkeit bietet, den Phasenkontrast35 zu erhalten.
Wir haben uns auf die spezielle STEM-Modalität konzentriert, die wir für die Untersuchung von Organellen und intakten Zellen oder mikrometerdicken Zellabschnitten für am nützlichsten halten. Dies beinhaltet insbesondere den Einsatz von BF-Bildgebung mit einem kleinen Semikonvergenzwinkel in der Beleuchtung und einem relativ großen Sammelwinkel am Detektor. Die kleine Konvergenz sorgt für eine große Schärfentiefe, so dass die gesamte Probe während der gesamten Neigungsreihe19 scharf bleibt. In der Praxis kann mit einem guten Mikroskoptisch auch die Notwendigkeit einer Fokuseinstellung während der Aufnahme entfallen. Der Preis ist ein Kompromiss bei der Auflösung, wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben. Wir haben 4k-Bilder mit einer Sonde von ~2 nm vorgeschlagen, die bei 1 nm Pixelabstand ein Sichtfeld von 4 μm erreicht. Der Leser wird jedoch nachdrücklich zum Experimentieren aufgefordert. Die zweite Überlegung betrifft die Seite des Detektors. Wenn die Beleuchtungsscheibe den BF-Detektor auf der Achse nicht ausfüllt, wird der Phasenkontrast unterdrückt und der Streukontrast (Amplitudenkontrast) dominiert. Dieser Zustand wurde als inkohärenter Hellfeldkontrast36 bezeichnet. Die Frage ist, mit welchem Anteil untergefüllt werden soll, und die Antwort hängt von der Stichprobe ab. Eine sehr dünne Probe zeigt den besten Kontrast, wenn der Detektor vollständig gefüllt ist (d. h. der Erfassungswinkel entspricht dem der Beleuchtung), aber eine dickere Probe streut die gesamte Intensität weg und hinterlässt ein verrauschtes Signal mit schlechtem Kontrast. Eine nützliche Faustregel lautet: Je dicker die Probe, desto größer sollte der äußere Grenzwinkel des BF-Detektors21 sein. Die Größe und Position des Detektors sind natürlich festgelegt, so dass die Größe der Beugungsscheibe anhand der Kameralänge angepasst wird, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Wenn der Detektorverstärker so eingestellt ist, dass das Signal den Dynamikbereich ausfüllt, aber bei direkter Beleuchtung nicht sättigt (1.12.3), kann die Kameralänge erhöht werden, bis eine angemessene Signalintensität und ein angemessener Kontrast erreicht sind. Auch hier wird der Leser zum Experimentieren angeregt. Die Kunst liegt sozusagen in den Winkeln.
Ein weiterer Parameter, der im Protokoll nicht behandelt wird, ist die Beschleunigungsspannung des Mikroskops. Die Wechselwirkung der Leuchtelektronen mit der Probe ist bei einer niedrigeren Spannung stärker. Wenn alles andere gleich ist, können wir einen höheren Kontrast bei niedrigerer Spannung erwarten. Andererseits ist es das Einsetzen von Mehrfachstreuung innerhalb der Probe, das die nutzbare Probendicke begrenzt, so dass eine höhere Spannung die Verwendung dickerer Proben ermöglicht. Diese Effekte sind jedoch eher subtil. Ähnlich sind unsere bisherigen Erfahrungen mit 200 kV und 300 kV Beschleunigungen.
Wenn man bedenkt, was von STEM in Bezug auf die Auflösung zu erwarten ist, hängt dies wiederum von der Probe und der Detektorkonfiguration ab. Mit Hilfe eines Einzelpartikelanalyseansatzes konnten Metallionen auf Ferritin mittels ringförmigem Dunkelfeld-STEM mit einer Genauigkeit von wenigen Ångström lokalisiert werden37. In jüngerer Zeit wurde eine Sub-Nanometer-Auflösung für Virus- und Proteinproben mit Hilfe von Bildern erreicht, die mit integriertem differentiellem Phasenkontrast (iDPC) STEM32 sowie Ptychographie35 gewonnen wurden. Für einzigartige Objekte in dickzelligen Proben und mit den hier beschriebenen Methoden ist eine so hohe Auflösung nicht realistisch. Die optimale Auflösung ist der Sondendurchmesser, der sich auf den beschriebenen Semikonvergenzwinkel bezieht. Andere Faktoren verschlechtern die Auflösung, insbesondere eine grobe Pixelabtastung, um ein großes Sichtfeld zu erreichen, Fehlausrichtungen in der Neigungsreihe und die Ausbreitung des Sondenstrahls bei der Übertragung. Die Bilder lassen sich gut mit der Kunststoffschnitttomographie vergleichen. Mit dem hier beschriebenen Aufbau sollte es zum Beispiel gut sein, den hohlen Kern der Mikrotubuli zu erkennen, nicht aber die einzelnen Protofilamente.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich sowohl MINT-Methoden als auch Hardware in einer Entwicklungsphase befinden. Wir können davon ausgehen, dass sich Innovationen in der Bildgebung auch auf die Tomographie auswirken und MINT in Bereiche führen werden, die mit anderen Techniken bisher nicht zugänglich waren. Wir gehen davon aus, dass eine Konvergenz mit korrelativer kryogener Fluoreszenzbildgebung auf Basis moderner optischer Superauflösungsmethoden besonders fruchtbar sein wird. Die Skala der Organellen von 100-1.000 nm ist ein ideales Ziel für diese neuen Methoden.

Die dreidimensionale (3D) Visualisierung von Organellen ist eine überragende Aufgabe in der modernen Zellbiologie. Angesichts der Skalen, die von Dutzenden von Nanometern für sekretorische Vesikel bis zu vielen Mikrometern für den Zellkern reichen, ist es schwierig, eine einzige Mikroskopietechnik zu finden, die für alle Anwendungen geeignet ist. Während die moderne Fluoreszenzmikroskopie einen Großteil des Bereichs in Bezug auf die Auflösung abdecken kann, erscheinen nur die markierten Moleküle. Das zelluläre Theater bleibt das Reich der Elektronenmikroskopie. Herkömmliche Methoden der chemischen Fixierung, der plastischen Einbettung und der Färbung mit Schwermetallen sind stark invasiv, so dass die Ergebnisse von den Details der Probenvorbereitung abhängen können. Die Kryo-EM hingegen ist durch die Notwendigkeit eingeschränkt, das wässrige Medium zu verglasen; Eiskristalle, die sich bilden, beugen die Elektronenbeleuchtung und verursachen Kontrastartefakte mit höherem Kontrast als das interessierende organische Material.
