Name: Bestimmung von Selbst(in)kompatibilitäts- und Inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei Zitrusfrüchten mittels manueller Bestäubung, Mikroskopie und S-Genotyp-Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Bestimmung von Pollenkompatibilität bei Citrus maxima mittels Mikroskopie und S-Genotyp-Analyse. Diese Technik unterstützt Züchter bei der Auswahl geeigneter Pollenspender für erfolgreiche Befruchtung.

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Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523) finanziell unterstützt.

1. Vorbereitung für die Anilinblaufärbung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Werkzeuge für das Experiment vor: einen Bestäuberpinsel, eine Pinzette, einen Bleistift, Sulfatpapier, einen Bestäubungsbeutel, Zip-Lock-Beutel, Büroklammern, Formaldehyd, Eisessig, absolutes Ethanol, Zentrifugenröhrchen, Pinzetten, Klebstofftropfer, Glasobjektträger, Deckgläser, Skalpelle und Polyethylenglykol.</li>
	<li>Bereiten Sie in vitro Keimmedium her, das 0,02 %MgSO4, 0,01 % KNO 3, 0,03 % Ca(NO3)2, 0,01 % H3BO3, 20 % PEG-4000 und 15 % Saccharose enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 6,0-6,2 ein. Verwenden Sie einen Magnetrührer, da PEG-4.000 schwer aufzulösen ist.</li>
	<li>Bereiten Sie die Carnoy-Fixierlösung vor, bei der es sich um absolutes Ethanol und Eisessig handelt, die im Verhältnis 3:1 gemischt werden. Bereiten Sie die FAA-Fixierungslösung vor, die aus 40 % Formaldehyd, 80 % Ethanol und Eisessig (1:8:1) besteht. Bereiten Sie 4 M Natriumhydroxid (NaOH) und Anilinblaulösung vor, die 0,1 % Anilinblau in 0,1 MK3PO4 ist. Verwenden Sie eine bernsteinfarbene Flasche, um die Anilinblaulösung aufzubewahren, da sie lichtempfindlich ist.</li>
</ol>2. Pollensammlung
<ol><li>Kennen Sie die Blütezeit der Versuchsbäume (Ma jia pummelo in dieser Studie) im Voraus. Sammle reife, ungeöffnete Blüten vom Beginn der Blütezeit bis zum Höhepunkt der Blütezeit und lege sie in einen Zip-Lock-Beutel. Die Blüten können bei 4 °C im Kühlschrank für 24 h gelagert werden.</li>
	<li>Bringen Sie die Blumen ins Labor. Sammeln Sie die Staubbeutel mit einer Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit Filterpapier. Sammle Staubbeutel von 20 bis 30 Blüten.</li>
	<li>Stellen Sie die Petrischale mit den Staubbeuteln für 24 h in einen 28 °C heißen Ofen, bis die Pollenkörner getrocknet sind. Für die detaillierte Blütenorganisation siehe Hu et al.9.</li>
	<li>Geben Sie den getrockneten Pollen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Pollen in einem luftdichten Zip-Lock-Beutel auf, der farbwechselndes Kieselgel (Trockenmittel) enthält. Verschließen Sie den Beutel und beschriften Sie den Beutel mit dem Namen der Pollensorte und dem Datum der Lagerung. Der getrocknete Pollen kann in einem Kühlschrank bei −20 °C 96 Wochen gelagert werden16.</li>
</ol>3. In-vitro-Pollenkeimungstest 
<ol><li>Gießen Sie 300 μl flüssiges Medium in eine Zellkulturschale oder die Kappe eines 2-ml-Zentrifugenröhrchens und bestreuen Sie den Pollen gleichmäßig mit Hilfe einer Bestäubungsbürste. Inkubieren Sie den Pollen bei 28 °C in einer befeuchteten dunklen Umgebung für 12 h.</li>
	<li>Entfernen Sie die oberen 1 mm der Spitze einer 1.000-μl-Pipettenspitze. Verwenden Sie die Pipette, um den Pollen mit einer kleinen Menge Kulturlösung aufzunehmen und in die Mitte des Objektträgers zu bringen. Decken Sie es mit einem Deckglas ab. Betrachten Sie die Probe mit einem inversen Mikroskop mit einem 10-fach-Objektiv.</li>
