Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Die TEM-Tomographie wird häufig für die Bildgebung von Zellen verwendet, ist jedoch in Bezug auf die Probendicke sehr begrenzt. FIB-REM und weiche Röntgentomographie können für größere Proben verwendet werden, wenn auch mit geringerer Auflösung. Die MINT-Tomographie füllt diese Lücke perfekt.

Die STEM-Tomographie ermöglicht einen Blick auf mikrometerdicke Proben mit einer Auflösung von wenigen Nanometern. Die Kombination mit der kryogenen Präparation ermöglicht es uns, biologische Proben und Schnitte in 3D zu betrachten. Wiederholen Sie die Grundlagen der STEM-Optik, um die Bildentstehung zu verstehen und sicherzustellen, dass der Servicetechniker die Schaft- und Lomax-Schaftmodi gut aufeinander abgestimmt hat und dass die Kalibrierungsschritte wie im Video aussehen.

Laden Sie zunächst die Spaltenausrichtungsdatei, und öffnen Sie die Spaltenwerte. Wenn Sie einen Kryohalter mit seitlichem Einstieg verwenden, öffnen Sie den Kryoschutz und starten Sie im TEM-Modus. Der Strahl sollte auf dem Bildschirm erscheinen.

Verringern Sie die Vergrößerung, wenn der Strahl nicht angezeigt wird. Bringen Sie das Mikroskop in den euzentrischen Fokus, indem Sie die Taste auf dem Bedienfeld drücken. Stellen Sie die Spotgröße auf einen geeigneten Wert ein, um den fluoreszierenden Bildschirm direkt oder mit der integrierten Kamera zu visualisieren.

Stellen Sie das Mikroskop auf den MINT-Modus ein und stellen Sie sicher, dass der Fokus die Kondensorlinsen und nicht das Objektiv verwendet. Stellen Sie auf dem Bedienfeld den euzentrischen Fokus ein und verlassen Sie den Beugungsmodus für die ersten Einstellungen. Stellen Sie sicher, dass der Strahl nicht leer ist, und verringern Sie die Vergrößerung, bis der Strahl auf dem Bildschirm angezeigt wird.

Stellen Sie die Strahlverschiebung in die Mitte ein und erhöhen Sie die Vergrößerung in Schritten bis zu 70.000, während Sie den Strahl in der Mitte halten. Setzen Sie dann die gewünschte Kondensoröffnung ein, typischerweise 50 Mikrometer für den Mikrosondenmodus, und überprüfen Sie die Aperturzentrierung. Beim Hin- und Herdrehen des Fokusknopfes sollte sich der Spot ausdehnen und zusammenziehen, aber an Ort und Stelle bleiben, als ob ein Flugzeug eine imaginäre vertikale Sanduhr schneidet.

Wenn die Blende nicht zentriert ist, verschiebt sich die Beleuchtung seitlich, als ob die Sanduhr geneigt wäre. Bringen Sie den Strahl in den Fokus, drücken Sie auf der Registerkarte "Ausrichtungen" auf "Intensitätslistenfokus" oder kehren Sie zum euzentrischen Fokus zurück. Stellen Sie die Strahlposition auf die Mitte neu ein und stellen Sie den Rotationsmittelpunkt ein.

Drehen Sie nun das Fokusstufenrad auf das Minimum oder eine Stufe darüber, damit der Strahl sanft pulsiert und er stationär bleibt, während sich der Fokus auf und ab bewegt. Wählen Sie die Drehpunkte aus und bringen Sie die beiden Punkte mit X- und Y-Anpassungen zusammen. Stellen Sie die Kondensator-Stigmatoren so ein, dass der Strahl rund wird.

Gehen Sie durch den Fokus auf und ab, um zu optimieren. Es sollte keine Tendenz geben, sich beim Durchlaufen des Fokus in die eine oder andere Richtung zu dehnen. Normalisieren Sie die Linsen und erhöhen Sie dann die Vergrößerung schrittweise auf etwa 240.000, während Sie die Strahlverschiebung verwenden, um den Punkt zentriert zu halten, und wiederholen Sie die Einstellungen des Rotationsmittelpunkts und des Drehpunkts.

Kehren Sie in den Beugungsmodus zurück. In diesem Stadium sollte der Strahl als gleichmäßige Scheibe auf dem fluoreszierenden Bildschirm erscheinen. Die Kameralänge steuert nun effektiv den optischen Abstand zum Detektor wie eine Röntgenkristallographie.

Wechseln Sie es und beobachten Sie, wie sich die Scheibe zusammenzieht und vergrößert, als ob sich die Position des Bildschirms auf die Probe zu oder von ihr weg bewegen würde. Dieser Kegel stellt die Hellfeldbeleuchtung dar. Um den STEM-Modus bei hoher Vergrößerung zu aktivieren, beginnen Sie mit dem Hellfeld-Stieldetektor und passen Sie die Beugungsausrichtung an, um den Strahl mit der gewünschten Kameralänge zu zentrieren.

Schalten Sie die Hellfeldmarkierung auf dem Bildschirm ein, reduzieren Sie die Kameralänge auf 330, heben Sie den Bildschirm an und setzen Sie die Detektoren ein. Starten Sie einen Scan in der Mikroskop-Software. Verwenden Sie das Oszilloskop-Display, um die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen wie im Manuskript beschrieben anzupassen.