In den letzten zehn Jahren hat sich die Zahl der EM-Bildgebungstechniken, die für zelluläre Studien entwickelt oder angepasst wurden, stark verbreitet1. Das Hochdruckgefrieren in Kombination mit iterativem fokussiertem Ionenstrahlfräsen (FIB) und serieller Oberflächenbildgebung mit dem Rasterelektronenmikroskop (d. h. FIB-REM) ist derzeit die Methode der Wahl für große Proben2. Die kryogene weiche Röntgentomographie (Kryo-SXT) eignet sich für Proben mit einer Größe von mehreren Mikrometern, begrenzt durch die charakteristische Absorptionslänge der weichen Röntgenstrahlen in Wasser 3,4,5. Diese Skala umfasst viele intakte Zelltypen, und die quantitative Natur des Röntgenabsorptionskontrasts fügt einen Aspekt der Konzentrationsmessung6 oder Spektroskopie7 hinzu. In Kombination mit der Subtomogramm-Mittelung bietet die Kryo-Transmissionselektronentomographie (Kryo-ET), die auf der Phasenkontrast-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) basiert, die höchste Auflösung für Makromoleküle oder -komplexe 8,9,10. Es ist jedoch selten, dass intakte Organellen so regelmäßig sind, dass sie im Ganzen gemittelt werden können. Darüber hinaus ist der konventionelle Modus der Weitfeld-TEM für die Probendicke auf einige hundert Nanometer begrenzt, und zwar durch die Kombination von inelastischer Streuung (mit Energieverlust) in der Probe und chromatischer Aberration in der magnetischen Objektivlinse11,12. Die große Energieverteilung erfordert die Verwendung eines Energiefilters, um den resultierenden unscharfen Dunst zu entfernen, aber die empfindliche Probe erleidet immer noch Strahlungsschäden, während das Bildsignal mit zunehmender Dicke exponentiell schwächer wird.
Der alternative Bildgebungsmodus, Scanning Transmission EM (STEM), umgeht die Notwendigkeit der Energiefilterung und behält die inelastisch gestreuten Elektronen für die Bilderzeugung zurück, wenn auch derzeit mit einer geringeren Auflösung als bei der TEM-Tomographie (Abbildung 1). Tatsächlich entsteht kein wirkliches Bild. Stattdessen werden wie bei einem scannenden EM Punkt für Punkt Messungen durchgeführt und das Bild vom Computer zusammengesetzt. Die Vergrößerung wird nur durch die Größe der Scanschritte bestimmt, ohne die Objektivströme zu verändern. Bei richtiger Konfiguration kann der nutzbare Bereich der Probendicke für die Kryo-STEM-Tomographie (CSTET) 1,5 oder sogar 2 μm erreichen, obwohl die Komfortzone, in der die Nutzsignalintensität einen signifikanten Bruchteil der Beleuchtung ausmacht, bei etwa 600-900 nm liegt11,13. Dies reicht aus, um einen großen Teil des Zytoplasmas und gelegentlich einen Rand des Zellkerns zu sehen. In der Praxis stellen wir fest, dass die Vitrifikation mit der Standardmethode des Eintauchens in eine kryogene Flüssigkeit eine strengere Beschränkung der Dicke darstellt als die STEM-Bildgebung. Das Ziel dieses Videoartikels ist es, die Integration von CSTET in den Werkzeugkasten für die Bildgebung von Zellen und Organellen in Forschungslabors und Mikroskopieeinrichtungen zu erleichtern.
Die erste Herausforderung besteht darin, dass die Mikroskopoperationen im CSTET für Life-Science-Anwendungen noch nicht so standardisiert sind wie für die Kryo-TEM-Tomographie. STEM-Hardware wurde selten (wenn überhaupt) auf den Kryo-EM-Markt ausgerichtet. Dies ändert sich jedoch mit der neuesten Generation von Mikroskopen, und viele bestehende Werkzeuge können nachgerüstet werden. MINT als Technik hat sich in den Materialwissenschaften durchgesetzt, wo auch das Interesse an kryogenen und niedrig dosierten Methoden aufkeimt14,15. Die materialwissenschaftliche Literatur ist reich an Akronymen BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM usw., die zur Verwirrung beitragen. Wir bieten hier einen empfohlenen Ausgangspunkt, der nach unserer gemeinsamen Erfahrung am Weizmann Institute of Science das allgemeinste Protokoll für brauchbare Ergebnisse auf der Grundlage der Hellfeld-STEM-Bildgebung (BF) bietet16. Es erschöpft oder lotet die Bandbreite der Möglichkeiten keineswegs aus, sondern dient als Grundlage für weitere Erweiterungen. Während wir den Schwerpunkt auf Kryo-STEM legen, ist der größte Teil des Protokolls gleichermaßen relevant für die Raumtemperatur-STEM-Tomographie von in Kunststoff eingebetteten Abschnitten.