	<li>Führen Sie drei unabhängige Replikate durch, wobei für jedes Replikat ungefähr die gleiche Pollendichte verwendetwird 17. Kontrollieren Sie die Pollenmenge visuell und stellen Sie sicher, dass die gesamte Petrischale mit Pollen bedeckt ist und dass jede Petrischale fast die gleiche Menge an Pollen enthält.</li>
	<li>Der gekeimte Pollen produziert einen Pollenschlauch mit einer Länge von etwa dem Doppelten seines Durchmessers. Berechnen Sie die Keimrate aus 20 Sichtfeldern, die den prozentualen Anteil der gekeimten Pollen in allen Pollenfeldern angibt.</li>
</ol>4. Bestäubung
<ol><li>Wählen Sie einen sonnigen Tag ohne Wind für die Bestäubung. Wählen Sie 10 voll entwickelte Knospen aus, die kurz vor dem Öffnen stehen, schälen Sie die Blütenblätter vorsichtig ab und achten Sie darauf, sie nicht zu quetschen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Bestäubungsbürste, um eine ausreichende Menge lebensfähiger Pollen auf der Oberfläche der Narbe zu verteilen, und achten Sie darauf, den Stempel nicht zu beschädigen. Verwenden Sie für die Selbstbestäubung den Pollen derselben Pflanze/Sorte. Verwenden Sie für die Fremdbestäubung den Pollen einer Pflanze mit einem anderen Genotyp.</li>
	<li>Decken Sie die bestäubten Blüten mit einer Sulfat-Papiertüte ab. Verwenden Sie eine Büroklammer, um den Beutel zu verschließen und die Bestäubung durch genotypisch unterschiedliche Pollen zu verhindern.</li>
	<li>Schreiben Sie den Namen der Art sowie die Anzahl und den Zeitpunkt der Bestäubung auf das Etikett. Hängen Sie das Etikett an die Zweige in der Nähe der bestäubten Blüten.</li>
</ol>5. Probenahme, Fixierung und Konservierung
<ol><li>Entfernen Sie die Bestäubungsbeutel etwa 3-4 Tage nach der Bestäubung und sammeln Sie die bestäubten Blüten in Zip-Lock-Beuteln.</li>
	<li>Entfernen Sie sofort die Blütenblätter, Gefäße und Eierstöcke von den Blüten und tauchen Sie die zu den Stielen verschmolzenen Narben in ein Zentrifugenröhrchen mit einer frisch zubereiteten Fixierlösung. Inkubieren Sie die Narben und Griffel in der Fixierlösung über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie am nächsten Tag die Fixierlösung und waschen Sie die Narben und Frisuren zwei- bis dreimal in 95%igem Ethanol.</li>
	<li>Übertragen Sie die Frisuren in eine 70%ige Ethanollösung. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht ist. Die Styles können zu diesem Zeitpunkt 1-2 Monate bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>6. Anilinblau-Färbung
<ol><li>Waschen Sie die in 70% Ethanol gelagerten Stilproben drei- bis viermal mit destilliertem Wasser. In 4 M NaOH-Lösung tauchen, verschließen und 60 min im 65 °C warmen Wasserbad inkubieren. Während dieses Schritts ändert sich die Farbe des Stils von gelb-weiß zu orange-rot.</li>
	<li>Die Frisuren 30 Minuten in destilliertem Wasser einweichen. Entsorgen Sie das destillierte Wasser und waschen Sie die Stile drei- bis viermal mit destilliertem Wasser oder bis die Farbe des Stils gelb wird.</li>
	<li>Geben Sie die Probe in ein 10-ml-Röhrchen, fügen Sie das Anilinblau hinzu, bis die Probe eingetaucht ist, und färben Sie sie 12 Stunden lang im Dunkeln.</li>
	<li>Beobachten Sie das Wachstum der Pollenschläuche mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>7. Fluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Bevor Sie die Proben betrachten, legen Sie den Objektträger auf einen flachen Tisch und geben Sie zwei bis drei Tropfen Polyethylenglykol auf die Oberfläche des Objektträgers.</li>
