Name: Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel mit niedrigem Endotoxingehalt aus SW480- und SW620-Zelllinien. Diese Methode minimiert Kontaminationen und verbessert die Zuverlässigkeit von EV-Studien erheblich.

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Diese Arbeit wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum, Polen, unter der Fördernummer 2019/33/B/NZ5/00647 unterstützt. Wir danken Professor Tomasz Gosiewski und Agnieszka Krawczyk von der Abteilung für Molekulare Medizinische Mikrobiologie des Medizinischen Kollegs der Jagiellonen-Universität für ihre unschätzbare Hilfe beim Nachweis von bakterieller DNA in Elektrofahrzeugen.

1. Vorbereitung von Ultrazentrifugenröhrchen
<ol><li>Verwenden Sie sterile Einwegröhrchen. Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie die Ultrazentrifugenröhrchen wieder, nachdem Sie sie mit einem Reinigungsmittel mit einer sterilen Pasteurpipette oder anderen Einwegapplikatoren gewaschen haben. Denken Sie daran, dass Ultrazentrifugenröhrchen für eine Art von zentrifugiertem Material (Zellkulturüberstand/Serum/Plasma) und Spezies (Mensch/Maus/etc.) bestimmt sein sollten.</li>
	<li>Spülen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen nach einer Waschmittelwäsche 3x mit entionisiertem, LPS-freiem Wasser aus. HINWEIS: Verwenden Sie kein minderwertiges Wasser.</li>
	<li>Trocknen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen und füllen Sie sie dann mit 70% Ethanol. Lassen Sie die Röhrchen mit 70% Ethanol zur Desinfektion über Nacht stehen. Entfernen Sie das Ethanol und trocknen Sie die Röhrchen erneut.</li>
	<li>Legen Sie die Röhrchen und Kappen in die Sterilisationsverpackung und verschließen Sie sie fest. Verwenden Sie die Plasma- oder Gassterilisationsmethode (Ethylenoxid)18,19. Lagern Sie die in der Sterilisationsverpackung enthaltenen Ultrazentrifugenröhrchen an einem trockenen Ort und verwenden Sie sie vor dem Verfallsdatum. HINWEIS: Führen Sie eine monatliche Überwachung des LPS-Gehalts in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und des für die Isolierung von Elektrofahrzeugen verwendeten Wassers durch. Die Überwachung sollte auch die Röhrchen einbeziehen (z. B. durch Prüfung des Wassers [Waschsteuerung], das über Nacht bei Raumtemperatur [RT] in den Ultrazentrifugenröhrchen gelagert wurde).</li>
</ol>2. Herstellung von EV-abgereichertem fetalem Rinderserum mit niedrigem Endotoxingehalt (EE-FBS)
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass Sie FBS mit extrem niedrigem Endotoxingehalt verwenden (im Handel erhältlich; siehe Materialtabelle; <0,1 EU/ml).</li>
	<li>Stellen Sie eine Flasche FBS mit extrem niedrigem Endotoxingehalt in ein Wasserbad und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 56 °C. Dieser Schritt ist erforderlich, um das Komplementsystem zu deaktivieren.</li>
	<li>Das inaktivierte FBS wird in Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert und bei 100.000 x g für 4 h bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand in sterilen 50-ml-Röhrchen und achten Sie darauf, dass 45 ml pro Röhrchen nicht überschritten werden, um eine Kontamination der Kappe und eine Benetzung des Röhrchenrings zu vermeiden.</li>
	<li>Lagern Sie das so aufbereitete EE-FBS-Serum bei -20 °C. Überprüfen Sie die LPS-Konzentration in EE-FBS (Schritt 6). Die LPS-Konzentration sollte auf dem gleichen Niveau wie vor der Ultrazentrifugation liegen.</li>
</ol>3. Zellkultur
<ol><li>Für diese Studie wurden SW480- und SW620-Zelllinien in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Gentamicin (50 μl/ml) entsprechend mit 10% EE-FBS in 75 cm2 Kulturflaschen unter Verwendung der aseptischen Technik kultiviert. Säen Sie fast 4,5 x 10 6 Zellen und 6,5 x 106 Zellen pro Kolben für SW480 bzw. SW620.</li>
	<li>Sammeln Sie die Überstände zweimal pro Woche (~ 10 ml pro Kolben), wenn die Zellen die volle Konfluenz erreichen (~ 13,5 x 10 6 und 20 x 106 Zellen pro Kolben für SW480 bzw. SW620) und teilen Sie sie. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Zellen mindestens 99 % beträgt und dass die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert werden.</li>
	<li>Sammeln Sie Überstände aus der Zellkultur in entsprechend gekennzeichneten 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die gesammelten Überstände bei 500 x g für 5 min bei RT, um Zelltrümmer zu entfernen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Überstände sorgfältig, vermeiden Sie das Ansaugen von Schmutz, legen Sie sie in beschriftete Röhrchen und zentrifugieren Sie sie erneut bei 3.200 x g für 12 min bei 4 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie Überstände aus dem zweiten Zentrifugationsschritt in sterilen, beschrifteten 50-ml-Röhrchen. Vermeiden Sie es, die Ränder von Rohren zu benetzen. Stellen Sie sicher, dass das Volumen des Überstands 45 ml nicht überschreitet und dass die Röhrchen vertikal gehalten werden.</li>