Das Wesen von STEM besteht darin, die Probe mit einer fokussierten Elektronensonde (Abbildung 1), dem Beleuchtungskegel, abzutasten und Signale aus der Beugungsebene (Streuung) in der Transmission Pixel für Pixel aufzuzeichnen, um 2D-Bilder zu erzeugen17,18. Amorphe Proben, einschließlich der meisten zellulären Materialien, erzeugen bei der Übertragung ein diffuses Streumuster. Die einfachste praktische STEM-Konfiguration besteht darin, einen kreisförmigen Detektor zu platzieren, um die zentrale Scheibe (d. h. die Sondenbeleuchtung, die ohne Probe übertragen würde) aufzuzeichnen. Die Probe streut Elektronen von diesem Beleuchtungskegel so weit weg, dass das Signal abnimmt. Dadurch entsteht ein BF-Bild - die Probe erscheint dunkel auf einem hellen Hintergrund. Ein ringförmiger Detektor kann auch (oder stattdessen) verwendet werden, um die Streuung der Probe außerhalb des Beleuchtungskegels zu detektieren. Wenn die Probe entfernt wird, gibt es kein Signal. Wenn eine Probe an Ort und Stelle ist, erscheinen Objekte im Dunkelfeldbild (DF) hell auf dunklem Hintergrund. Die Nomenklatur für STEM (BF, ringförmiges Dunkelfeld [ADF], hochwinkliges ringförmiges Dunkelfeld [HAADF] usw.) bezieht sich hauptsächlich auf die Bereiche der Sammelwinkel für die Detektoren.
Der Konvergenzwinkel der Beleuchtung stellt eine wesentliche Anpassung der STEM an die zelluläre Tomographie dar. Wenn eine hohe Auflösung oberste Priorität hat, sollte der Konvergenzwinkel so groß wie möglich sein. (Dies ist vergleichbar mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie; die Auflösung wird durch den Sondendurchmesser bestimmt, der als Wellenlänge geteilt durch die numerische Apertur skaliert. Beachten Sie, dass wir uns auf den Halbwinkel- oder Halbkonvergenzwinkel für EM beziehen.) Wenn die Schärfentiefe im Vordergrund steht, bietet ein Kompromiss bei der Auflösung hingegen einen großen Vorteil, da der fokussierte Strahl über eine Entfernung, die dem Doppelten der Wellenlänge geteilt durch den Halbwinkel im Quadrat entspricht, ungefähr parallel bleibt. Im Idealfall bleibt das gesamte Zellvolumen im Fokus19. Bei 300 keV beträgt die Elektronen-deBroglie-Wellenlänge beispielsweise 0,002 nm, so dass eine Konvergenz von 1 mrad eine Auflösung von 2 nm und eine Schärfentiefe von 4 Mikrometern ergibt. Unter diesen Bedingungen kann die Tomographie auch ohne Fokussierung während des Datenerfassungsprozesses durchgeführt werden, sondern nur einmal zu Beginn der Erfassung. Ein herkömmliches, tomographiefähiges STEM kann einen Semikonvergenzwinkel von 7 oder 8 mrad erreichen; Daher könnten wir prinzipiell eine Auflösung in der Größenordnung von 0,25 nm erreichen, dann aber mit einer Brenntiefe von nur 62 nm. Das ist eindeutig zu dünn für die zelluläre Bildgebung. Fortschrittlichere Mikroskope mit drei Kondensorlinsen bieten eine stufenlose Einstellung des Semikonvergenzwinkels über einen beträchtlichen Bereich. Bei der traditionelleren Konfiguration mit zwei Kondensatoren wird die Konvergenz diskret durch die Kondensoröffnung (C2) festgelegt.
Für robuste, in Kunststoff eingebettete Proben kann man bei jeder Neigung eine Fokusreihe aufzeichnen und sie für eine hohe Auflösung20 kombinieren, aber für kryogene Proben ist das Strahlungsbudget zu stark eingeschränkt. Schließlich sollte man bei der Abwägung der Vorteile der BF- oder DF-Bildgebung für dicke Proben die Auswirkungen der mehrfachen elastischen Streuung in der Probe berücksichtigen. Das BF-Signal wird durch Mehrfachstreuung weniger verfälscht und zeigt eine höhere Auflösung für dicke Proben16,21.
Eine nützliche Faustregel war, Sammelwinkel festzulegen, die um ein Vielfaches größer sind als die Konvergenz. Je dicker die Probe, desto größer sollte die Auffangscheibe sein. Eine zu kleine Scheibe führt zu einer geringen Signalintensität. Eine zu große Scheibe führt zu einem schlechten Bildkontrast, da nur die Streuung mit dem höchsten Winkel dazu beiträgt. Die Sammelwinkel sollten für eine bestimmte Probe optimiert werden. Die Detektorwinkel in Abhängigkeit von der (Beugungs-)Kameralänge müssen unabhängig voneinander kalibriert werden. Sie können bequem von der Mikroskop-Software angezeigt werden. In der Praxis ist ein Faktor von zwei bis fünf im Verhältnis von Sammel- zu Beleuchtungshalbwinkeln, θ bzw. α (Abbildung 1), ein empfohlener Ausgangspunkt für das CSTET zellulärer Proben.
Das folgende Protokoll beschreibt den STEM-Tomographie-Betrieb mit der beliebten SerialEM-Software zur Mikroskopsteuerung22,23. SerialEM ist nicht an einen bestimmten Hersteller gebunden und wird häufig in der TEM-Tomographie eingesetzt. Die meisten Vorgänge beim Einrichten der Tomographie können direkt aus TEM übernommen werden. Die Strategie von SerialEM besteht darin, das Scansystem als Kamera zu modellieren. Dies ermöglicht den einfachen Übergang von TEM zu STEM. Man sollte jedoch bedenken, dass Parameter wie Vergrößerung und Binning völlig künstlich sind. Wichtige Parameter sind das Sichtfeld in Mikrometern, die Anzahl der Pixel im Sichtfeld und die Belichtungszeit. Der Pixelabstand oder das Sampling ist das lineare Feld geteilt durch die Anzahl der Pixel, während die Verweilzeit die Anzahl der Pixel geteilt durch die Belichtungszeit ist.
Die Mindestkonfiguration für MINT und CSTET umfasst drei Funktionen des Mikroskops: einen Scan-Generator, einen STEM-Detektor und eine Tomographie-Steuerungssoftware. Das Protokoll bezieht sich auf die Nomenklatur von FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), aber die Konzepte sind generisch. Die proprietäre Software von TFS wurde in JoVE für TEM24 beschrieben, und die STEM-Bedienung ist sehr ähnlich.
