Konzentration von Viruspartikeln aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt mittels Magermilchflockung und Ultrafiltration

Die Wasser- und Abwasserepidemiologie hat sich als alternative Methode zur Überwachung und Vorhersage des Verlaufs von Ausbrüchen in Gemeinden herausgestellt. Die Magermilchflockungsmethode stellt einen alternativen Ansatz zur Konzentration von Mikroben dar. Die Magermilchflockungsmethode stellt eine vielseitige, kostengünstige und einfach zu handhabende Methode dar, um mikrobielle Fraktionen zu konzentrieren, ohne signifikante Unterschiede im Vergleich zu Ultrafiltrations- oder Tangentialflussfiltrationsansätzen.

Dieser Ansatz wird für Metagenomik oder gezielte PCR-Studien verwendet. Sobald die mikrobiellen Fraktionen konzentriert sind, kann die Nukleinsäureextraktion mit kommerziellen Extraktionskits oder einem hauseigenen Protokoll durchgeführt werden. Die Magermilchflockungsmethode ist bei großen oder kleinen Mengen an Wasser- oder Abwasserproben relativ einfach.

Eine Hintergrundkontrolle mit Milli-Q-Wasser sollte als Teil dieser Methode enthalten sein. Kadir Yanac, Jhannelle Francis und Jocelyn Zambrano-Alvarado, Doktoranden aus dem Labor von Miguel Uyaguari, demonstrieren das Verfahren. Sammeln Sie zunächst zwei Liter 24-Stunden-Durchfluss-Proportional-Rohwasserproben.

Transportieren Sie die Proben in lichtdichten Flaschen in einer Kühlbox ins Labor und verarbeiten Sie sie innerhalb von 24 Stunden. Holen Sie sich die Daten zu den Abwassereigenschaften vom technischen Personal der Kläranlage. Für jede Ultrafiltrationsmethode werden fünfmal 10 bis vierte Kopien der gepanzerten RNA in 140 Milliliter von sechs frischen Abwasserproben gestochen, die an einem Datum und sechs frischen Abwasserproben an einem anderen Datum entnommen wurden.

Homogenisieren Sie die gepanzerte RNA in der Probe, indem Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius unter magnetischem Rühren rühren. Für die Magermilchflockung oder SMF wird eine 1%ige Magermilchlösung hergestellt, indem 0,5 Gramm Magermilchpulver in 50 Millilitern synthetischem Meerwasser aufgelöst werden. Stellen Sie den pH-Wert von SMF mit einer normalen Salzsäure auf 3,5 ein.

Geben Sie fünf Milliliter Magermilchlösung auf 500 Milliliter Rohabwasserprobe. Rühren Sie die Probe acht Stunden lang um und lassen Sie die gebildeten Flocken weitere acht Stunden bei Raumtemperatur absetzen. Entfernen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette, ohne die sesshaften Schwärme zu stören.

Ein Endvolumen von 50 Millilitern mit den Flocken in ein Zentrifugenröhrchen geben und bei 8.000 G 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und kratzen Sie das Pellet vorsichtig mit einem sterilisierten Spatel ab. Resuspendieren Sie das verbleibende Pellet in 250 Mikrolitern 0,2 molaren Natriumphosphatpuffer.

Übertragen Sie die geschabten und resuspendierten Pellets in dasselbe 1,5-Milliliter-Mini-Zentrifugenröhrchen. Führen Sie eine virale RNA-Extraktion aus viralen Konzentraten von Abwasserproben und Rückgewinnungseffizienztests mit einem RNA-Extraktionskit mit einem Verhältnis von 25:24:2:1 von Phenol zu Chloroform zu Isoamylalkohol und Beta-Mercaptoethanol gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Zum Schluss wird die RNA in 50 Mikrolitern Elutionspuffer eluiert.

Für die RT-qPCR-Analyse wird gepanzerte RNA mit zehnfacher Verdünnung einer synthetischen einzelsträngigen DNA oder eines gBlock-Konstrukts quantifiziert. Erhalten Sie Kalibrierkurven für jeden RT-qPCR-Durchlauf. Fügen Sie Negativkontrollen hinzu und führen Sie die Proben in dreifacher Ausfertigung aus.