	<li>Waschen Sie den zu beobachtenden Stil mit destilliertem Wasser. Teilen Sie es mit einem Skalpell entlang der Längsachse in zwei Hälften. Legen Sie eine Hälfte des Stils auf den Objektträger und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger auf den Tisch des Mikroskops über der Blende und visualisieren Sie ihn mit einem 10-fach-Objektiv. Verwenden Sie den DAPI-Filter (Anregung: 325-375 nm; Emission: 435-485 nm). Beobachten Sie fünf Stile für jede Art der Bestäubung. Beobachte das Wachstum der Pollenschläuche.</li>
</ol>8. PCR-basierte Identifizierung des S-Genotyps
<ol><li>Extrahieren Sie die genomische DNA aus der Stigma-Probe mit der CTAB-Methode18.<ol><li>Geben Sie die gesammelten Blätter in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. HCl:EDTA:NaCl:H2O-Pufferim Verhältnis 1:1:3:5 und ein Chloroform-Isoamylalkoholgemisch im Verhältnis 24:1 herstellen</li>
		<li>Geben Sie 10 ml des vorbereiteten Puffers, 0,2 g CTAB und 200 μl Mercaptoethanol in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie 5 Minuten lang in ein Wasserbad bei 65 °C, bis die Lösung klar und transparent wird.</li>
		<li>Legen Sie die Klingen in einen Mörser, fügen Sie die gefrorenen Proben hinzu, fügen Sie flüssigen Stickstoff hinzu und mahlen Sie. Geben Sie die gemahlene Probe in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 600 μl CTAB-Mischung hinzu, legen Sie sie 60 Minuten lang in ein Wasserbad bei 65 °C und mischen Sie sie alle 30 Minuten auf den Kopf.</li>
		<li>Fügen Sie 700 μl des Chloroform-Isoamylalkohol-Gemischs (24:1) hinzu und mischen Sie es 10 Minuten lang kopfüber. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 24 °C bei 12.000 x g , pipettieren Sie den Überstand und füllen Sie ihn in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>60 μl 5 M NaCl-Lösung und 1 ml absolutes Ethanol zugeben und verkehrt herum mischen. 30 min bei −20 °C einfrieren und 5 min bei 24 °C und 9.000 x g zentrifugieren.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml 70%ige Ethanollösung hinzu und lassen Sie ihn 1-2 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Bei 24 °C, 9.000 x g für 5 min zentrifugieren, Überstand entsorgen, überschüssige Ethanollösung absaugen und 5 min an der Luft trocknen lassen.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μl steriles Wasser hinzu, um es aufzulösen, messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und frieren Sie es zur Langzeitlagerung in einem Gefrierschrank bei -4 °C ein.</li>
		<li>Konfigurieren Sie das RT-PCR-Reaktionssystem. Bereiten Sie die folgende Reaktionsmischung für 10 μl vor, die 5 μl 2x PCRMix, je 0,25 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 1 μl DNA (100 ng/μl) und 3,5 μlH2Oenthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Richten Sie das PCR-Programm gemäß Tabelle 1 ein. Das PCR-Programm für alle Isoformen betrug 95 °C für 5 min 32x (95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 1 min) und 72 °C für 5 min. Trennen Sie die Produkte von 1,5%igen TAE-Agarose-Gelen und Foto9. Verifizieren Sie den spezifizierten S-Genotyp anhand genomischer DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
<li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li>
<li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li>
<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+self-+and+inter-%28in%29compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination%2C+microscopy+and+genetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie nichts zu enthüllen haben.