Wir gehen davon aus, dass das Mikroskop vorab durch das Serviceteam oder erfahrenes Personal ausgerichtet wurde und eine Säulenausrichtung durch Laden einer Datei aufgerufen werden kann. Kleinere Anpassungen werden als direkte Ausrichtungen bezeichnet und können in sogenannten FEG-Registern (TFS-Mikroskopen) gespeichert werden. Zu den direkten Ausrichtungen gehören Rotationsmittelpunkt, Drehpunkte, Beugungsausrichtung und Kompensation von Kondensator-Astigmatismus. Anpassungen müssen iterativ durchgeführt werden. Beachten Sie, dass TFS-Mikroskope unterschiedliche Nanosonden- (nP) und Mikrosondenmodi (μP) implementieren. Für eine gegebene Kondensoröffnung bieten diese ein relativ enges oder weites Sichtfeld mit paralleler Beleuchtung in TEM bzw. einem mehr oder weniger konvergenten (eng fokussierten) Elektronenstrahl in STEM. Andere Hersteller verwenden andere Schemata, um den Bereich der Konvergenzwinkel abzudecken.
Bevor Sie beginnen, sollten das Sichtfeld L und die Abtastung (Pixelbreite) l in Abhängigkeit von der untersuchten Probe ausgewählt werden. Beispielsweise sollte für l = 1 nm/Pixel ein Bild mit 4.000 x 4.000 Pixeln gewählt werden, das ein Sichtfeld von 4 μm2 abdeckt. Die Auflösung wird bestenfalls doppelt so hoch sein wie die räumliche Abtastung, also 2 nm, und der Sondendurchmesser d sollte damit übereinstimmen. Die Kalibrierung des Sondenwinkels würde den Rahmen dieses Protokolls sprengen, daher gehen wir davon aus, dass eine Tabelle oder ein Bildschirmmesswert verfügbar ist. Der Sondendurchmesser entspricht in etwa der Elektronenwellenlänge dividiert durch den Halbkonvergenzwinkel (im Bogenmaß): d = λ/θ. Die Wellenlänge λ beträgt 0,002 nm für 300 keV und 0,0025 nm für 200 keV-Elektronen, so dass θ von 1 mrad einen Spotdurchmesser von 2 bzw. 2,5 nm ergibt.
Das Protokoll wird in einer Abfolge von zunehmender Komplexität präsentiert. Die erste Aufgabe besteht darin, ein STEM-Bild zu erstellen, das von der Software des Mikroskopherstellers abhängt, und dann eine Tilt-Serie, für die wir SerialEM verwenden. Viele Leser werden zweifellos mit SerialEM vertraut sein, so dass die komplizierteren Aufgaben von selbst kommen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Verfahren strikt zu befolgen. Entwicklungen im Bereich der Automatisierung können sowohl für MINT als auch für TEM direkt umgesetzt werden. Erfahrene Anwender werden das Protokoll wahrscheinlich invertieren, beginnend mit der korrelativen Registrierung von Fluoreszenzkarten und der weiteren Einrichtung der Batch-Tomographie. Weitere Details finden Sie in der umfangreichen Dokumentation und den Tutorial-Bibliotheken für SerialEM selbst, einschließlich eines kürzlich erschienenen JoVE-Artikels über die neuesten Entwicklungen in der Automatisierung25.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; SerialEM</td><td>University of Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM ist eine kostenlose Softwareplattform für die Steuerung und Datenerfassung von Mikroskopen.</td></tr><tr><td>STEM-fähiges Transmissionselektronenmikroskop</td><td></td><td></td><td>Das Protokoll wurde auf der Grundlage von Erfahrungen mit mehreren Mikroskopen von Thermo Fisher Scientific geschrieben: Titan Krios, Talos Arctica und Tecnai T20-F. Prinzipiell sollte es auch auf andere Hersteller anwendbar sein.</td></tr></tbody></table>

visualisierung von organellen in situ mittels kryo-stem-tomographie

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) beruht auf der Bildgebung biologischer oder organischer Proben, die in ihr natives wässriges Medium eingebettet sind. Wasser wird ohne Kristallisation zu einem Glas verfestigt (d. h. verglast). Die Kryo-EM-Methode wird häufig verwendet, um die Struktur biologischer Makromoleküle in jüngster Zeit mit einer nahezu atomaren Auflösung zu bestimmen. Der Ansatz wurde auf die Untersuchung von Organellen und Zellen mittels Tomographie ausgeweitet, aber die konventionelle Methode der Weitfeld-Transmissions-EM-Bildgebung weist eine starke Einschränkung in der Probendicke auf. Dies hat dazu geführt, dass dünne Lamellen mit einem fokussierten Ionenstrahl gefräst werden. Die hohe Auflösung wird durch Subtomogramm-Mittelung aus den Rekonstruktionen erreicht, aber dreidimensionale Beziehungen außerhalb der verbleibenden Schicht gehen verloren. Die Dickenbegrenzung kann durch gescannte Sondenbildgebung umgangen werden, ähnlich wie beim Raster-EM oder dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Während die Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) in den Materialwissenschaften eine atomare Auflösung in Einzelbildern liefert, erfordert die Empfindlichkeit kryogener biologischer Proben gegenüber Elektronenbestrahlung besondere Überlegungen. Dieses Protokoll stellt einen Aufbau für die Kryotomographie mit STEM dar. Die grundsätzliche topische Konfiguration des Mikroskops wird sowohl für Zwei- als auch für Drei-Kondensor-Systeme beschrieben, während die Automatisierung durch die nicht-kommerzielle SerialEM-Software erfolgt. Verbesserungen bei der Batch-Erfassung und der korrelativen Ausrichtung auf zuvor erfasste Fluoreszenzkarten werden ebenfalls beschrieben. Als Beispiel zeigen wir die Rekonstruktion eines Mitochondriums, wobei wir auf die innere und äußere Membran und die Calciumphosphat-Granula sowie auf die umgebenden Mikrotubuli, Aktinfilamente und Ribosomen hinweisen. Die Kryo-STEM-Tomographie zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Theater der Organellen im Zytoplasma und in einigen Fällen sogar die Kernperipherie der adhärenten Zellen in Kultur aufdeckt.