Sammeln Sie 10 Liter Umweltoberflächenwasserprobe. Fügen Sie 10 Liter deionisiertes Wasser zur Hintergrundkontrolle hinzu. Führen Sie die Kapsel- und Vakuumfiltration mit Membranscheibenfiltern mit einer Größe von 0,45, 0,2 und 0,1 Mikrometern durch, um das Rauschen während der Metagenomik-Sequenzierung zu minimieren.

Stellen Sie nach der Filtration den pH-Wert der Wasserprobe mit einer normalen Salzsäure auf 3,5 ein. Bereiten Sie eine 1%ige vorgeflockte Magermilchlösung vor und stellen Sie den pH-Wert auf 3,5 ein. Geben Sie 100 Milliliter der angesäuerten Magermilchlösung in 10 Liter angesäuerte Umweltwasserprobe.

Rühren Sie die Probe acht Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Magnetschüttler um und lassen Sie die Schwärme weitere acht Stunden durch Schwerkraft sedimentieren. Entfernen Sie den Überstand nach dem Absetzen vorsichtig mit einer Vakuumpumpe, ohne die Flocken zu stören. Aliquotieren und balancieren Sie die restlichen Flocken entsprechend dem Gewicht in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und einer Zentrifuge aus.

Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 200 Mikrolitern 0,2 molaren Natriumphosphatpuffer auf. Behandeln Sie die gelösten Pellets mit DNase I und RNase A gemäß den Anweisungen des Herstellers, um freie DNA und RNA zu entfernen, die während des Extraktionsprozesses kopiert wurden. Inaktivieren Sie nach der Inkubation DNase I und RNase A.Extrahieren Sie Nukleinsäuren aus dem gelösten Pellet mit einem DNA- oder RNA-Extraktionskit.

Quantifizieren Sie die Gesamtmenge der extrahierten DNA oder RNA aus der Oberflächenwasserprobe der Umwelt mit einem Fluorometer. Führen Sie eine qPCR-Analyse durch, um auf Darmviren von Interesse abzuzielen, und eine Illumina-Sequenzierung, um die Struktur der viralen Gemeinschaft zu identifizieren. Sammeln Sie zwei Liter Wasserproben aus geschützten und betroffenen Gewässern.

Wenn die Probe erhebliche Ablagerungen enthält, verwenden Sie ein Käsetuch, um diese zu entfernen. Geben Sie 20 Milliliter 1%ige Magermilchlösung in die zuvor pH-eingestellte Zwei-Liter-Süßwasserprobe. Rühren Sie die Probe acht Stunden lang bei Raumtemperatur um und lassen Sie die Schwärme weitere acht Stunden durch Schwerkraft sedimentieren.

Entfernen Sie den Überstand nach dem Absetzen vorsichtig mit einer Peristaltikpumpe. Die sedimentierten Flocken werden in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 8.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern 0,2 molaren Natriumphosphatpuffer.

Wählen Sie etwa 0,5 Gramm des Flocks für die DNA-Extraktion aus, indem Sie das Nukleinsäure-Isolationskit Ihrer Wahl gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Fluorometer. Alle sechs Proben, die mit Ultrafiltration bei 3.000 G verarbeitet wurden, waren positiv.

Im Gegensatz dazu war nur eine Probe positiv, wenn die Proben mit Ultrafiltration bei 7.500 G verarbeitet wurden.Alle mit SMF verarbeiteten Proben waren positiv und führten zu einer besseren Ausbeute. Die durchschnittlichen Rückgewinnungsraten von 3.000 G und SMF waren signifikant und konstant höher als bei der Ultrafiltration mit 7.500 G. Wasserqualitätsparameter in beeinflussten Proben und Nukleinsäuren, die aus Umweltwasserproben extrahiert wurden, die in Winnipeg über drei Saisons gesammelt wurden, sind hier zusammengefasst. Proben, die von April bis Oktober 2022 aus dem Wasser des Assiniboine River entnommen wurden, ergaben die höchste DNA-Konzentration von Forested 1 und die niedrigste Konzentration wurde von landwirtschaftlich genutztem Standort drei gewonnen.

Es ist sehr wichtig, die richtige Konzentration an Magermilch zu verwenden und die Probe vor der Verwendung anzusäuern. Diese Technik ermöglicht ein schnelles Screening verschiedener mikrobieller Krankheitserreger, die in Umweltproben wie Wasser und Abwasser vorhanden sind. Zusätzliche Modifikationen können mit festen Matrizen wie Boden oder Sedimenten umgesetzt werden.