In Obstkulturen sind sowohl Parthenokarpie als auch SI wichtige Merkmale, da sie den Weg für kernlose Früchte ebnen - eine Eigenschaft, die von den Verbrauchern sehr geschätzt wird. Die Selbstinkompatibilität fördert die Abstoßung von Selbstpollen und beugt so Inzucht vor20. Unter den Zitrusfrüchten ist Pummelo eine selbstunverträgliche Sorte7. Fast 40% aller Angiospermenarten weisen SI21 auf. Diese Eigenschaft verhindert den Fruchtansatz, senkt den ...

Selbstinkompatibilität (SI) ist ein genetisch gesteuerter Mechanismus, der bei etwa 40 % der Angiospermenarten vorkommt. Dabei stößt der Stempel Pollen einer Pflanze mit gleichem SI-Genotyp ab und verhindert so die Selbstbefruchtung 1,2. Ma jia pummelo ist eine lokale Sorte in der Provinz Jinagsu, China, mit den hervorragenden Eigenschaften von großen, rosa Früchten, einem reichhaltigen Saftgehalt, einem süß-sauren Geschmack und einer dicken Schale3. Obwohl SI die Auskreuzung fördert, wirkt es sich negativ auf den Ertrag und die Qualität der Früchteaus 4 und erfordert geeignete Bestäuberbäume mit unterschiedlichen SI-Genotypen für zuverlässige Fruchtansatzraten und hohe Erträge. Gegenwärtig gibt es zwei Haupttypen von SI, die sporophytische Selbstinkompatibilität (SSI), die durch Brassicaceae repräsentiert wird, und die gametophytische Selbstinkompatibilität (GSI), die durch Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae und Solanaceae repräsentiert wird 5,6,7,8.
Zitrusfrüchte sind eine der wichtigsten Obstkulturen der Welt. Das S-RNase-basierte GSI-System findet sich in vielen Zitrusakzessionen und beeinflusst die Fruchtansatzrate negativ9. In diesem System wird SI durch den S-Locus kontrolliert, einen einzelnen polymorphen Locus mit zwei komplexen Allelen, die Stempel-S-Determinanten und Pollen-S-Determinanten 7 tragen. Die weibliche Determinante ist die S-Ribonuklease (S-RNase) und die männliche Determinante ist die S-Locus-F-Box (SLF)7. Die Zellen des Stempels sezernieren S-RNase-Proteine. Die non-self S-RNasen werden von den SLF-Proteinen erkannt, was zur Ubiquitinierung und zum Abbau der non-self S-RNasen durch den 26S Proteasomweg führt. Im Gegensatz dazu sind die eigenen S-RNasen in der Lage, das Pollenschlauchwachstum (PT) zu akkumulieren und zu hemmen, da sie den SLF-Proteinen ausweichen und daher an der Ubiquitinierung gehindert werden10,11,12,13.
Hier berichten wir über eine In-vivo-Technik, die für die Identifizierung von S-Genotypen und den Grad der Pollenkompatibilität und -inkompatibilität nützlich ist. Das Protokoll umfasst die Extraktion der Gesamt-DNA aus Blättern und die Vorhersage des S-Genotyps mithilfe von S-spezifischen Primern. Darüber hinaus liefern Anilinblaufärbung und Fluoreszenzmikroskopie mit anschließender Handbestäubung Hinweise auf den Grad der Verträglichkeit und Inkompatibilität. Das Semi-in-vivo-Bestäubungsverfahren, bei dem Blüten im Labor manuell bestäubt werden14,15, wurde ebenfalls angepasst, um den Grad der Selbstverträglichkeit und Inkompatibilität zu beurteilen. Wir haben jedoch auch eine Feldbestäubung mit anschließendem Einsacken von Blüten verwendet, um eine Kontamination durch unerwünschte Pollen zu vermeiden, damit sich die Pollenschläuche unter natürlichen Bedingungen entwickeln können. Dieses Protokoll ist einfach und unkompliziert und liefert die Informationen, die für die erfolgreiche Auswahl geeigneter Bestäuberbäume erforderlich sind.

<table><tbody><tr><td>absolutes Ethanol</td><td>Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Anilinblau</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borsäure, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>Braune Flasche</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumnitrat Tetrahydrat, Ca(NO3)2</td><td>Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalröhrchen</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0(CAS)</td><td></td></tr><tr><td>Dropping</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10009617</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Vollautomatischer Proben-Schnellschleifer</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td>Tissuelyser-96</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>Mahlrohr</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoamylalkohol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>Etikett</td><td>M & Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>Shanghai Leica Co., Ltd</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPE Deckglas</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>Büroklammern</td><td>M& Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleistift</td><td>M& Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bestäuberbürste</td><td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol, PEG 6000</td><td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol, PEG-4000</td><td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid, KOH</td><td>Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumnitrat, KNO3</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, NAOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sinopharm Chemical ReagenzCo., Ltd</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>Sulfatpapier</td><td>Taizhou Jinnong Mesh Factory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermostat Wasserbad</td><td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr><td>Trichlormethan</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Trikaliumphosphat tribasisches Trihydrat, K3PO4</td><td>Shanghai Lingfeng Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Zip-Lock-Beutel</td><td>M & Verifizierter Lieferant - G Chenguang Schreibwaren Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>60-24-2(CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung von selbst(in)kompatibilitäts- und inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei zitrusfrüchten mittels manueller bestäubung, mikroskopie und s-genotyp-analysen