Eine vollständige Rastermontage, die in MINT erstellt wurde, zeigt die Bereiche mit den interessierenden Zellen (Abbildung 4). Beachten Sie, dass sich das Bild im Dunkelfeld befindet, sodass leere Löcher dunkel erscheinen. Die Zellen erscheinen teilweise hell, wo die Elektronen in Richtung des HAADF-Detektors gestreut werden. An den dicksten Stellen, typischerweise in der Mitte oder in der Nähe der Rasterbalken, wird der Kontrast wieder dunkel. Dies ist auf die Mehrfachstreuung zurückzuführen, bei der die Elektronen Winkel erreichen, die vom Detektor nicht erfasst werden. In der Praxis sind diese Bereiche für die Tomographie zu dick.
Der nächste Schritt umfasst Karten mit mittlerer Vergrößerung (Abbildung 10). Diese werden oft als Medium-Montage-Maps oder Quadrat-Maps bezeichnet und beziehen sich eher auf die Rasterquadrate als auf die Form. Selbst im niedrigsten Mikrosonden-STEM-Modus werden sie auch als Montagebilder aufgenommen. Ein Klick auf das Element im Navigator-Fenster lädt das Kartenbild in das Hauptfenster. Innerhalb dieses Bereichs werden spezifische Punkte für die Tomogrammaufnahme ausgewählt. Verwenden Sie den Vorschaumodus, um den Bereich bei der Aufnahmevergrößerung zu lokalisieren. Beachten Sie, dass es je nach Scangeschwindigkeit zu einer seitlichen Verschiebung zwischen Vorschau und Aufnahme kommen kann. Hier kann eine einzelne Kippreihe aufgezeichnet werden. Mitochondrien können beispielsweise häufig im Vorschau- und Aufzeichnungsbild identifiziert werden (Abbildung 12).
Bei der Batch-Tomographie bewegt sich der Tisch um das Gitter herum und kehrt möglicherweise nicht an genau dieselbe Stelle zurück. Anker-Maps werden verwendet, um sicherzustellen, dass die gewünschten Datensatzbereiche zuverlässig neu identifiziert werden, indem das Vorschaubild mit einer Ansicht mit geringerer Vergrößerung abgeglichen wird, auch wenn sich die Bühnenbewegung verschoben hat. PyEM23,24 bietet eine schnellere Alternative, die sicherlich empfehlenswert ist, aber noch nicht Teil der Standardinstallation ist.
Beim CLEM-Ansatz kann eine Fluoreszenzkarte verwendet werden, um die Bereiche zu identifizieren, die für die Tomographie von Interesse sind. Die Fluoreszenz wird extern erfasst und muss auf die Vollrastermontage registriert werden. Es ist nützlich, die Rasterbalken und Löcher sichtbar zu haben, so dass vor dem Import ein zusammengeführtes Fluoreszenz- + Hellfeld-Komposit erstellt werden kann, z. B. in GIMP (https://www.gimp.org) oder ImageJ31-Software (achten Sie darauf, dass ImageJ die vertikale Achse invertiert). Wenn der Dynamikbereich der Fluoreszenz groß ist, kann es schwierig sein, eine solche Verschmelzung ohne Sättigung zu erzeugen. In diesem Fall können die beiden Karten separat importiert und dann wie beschrieben zusammen registriert werden (Abbildung 13). Auf diese Weise bringt ein Punkt auf der Fluoreszenzkarte im Navigator-Fenster, gefolgt von "Gehe zu XY", den Tisch an die entsprechende Position auf dem Raster, wie er im TEM montiert ist. Achten Sie darauf, dass kleine Inkonsistenzen bei der Erstellung der Montage (oder der Fluoreszenzkarte, falls es sich auch um eine Montage handelt) zu kleinen Verschiebungen führen. Um eine optimale Präzision zu erzielen, sollte die Fluoreszenz daher speziell für die quadratische Karte neu registriert werden. Oft reicht es aus, diese Registrierung mit dem Auge vorzunehmen, auf der Grundlage von Löchern in der Trägerfolie oder Merkmalen, die mit dem Hellfeldlichtbild geteilt werden.
Die Rekonstruktion der Neigungsreihe ergibt ein 3D-Volumen (Abbildung 14). Dieses Beispiel hat eine Pixelgröße von 2.042 nm, was ein Sichtfeld von ~4 μm ergibt. Calciumphosphat-Ablagerungen (orangefarbene Pfeilspitzen) fallen durch die höhere Ordnungszahl im Vergleich zur Umgebung auf. Mikrotubuli (rote Pfeilspitzen) können über das gesamte Sichtfeld verfolgt werden. Auch die inneren und äußeren mitochondrialen Membranen (grüne Pfeilspitzen) sind deutlich zu sehen. Aktin kann als Bündel oder als einzelne Filamente beobachtet werden. Um eine isotropere Auflösung zu erreichen, kann die Rekonstruktion durch Entfaltung verarbeitet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> Abbildung 1: Vergleich von TEM und STEM. Bei TEM wird das Sichtfeld durch einen nahezu parallelen Strahl beleuchtet und die Objektivlinse bildet ein vergrößertes Bild auf der Kamera. Bei Kryo-TEM wird die Objektivblende geöffnet, um die gestreuten Elektronenwellen (gestrichelte rote Linie) durchzulassen, die bei Unschärfe durch Interferenz mit den ungestreuten (grünen) Wellen einen Phasenkontrast erzeugen. STEM hingegen rastert einen fokussierten Strahl über die Probe und sammelt die gestreuten Elektronen Pixel für Pixel. Mehrere Detektoren können Elektronen sammeln, die in verschiedenen Winkeln gestreut werden. Diese Zahl wurde von30 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für eine Bildverzerrung auf der linken Seite aufgrund der hohen Abtastrate. Man beachte die Verzerrung, die durch gelbe Pfeilspitzen markiert ist, sowie die verzerrten ovalen Löcher im Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> Abbildung 3: Montage-Setup-Dialog für die gesamte Rastermontage. Wählen Sie die Vergrößerung und die Anzahl der Teile in X und Y so, dass die Gesamtfläche etwa 2.000 μm erreicht, um eine Karte für den größten Teil des Rasters zu erhalten. Wählen Sie außerdem "Bühne verschieben" anstelle von "Bild verschieben" und "Montage-Mapping verwenden, nicht Aufnahmeparameter". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> Abbildung 4: GridMap bei voller Vergrößerung bei geringer Vergrößerung, aufgenommen im STEM-Modus. Gebrochene Bereiche erscheinen im Dunkelfeldbild komplett schwarz. Dunkelgraue Bereiche sind wahrscheinlich zu dick und schlecht verglast. Gute Kandidatenbereiche für die Tomographie sind in diesem Scan weiß oder hellgrau. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> Abbildung 5: Wechsel zum Marker-Prozess. Ein erkennbares Objekt wird in der Karte mit niedriger Auflösung durch Punkte hinzufügen markiert (38 in diesem Bild). Beachten Sie den Wechsel zwischen der Karte mit niedriger Auflösung (grüner Kreis) und der Karte mit mittlerer Auflösung (orangefarbener Kreis). Anschließend wird das Objekt durch die Markierung (grünes Kreuz, roter Kreis) markiert und der Dialog Zu Marker wechseln wird gestartet. Die gewählte Option verschiebt alle Karten mit 245x um den gleichen Betrag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> Abbildung 6: Dialog zum Einrichten der Neigungsserie für eine STEM-Neigungsserie. Das dosissymmetrische Schema wird von -60° bis +60° in 2°-Schritten verwendet. Der Autofokus wird aufgrund der hohen Tiefenschärfe bei Verwendung eines niedrigen Konvergenzwinkels übersprungen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Euzentrizität zu verfeinern, wie dies zuvor der Fall war. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> Abbildung 7: Dialogfeld "Dateieigenschaften" für Karten mit mittlerer Auflösung. Speichern Sie als MRC-Stack-Datei, wählen Sie Ganzzahlen aus, und speichern Sie zusätzliche Informationen in einer .mdoc-Metadatendatei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> Abbildung 8: Montage-Setup-Dialog zum Speichern von Karten mittlerer Auflösung. Für ein Quadrat auf einem 200-Maschen-Raster, das 90 μm breit ist, ist eine Gesamtfläche von mindestens 90 μm x 90 μm ratsam. Wählen Sie "Bühne verschieben", anstatt das Bild zu verschieben, und "Ansichtsparameter im Modus "Niedrige Dosis verwenden". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> Abbildung 9: Karte mit mittlerer Auflösung. Erfassen bei Elementen-Dialog zum Aufzeichnen von Karten mit mittlerer Auflösung. Wählen Sie "Mapping", "Bild oder Montage erfassen und speichern" und aktivieren Sie "Navigator-Karte erstellen". Wählen Sie in den Aufgaben vor oder nach Primär die Option Grob- und Feinzentrizität aus. Wenn Sie keine Hilfe benötigen, wählen Sie optional Kein Meldungsfeld, wenn ein Fehler auftritt und Schließen Sie die Säulenventile am Ende aus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> Abbildung 10: Bild einer Karte mit mittlerer Auflösung. Karte mit mittlerer Auflösung (Square Map), aufgenommen im STEM-Modus durch eine Montage von 3 x 3. Die beiden mittelauflösenden Ankerkarten für die Datenerfassung sind durch die blauen Quadrate gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> Abbildung 11: Daten der Batch-Tilt-Reihe. Erwerben bei Gegenständen Dialog zum Sammeln von Stapel-Tilt-Serien. Wählen Sie für die Neigungsreihen-Datenerfassung die Option Endgültige Daten und Neigungsreihen erfassen aus. Aktivieren Sie unter Aufgaben vor oder nach der Primärfunktion die Optionen Dewars/Vakuum verwalten (wählen Sie die entsprechenden Einstellungen im Setup-Menü), Auf Element neu ausrichten, Feinzentrizität und Skript vor Aktion ausführen. Aktivieren Sie in den allgemeinen Optionen das Kontrollkästchen Keine Meldung, wenn ein Fehler auftritt und schließen Sie die Säulenventile am Ende (siehe 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> Abbildung 12: 0°-Neigung einer STEM-Kippreihe eines Mitochondriums. Orangefarbene Pfeilspitzen deuten auf Calciumphosphat-Ablagerungen (Matrix-Granulate) hin, grüne Pfeilspitzen auf Cristae und rote Pfeilspitzen auf 15 nm Gold-Fiducial-Markierungen. Maßstabsbalken = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> Abbildung 13: Registrierte Kryo-CLEM-Karten. (A) Die STEM-Karte mittlerer Auflösung (Quadratkarte, 26-A) ist für die (B) niedrig aufgelöste STEM-Karte, (C) die Kryo-FM-Karte des BF-Kanals und (D) die Kryo-FM-Karte des GFP-Kanals registriert. Die neun Registrierungspunkte (Beschriftungen 4-21) werden im (E) Navigator angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> Abbildung 14: Volumen-Rendering. Volumendarstellung von (A) 60 nm und (B) 40 nm dicken Schnitten durch ein SIRT-ähnliches (30 Zyklen) gefiltertes Tomogramm in verschiedenen Tiefen. Die Pixelgröße beträgt 2,048 nm, woraus sich ein Sichtfeld von ca. 4 μm ergibt. Bitte beachten Sie die invertierte Dichte im Vergleich zu Abbildung 12, was bedeutet, dass hochintensive Merkmale hell sind. Orange, weiße, rote, grüne und hellblaue Pfeilspitzen deuten auf Kalziumphosphatablagerungen, Ribosomen, Mikrotubuli, die innere und äußere Mitochondrienmembran bzw. Aktinfilamente hin. Maßstabsbalken = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