Iterieren Sie die Anpassung mehrmals. Setzen Sie das Mikroskop im Register für hohe Vergrößerung auf eine relativ niedrige Vergrößerung zurück, ohne in den Modus mit niedriger Vergrößerung zu wechseln. Setzen Sie das fluoreszierende Sieb ein und notieren Sie sich den aktuellen Bildschirm als Referenz.

Wie bei TEM kann der Strom mit den Einstellungen für die Pistolenlinse und die Spotgröße mit zunehmenden Zahlen geändert werden, die einem reduzierten Strom entsprechen. Speichern Sie an dieser Stelle ein FEG-Register, um die Rückkehr zu Standardwerten zu erleichtern. Gehen Sie in den LMTEM-Modus, um die Probe zu sehen.

Setzen Sie die Probe ein. Bringen Sie die Probe auf euzentrische Höhe. Es gibt mehrere Methoden, dies zu tun.

Verwenden Sie z. B. den Tischwobbler, um das Raster zu neigen, während Sie die Probenhöhe entlang der Z-Achse verschieben, bis sich das Bild nicht mehr seitlich verschiebt. Markieren Sie alternativ einige Merkmale auf dem Bildschirm und neigen Sie die Bühne um 10 bis 30 Grad. Das Feature wird seitlich verschoben.

Passen Sie die Probenhöhe an, um sie wieder in ihre ursprüngliche Position zu bringen. Erhöhen Sie die Vergrößerung oder die Neigung des Tisches, um die Neigung zu verfeinern und auf Null Grad zurückzusetzen. Kehren Sie nun in den STEM-Modus zurück und setzen Sie den STEM-Detektor ein.

Stellen Sie sicher, dass LM-Scan aktivieren deaktiviert ist. Wechseln Sie zum niedrigsten Modus mit hoher Vergrößerung. Stellen Sie den Kondensator-Astigmatismus nach der Methode ein.

Wenn sich der Strahl über einem dünnen Probenbereich befindet, fokussieren Sie sich auf den Punkt, an dem der transmittierte Strahl zwischen den Schattenbildern der Probe auf beiden Seiten explodiert. Stellen Sie dann die Kondensatorabstimmung so ein, dass die zentrale Scheibe rund wird. Dies erfordert etwas Übung, insbesondere bei kryogenen Proben.

Gehen Sie zurück zur 50-Mikrometer-Blende und aktualisieren Sie das FEG-Register. Gehen Sie in den LMSTEM-Modus und fahren Sie mit dem Scannen fort, um einen interessanten Bereich zu finden. Stellen Sie ggf. die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen des Detektors an dieser Stelle grob nach.

Drücken Sie den euzentrischen Fokus, erhöhen Sie die Vergrößerung und verfeinern Sie den Fokus während des Scannens mit der vom Mikroskop bereitgestellten Fokusschleife und überprüfen Sie die Hornhautverkrümmung an Goldperlen. Bisher wird alles im Nano-Sonden-Modus durchgeführt. Beachten Sie, dass durch das Einsetzen einer kleineren Kondensoröffnung der Semikonvergenzwinkel verringert wird, was bei dicken Proben hilfreich ist.

Ein alternativer Ansatz mit TFS-Geräten besteht darin, in den Mikrosondenmodus zu wechseln, was zu einem reduzierten Semikonvergenzwinkel führt. Passen Sie dann die Kameralänge so an, dass der Erfassungswinkel dreimal größer ist als der Konvergenzwinkel, d. h. die BF-Detektorbereichsmarkierungen auf dem Bildschirm sind etwa dreimal größer als der Strahl.

Schätzen Sie die Dosis für die Aufzeichnung mithilfe einer Gleichung. Als Faustregel gilt, dass für den gesamten Tomographen 100 bis 150 Elektronen pro quadratischem Tintenstrom angestrebt werden sollten. Setzen Sie den Tisch wieder in ein Loch und passen Sie den Strahlstrom mithilfe der Spotgröße und/oder der Pistolenobjektiveinstellungen an, um den gewünschten Bildschirmstrom zu erreichen.

Die im STEM-Modus aufgezeichnete Gitterkarte mit geringer Vergrößerung zeigt die Bereiche mit den relevanten Zellen. Die Zellen erscheinen teilweise hell mit Elektronen, die in Richtung des HAADF-Detektors gestreut werden. Die im STEM-Modus aufgezeichnete Karte mit mittlerer Auflösung zeigte zwei Ankerkarten mit mittlerer Auflösung an.

Die Null-Grad-Neigung einer Stammneigungsreihe ermöglichte die Visualisierung der Calciumphosphat-Ablagerungen, Cristae und Gold-Fiducial-Marker eines Mitochondriums. Gezeigt werden Volumendarstellungen von 60 Nanometern und 40 Nanometer dicken Schnitten. Die Kryo-Stammtomographie (CSTET) schlägt eine Brücke zwischen Strukturbiologie und Zellbiologie und bietet einen Kontext für die hochauflösende Fluoreszenz.

Ohne die Notwendigkeit einer Sektion oder Lamellenpräparation können wir das gesamte zelluläre Theater in einem nahezu nativen Zustand sehen.