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Zitrusfrüchte nutzen die S-RNase-basierte Selbstinkompatibilität, um Selbstpollen abzulehnen, und benötigen daher für eine erfolgreiche Bestäubung und Befruchtung in der Nähe von Bestäuberbäumen. Die Identifizierung geeigneter Sorten, die als Bestäuber dienen können, ist jedoch ein zeitaufwändiger Prozess. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine schnelle Methode zur Identifizierung bestäubungskompatibler Zitrussorten entwickelt, die Agarose-Gelelektrophorese und Anilinblaufärbung nutzt. Die Pollenkompatibilität wird auf der Grundlage der Identifizierung von S-Genotypen durch Extraktion der Gesamt-DNA und Durchführung von PCR-basierten Genotypisierungsassays mit spezifischen Primern bestimmt. Zusätzlich werden die Stile 3-4 Tage nach der manuellen Bestäubung gesammelt und eine Anilinblaufärbung durchgeführt. Abschließend wird der Wachstumszustand der Pollenschläuche mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität kann festgestellt werden, indem beobachtet wird, ob das Pollenschlauchwachstum normal bzw. unterdrückt ist. Aufgrund ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz ist diese Methode ein effektives Werkzeug, um die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität verschiedener Zitrussorten zu bestimmen, um Inkompatibilitätsgruppen und Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen verschiedenen Sorten zu ermitteln. Diese Methode liefert Informationen, die für die erfolgreiche Auswahl geeigneter Bestäuberbäume unerlässlich sind, und erleichtert so die Anlage neuer Obstplantagen und die Auswahl geeigneter Eltern für Zuchtprogramme.

Für die hier durchgeführten Experimente wurden reife Blüten ausgewählt, die Staubbeutel gesammelt, in einem Ofen getrocknet und der Pollen 12 h lang bei 28°C gekeimt. Die Lebensfähigkeit und die Keimraten der Pollen wurden wie in Abbildung 1 dargestellt quantifiziert.
Zitrusfrüchte wurden manuell bestäubt und die Pollenverträglichkeit und -unverträglichkeit wurden mittels Anilinblaufärbung und Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Der verträgliche Pollen könnte auf der...

Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode zur Bestimmung der Pollenkompatibilität und -unverträglichkeit bei Zitrussorten.

Bestimmung von Selbst(in)kompatibilitäts- und Inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei Zitrusfrüchten mittels manueller Bestäubung, Mikroskopie und S-Genotyp-Analysen