Die TEM-Tomographie wird häufig für die Bildgebung von Zellen verwendet, ist jedoch in Bezug auf die Probendicke sehr begrenzt. FIB-REM und weiche Röntgentomographie können für größere Proben verwendet werden, wenn auch mit geringerer Auflösung. Die MINT-Tomographie füllt diese Lücke perfekt.Die STEM-Tomographie ermöglicht einen Blick auf mikrometerdicke Proben mit einer Auflösung von wenigen Nanometern. Die Kombination mit der kryogenen Präparation ermöglicht es uns, biologische Proben und Schnitte in 3D zu betrachten. Wiederholen Sie die Grundlagen der STEM-Optik, um die Bildentstehung zu verstehen und sicherzustellen, dass der Servicetechniker die Schaft- und Lomax-Schaftmodi gut aufeinander abgestimmt hat und dass die Kalibrierungsschritte wie im Video aussehen.Laden Sie zunächst die Spaltenausrichtungsdatei, und öffnen Sie die Spaltenwerte. Wenn Sie einen Kryohalter mit seitlichem Einstieg verwenden, öffnen Sie den Kryoschutz und starten Sie im TEM-Modus. Der Strahl sollte auf dem Bildschirm erscheinen.Verringern Sie die Vergrößerung, wenn der Strahl nicht angezeigt wird. Bringen Sie das Mikroskop in den euzentrischen Fokus, indem Sie die Taste auf dem Bedienfeld drücken. Stellen Sie die Spotgröße auf einen geeigneten Wert ein, um den fluoreszierenden Bildschirm direkt oder mit der integrierten Kamera zu visualisieren.Stellen Sie das Mikroskop auf den MINT-Modus ein und stellen Sie sicher, dass der Fokus die Kondensorlinsen und nicht das Objektiv verwendet. Stellen Sie auf dem Bedienfeld den euzentrischen Fokus ein und verlassen Sie den Beugungsmodus für die ersten Einstellungen. Stellen Sie sicher, dass der Strahl nicht leer ist, und verringern Sie die Vergrößerung, bis der Strahl auf dem Bildschirm angezeigt wird.Stellen Sie die Strahlverschiebung in die Mitte ein und erhöhen Sie die Vergrößerung in Schritten bis zu 70.000, während Sie den Strahl in der Mitte halten. Setzen Sie dann die gewünschte Kondensoröffnung ein, typischerweise 50 Mikrometer für den Mikrosondenmodus, und überprüfen Sie die Aperturzentrierung. Beim Hin- und Herdrehen des Fokusknopfes sollte sich der Spot ausdehnen und zusammenziehen, aber an Ort und Stelle bleiben, als ob ein Flugzeug eine imaginäre vertikale Sanduhr schneidet.Wenn die Blende nicht zentriert ist, verschiebt sich die Beleuchtung seitlich, als ob die Sanduhr geneigt wäre. Bringen Sie den Strahl in den Fokus, drücken Sie auf der Registerkarte "Ausrichtungen" auf "Intensitätslistenfokus" oder kehren Sie zum euzentrischen Fokus zurück. Stellen Sie die Strahlposition auf die Mitte neu ein und stellen Sie den Rotationsmittelpunkt ein.Drehen Sie nun das Fokusstufenrad auf das Minimum oder eine Stufe darüber, damit der Strahl sanft pulsiert und er stationär bleibt, während sich der Fokus auf und ab bewegt. Wählen Sie die Drehpunkte aus und bringen Sie die beiden Punkte mit X- und Y-Anpassungen zusammen. Stellen Sie die Kondensator-Stigmatoren so ein, dass der Strahl rund wird.Gehen Sie durch den Fokus auf und ab, um zu optimieren. Es sollte keine Tendenz geben, sich beim Durchlaufen des Fokus in die eine oder andere Richtung zu dehnen. Normalisieren Sie die Linsen und erhöhen Sie dann die Vergrößerung schrittweise auf etwa 240.000, während Sie die Strahlverschiebung verwenden, um den Punkt zentriert zu halten, und wiederholen Sie die Einstellungen des Rotationsmittelpunkts und des Drehpunkts.Kehren Sie in den Beugungsmodus zurück. In diesem Stadium sollte der Strahl als gleichmäßige Scheibe auf dem fluoreszierenden Bildschirm erscheinen. Die Kameralänge steuert nun effektiv den optischen Abstand zum Detektor wie eine Röntgenkristallographie.Wechseln Sie es und beobachten Sie, wie sich die Scheibe zusammenzieht und vergrößert, als ob sich die Position des Bildschirms auf die Probe zu oder von ihr weg bewegen würde. Dieser Kegel stellt die Hellfeldbeleuchtung dar. Um den STEM-Modus bei hoher Vergrößerung zu aktivieren, beginnen Sie mit dem Hellfeld-Stieldetektor und passen Sie die Beugungsausrichtung an, um den Strahl mit der gewünschten Kameralänge zu zentrieren.Schalten Sie die Hellfeldmarkierung auf dem Bildschirm ein, reduzieren Sie die Kameralänge auf 330, heben Sie den Bildschirm an und setzen Sie die Detektoren ein. Starten Sie einen Scan in der Mikroskop-Software. Verwenden Sie das Oszilloskop-Display, um die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen wie im Manuskript beschrieben anzupassen.Iterieren Sie die Anpassung mehrmals. Setzen Sie das Mikroskop im Register für hohe Vergrößerung auf eine relativ niedrige Vergrößerung zurück, ohne in den Modus mit niedriger Vergrößerung zu wechseln. Setzen Sie das fluoreszierende Sieb ein und notieren Sie sich den aktuellen Bildschirm als Referenz.Wie bei TEM kann der Strom mit den Einstellungen für die Pistolenlinse und die Spotgröße mit zunehmenden Zahlen geändert werden, die einem reduzierten Strom entsprechen. Speichern Sie an dieser Stelle ein FEG-Register, um die Rückkehr zu Standardwerten zu erleichtern. Gehen Sie in den LMTEM-Modus, um die Probe zu sehen.Setzen Sie die Probe ein. Bringen Sie die Probe auf euzentrische Höhe. Es gibt mehrere Methoden, dies zu tun.Verwenden Sie z. B. den Tischwobbler, um das Raster zu neigen, während Sie die Probenhöhe entlang der Z-Achse verschieben, bis sich das Bild nicht mehr seitlich verschiebt. Markieren Sie alternativ einige Merkmale auf dem Bildschirm und neigen Sie die Bühne um 10 bis 30 Grad. Das Feature wird seitlich verschoben.Passen Sie die Probenhöhe an, um sie wieder in ihre ursprüngliche Position zu bringen. Erhöhen Sie die Vergrößerung oder die Neigung des Tisches, um die Neigung zu verfeinern und auf Null Grad zurückzusetzen. Kehren Sie nun in den STEM-Modus zurück und setzen Sie den STEM-Detektor ein.Stellen Sie sicher, dass LM-Scan aktivieren deaktiviert ist. Wechseln Sie zum niedrigsten Modus mit hoher Vergrößerung. Stellen Sie den Kondensator-Astigmatismus nach der Methode ein.Wenn sich der Strahl über einem dünnen Probenbereich befindet, fokussieren Sie sich auf den Punkt, an dem der transmittierte Strahl zwischen den Schattenbildern der Probe auf beiden Seiten explodiert. Stellen Sie dann die Kondensatorabstimmung so ein, dass die zentrale Scheibe rund wird. Dies erfordert etwas Übung, insbesondere bei kryogenen Proben.Gehen Sie zurück zur 50-Mikrometer-Blende und aktualisieren Sie das FEG-Register. Gehen Sie in den LMSTEM-Modus und fahren Sie mit dem Scannen fort, um einen interessanten Bereich zu finden. Stellen Sie ggf. die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen des Detektors an dieser Stelle grob nach.Drücken Sie den euzentrischen Fokus, erhöhen Sie die Vergrößerung und verfeinern Sie den Fokus während des Scannens mit der vom Mikroskop bereitgestellten Fokusschleife und überprüfen Sie die Hornhautverkrümmung an Goldperlen. Bisher wird alles im Nano-Sonden-Modus durchgeführt. Beachten Sie, dass durch das Einsetzen einer kleineren Kondensoröffnung der Semikonvergenzwinkel verringert wird, was bei dicken Proben hilfreich ist.Ein alternativer Ansatz mit TFS-Geräten besteht darin, in den Mikrosondenmodus zu wechseln, was zu einem reduzierten Semikonvergenzwinkel führt. Passen Sie dann die Kameralänge so an, dass der Erfassungswinkel dreimal größer ist als der Konvergenzwinkel, d. h. die BF-Detektorbereichsmarkierungen auf dem Bildschirm sind etwa dreimal größer als der Strahl.Schätzen Sie die Dosis für die Aufzeichnung mithilfe einer Gleichung. Als Faustregel gilt, dass für den gesamten Tomographen 100 bis 150 Elektronen pro quadratischem Tintenstrom angestrebt werden sollten. Setzen Sie den Tisch wieder in ein Loch und passen Sie den Strahlstrom mithilfe der Spotgröße und/oder der Pistolenobjektiveinstellungen an, um den gewünschten Bildschirmstrom zu erreichen.Die im STEM-Modus aufgezeichnete Gitterkarte mit geringer Vergrößerung zeigt die Bereiche mit den relevanten Zellen. Die Zellen erscheinen teilweise hell mit Elektronen, die in Richtung des HAADF-Detektors gestreut werden. Die im STEM-Modus aufgezeichnete Karte mit mittlerer Auflösung zeigte zwei Ankerkarten mit mittlerer Auflösung an.Die Null-Grad-Neigung einer Stammneigungsreihe ermöglichte die Visualisierung der Calciumphosphat-Ablagerungen, Cristae und Gold-Fiducial-Marker eines Mitochondriums. Gezeigt werden Volumendarstellungen von 60 Nanometern und 40 Nanometer dicken Schnitten. Die Kryo-Stammtomographie (CSTET) schlägt eine Brücke zwischen Strukturbiologie und Zellbiologie und bietet einen Kontext für die hochauflösende Fluoreszenz.Ohne die Notwendigkeit einer Sektion oder Lamellenpräparation können wir das gesamte zelluläre Theater in einem nahezu nativen Zustand sehen.

visualization-of-organelles-in-situ-by-cryo-stem-tomography

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen hier, wie Elektronen cryotomography (ECT) zu verwenden, um auf die Ultrastruktur von Bakterienzellen in nahezu native Staaten zu studieren, "makromolekularen" (~ 4 nm) Auflösung.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. Synchrone Anbau, Überwachung durch die Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Cryo-Elektron Tomographie verwendet. Ein Protokoll für diese Methoden vorgestellt, und zukünftige Anwendungen und Entwicklungen diskutiert.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Das vorliegende Protokoll beschreibt die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie-Ferndatenerfassung mit Tomo5 und die anschließende Datenverarbeitung und Subtomogramm-Mittelung mittels emClarity. Apoferritin wird als Beispiel verwendet, um detaillierte Schritt-für-Schritt-Prozesse zu veranschaulichen, um eine Kryo-ET-Struktur bei 2,86 Å Auflösung zu erreichen.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ermöglicht die 3D-Visualisierung der zellulären Ultrastruktur mit Nanometerauflösung, aber die manuelle Segmentierung bleibt zeitaufwändig und komplex. Wir stellen einen neuartigen Workflow vor, der fortschrittliche Virtual-Reality-Software zur Segmentierung von Kryo-ET-Tomogrammen integriert und seine Wirksamkeit durch die Segmentierung von Mitochondrien in Säugetierzellen demonstriert.

Nutzung von Virtual Reality für die immersive Segmentierung und Analyse von Kryo-Elektronentomographie-Daten

Dieses Videoprotokoll veranschaulicht die Durchführung einer Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie von virologischen Proben. Für optimale Ergebnisse werden die Proben durch Hochdruckgefrieren und anschließende Gefriersubstitution vorbereitet.

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

Erfahren Sie, wie Kryo-STEM-Tomographie Organelle in intakten Zellen mit Nanometerauflösung visualisiert. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht 3D-Bildgebung mikrometerdicker biologischer Proben.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Weitere Videos entdecken