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

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Diese Technik kann den S-Genotyp effizient identifizieren und die Selbstinkompatibilität von Zitrusfrüchten genau identifizieren, wodurch die notwendigen Informationen für die Auswahl geeigneter Bestäuberbäume bereitgestellt werden. Dies ist eine zeiteffiziente, einfache und zuverlässige Technik, um die geeigneten Elternbäume in Zuchtprogrammen auszuwählen. Diese Technik ist einfach und leicht durchzuführen und das Experimentieren zum ersten Mal erfordert Geduld und Sorgfalt.Die Identifizierung des S-Genotyps und das S-spezifische Primerdesign erfordern mehr Aufmerksamkeit und Sorgfalt. Das Verfahren wird von Yu Hu, einem Master-Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Pollen, indem Sie die Blüten der Majia pomelo, Citrus maxima, ins Labor bringen.Sammeln Sie die Staubbeutel mit einer Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit Filterpapier. Trocknen Sie die Pollenkörner, indem Sie die Petrischale mit den Staubbeuteln für 24 Stunden in einen 28 Grad Celsius heißen Ofen stellen. Bewahren Sie die Pollen nach dem Trocknen in einem luftdichten Micro Centron-Zip-Lock-Beutel mit farbwechselndem Kieselgel auf.Verschließen Sie den Beutel und beschriften Sie den Beutel mit dem Namen der Pollensorte und dem Datum der Lagerung. Gießen Sie 300 Mikroliter des flüssigen Mediums in die Kappe eines Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchens und streuen Sie den Pollen mit Hilfe einer Bestäubungsbürste gleichmäßig ein. Legen Sie den Pollen in eine befeuchtete Blackbox und inkubieren Sie ihn 12 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.Schneiden Sie nach der Inkubation die oberste Ein-Millimeter-Spitze von einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und saugen Sie den Pollen mit einer kleinen Menge Kulturlösung ab. Platzieren Sie den Pollen in der Mitte des Objektträgers und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Wenn Sie fertig sind, beobachten Sie die Probe mit einem inversen Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv.Führen Sie drei unabhängige Replikate durch, wobei für jedes Replikat ungefähr die gleiche Pollendichte verwendet wird. Verwenden Sie für die Bestäubung eine Bestäubungsbürste, um eine ausreichende Menge lebensfähiger Pollen auf der Oberfläche der Narbe zu verteilen und darauf zu achten, dass der Stempel nicht beschädigt wird. Decken Sie die bestäubten Blüten mit einer Sulfat-Papiertüte ab und verhindern Sie die Bestäubung durch genotypisch unterschiedliche Pollen, indem Sie die Tüte mit einer Büroklammer verschließen.Schreiben Sie den Namen der Art sowie die Anzahl und den Zeitpunkt der Bestäubung auf das Etikett. Hängen Sie das Etikett an die Zweige in der Nähe der bestäubten Blüten. Entfernen Sie die Bestäubungsbeutel etwa drei bis vier Tage nach der Bestäubung und sammeln Sie die bestäubten Blüten in Zip-Lock-Beuteln.Entfernen Sie sofort die Blütenblätter, Gefäße und Eierstöcke von den Blüten und tauchen Sie die Narbe, die zum Stil verschmolzen ist, in ein Zentrifugenröhrchen mit einer frisch zubereiteten Fixierlösung. Die Narbe inkubieren und über Nacht bei vier Grad Celsius in der Fixierlösung stylen. Entsorgen Sie am nächsten Tag die Fixierlösung, bevor Sie die Narbe waschen, und stylen Sie sie zwei- bis dreimal in 95%igem Ethanol.Fügen Sie dann 70%ige Ethanollösung zum Stil hinzu und stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht ist. Die Styles können zu diesem Zeitpunkt ein bis zwei Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für die Anilinblaufärbung waschen Sie die in 70%igem Ethanol gelagerten Stilproben drei- bis viermal mit destilliertem Wasser.Tauchen Sie es in eine viermolare Natronlauge und versiegeln Sie es, bevor Sie es 60 Minuten lang in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius inkubieren. Während dieses Schritts ändert sich die Farbe des Stils von gelb-weiß zu orange-rot. Als nächstes tränken Sie die Stile in destilliertem Wasser.Entsorgen Sie nach 30 Minuten das destillierte Wasser und waschen Sie die Stile drei- bis viermal mit destilliertem Wasser oder bis die Farbe des Stils gelb wird. Fügen Sie dann das Anilinblau hinzu, bis die Probe eingetaucht ist, und inkubieren Sie es 12 Stunden lang im Dunkeln. Beobachten Sie das Wachstum der Pollenschläuche unter dem Fluoreszenzmikroskop.Legen Sie die Folie auf einen flachen Tisch. Teilen Sie den Stil entlang der Längsachse mit einem Skalpell in zwei Hälften. Legen Sie eine Hälfte des Stils auf einen Glasobjektträger und geben Sie zwei bis drei Tropfen Polyethylenglykol auf die Oberfläche des Objektträgers.Decken Sie es dann mit einem Deckglas ab. Wenn Sie fertig sind, legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch über der Blende und visualisieren Sie ihn mit einem 10-fachen Objektiv. Verwenden Sie den DAPI-Filter und beobachten Sie das Wachstum der Pollenschläuche.Beobachten Sie fünf Stile für jede Art der Bestäubung. Die Pollenlebensfähigkeit von Citrus maxima und die Keimraten wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Der kompatible Pollen keimte erfolgreich auf der Oberfläche der Narbe und produzierte einen normalen Pollenschlauch, der wuchs und schließlich zur Befruchtung im Eierstock führte.Im Gegensatz dazu wuchsen inkompatible Pollenschläuche durch etwa 2/3 des Stils und hörten dann auf zu wachsen. Die Agarose-Gelelektrophorese detektierte das DNA-Produkt, das mit den S-Locus-spezifischen Primern amplifiziert wurde. Es zeigte sich die Amplifikation des DNA-Produkts zwischen 500 und 1.000 Basenpaaren.Der entsprechende S-Genotyp wurde identifiziert. Mit dieser Methode wurden 21 S-Haplotypen in verschiedenen Zitrusarten identifiziert. Der Bestäubungsschritt ist entscheidend.Nur die erfolgreiche Bestäubung kann die spätere Beobachtung der Pollenschläuche gewährleisten. Die Technik wurde verwendet, um die Merkmale der Selbstinkompatibilität zu analysieren und die weiblichen Determinanten der Selbstinkompatibilität zu erforschen und zu identifizieren. Diese Methode ist wichtig für die Selbstinkompatibilitätsforschung und Zuchtprogramme.Es kann auch die Landwirte bei der Auswahl von Bestäuberbäumen für ihre Obstgärten unterstützen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Bestimmung von Selbst(in)kompatibilitäts- und Inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei Zitrusfrüchten mittels manueller Bestäubung, Mikroskopie und S-Genotyp-Analysen

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