	<li>Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens mit einer sterilen transparenten Folie ein und lagern Sie die Überstände in vertikaler Position bei -80 °C. HINWEIS: Führen Sie eine monatliche Kontrolle von Mycoplasma spp. durch. und LPS-Kontamination in Frischkulturüberständen (Schritt 6). Wenn der Endotoxingehalt in den Überständen 0,05 EU/ml überschreitet, überprüfen Sie, in welchem Stadium eine Kontamination aufgetreten sein könnte, und starten Sie den Prozess von vorne. Bei Kontamination der Zellkultur durch Mycoplasma spp. festgestellt wird, sollte die Isolierung der Elektrofahrzeuge von solchen Überständen abgebrochen werden.</li>
</ol>4. Isolierung von EVs aus Zellkulturüberständen
<ol><li>Bereiten Sie 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter und Spritzen mit dem richtigen Volumen vor. Bereiten Sie zwei Röhrchen mit Kulturüberständen (90 ml) vor.</li>
	<li>Füllen Sie die Spritze mit dem Überstand und befestigen Sie den Filter am Nadeladapter. Legen Sie die gefüllte Spritze mit dem Filter über ein 50-ml-Röhrchen. Drücken Sie auf den Kolbenflansch und sammeln Sie ~90 ml Filtrat.</li>
	<li>Das Filtrat (7 ml) wird in die Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert (wobei darauf zu achten ist, dass das gleiche Volumen in jedes Röhrchen pipettiert wird, um ein ausgewogenes Gleichgewicht zu gewährleisten) und bei 100.000 x g 2 h bei 4 °C zentrifugiert. HINWEIS: Die Effizienz der Pelletierung von Elektrofahrzeugen hängt von vielen Faktoren ab (z. B. Rotortyp, k-Faktor, Migrationsweglänge, Viskosität des Mediums usw.), die für eine bessere Rückgewinnung von Elektrofahrzeugenoptimiert werden müssen 20.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette. Sammeln Sie die restlichen Pellets mit langen, filtrierten Pipettenspitzen und füllen Sie sie in zwei Ultrazentrifugenröhrchen auf. Füllen Sie sie bis zu 7 ml mit gefiltertem endotoxinfreiem PBS, um die EVs zu spülen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die PBS-resuspendierten Pellets bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette vollständig und geben Sie 200 μl gefiltertes, endotoxinfreies PBS in beide Röhrchen, um die EVs zu resuspendieren. Pipettieren Sie das Pellet des Elektrofahrzeugs vorsichtig, um alle Elektrofahrzeuge zu sammeln.</li>
	<li>Übertragen Sie die EVs-Suspension in ein steriles 1,5-ml-Reagenzglas (wenn möglich, verwenden Sie ein Röhrchen mit geringer Proteinbindung). Bewahren Sie 10 μl der EV-Suspension zur Herstellung einer Verdünnung für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und für andere Zwecke (z. B. Proteinkonzentrationsmessung) auf.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Elektrofahrzeuge mit gefiltertem PBS (1:1.000) für Messungen durch NTA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Sichern Sie die EV-Schläuche, indem Sie die Kappe mit einer sterilen transparenten Folie umwickeln. Lagern Sie die Elektrofahrzeuge bei -80 °C.</li>
</ol>5. Nachweis spezifischer Marker durch Western Blot
<ol><li>Bestimmen Sie den Proteingehalt in den Proben (z. B. durch Bradford-Assay) und bereiten Sie die Proben (20 μg) mit Ladepuffer vor. Bereiten Sie den Beladungspuffer vor, indem Sie 5 μl Probenpuffer (4x) und 2 μl Probenreduktionsmittel (10x) zu einem Gesamtvolumen von 20 μl mischen. Inkubieren Sie die Proben bei 70 °C für 10 min.</li>
	<li>Bereiten Sie Polyacrylamidgele mit SDS (10%-14%) vor und laden Sie die 20 μg EVs in jede Vertiefung.</li>
	<li>Führen Sie die Elektrophorese mit laufendem Puffer (30 g Tris, 144 g Glycin, 10 % SDS pro 1 l) für 45 min bei 150 V durch.</li>
	<li>Führen Sie eine halbtrockene Übertragung von Proteinen aus dem Gel auf die Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran in einer Transfermaschine mit Towbin-Puffer (1,51 g Tris, 7,2 g Glycin, 10% Methanol pro 0,5 l) bei 25 V für 1 h durch.</li>
	<li>Legen Sie die Membran in TBST-Puffer (1 ml Tween, 100 ml Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS 10x) pro 1 l) zum Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBST-Puffer und inkubieren Sie sie 1 h lang auf der Wippe bei RT.</li>
	<li>Verdünnte (1:1.000) Antikörper, Anti-CD9 1 (Klon # D8O1A) oder Anti-Alix 1 (Klon # 3A9) in1% BSA zugeben und mit der Membran über Nacht bei 4 °C auf der Wippe inkubieren. Entfernen Sie Antikörper und waschen Sie die Membran 3x mit 10 ml 1x TBST für 10 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie je nach primärem Antikörper auf der Membran einen mit Meerrettichperoxidase konjugierten Sekundärantikörper gegen Kaninchen oder Ziegen (Verdünnung: 1:2.000) hinzu und inkubieren Sie ihn 1 h lang auf der Wippe bei RT. Entfernen Sie die Antikörper und waschen Sie die Membran 3x mit 10 ml 1x TBST für 10 Minuten.</li>
	<li>Mischen Sie das Substrat und das Luminol im Verhältnis 1:1, um eine 1-ml-Lösung zu erhalten. Gießen Sie die Lösung auf die Membran. Platzieren Sie die Membran sofort in der Messkammer des Bildgebungssystems, wählen Sie das Chemilumineszenzmodul und visualisieren Sie die Proteinbanden auf dem Bildschirm.</li>
</ol>6. Messung des Endotoxinspiegels durch Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (LAL)
<ol><li>Führen Sie eine chromogene LAL-Messung des Endotoxinspiegels gemäß der Empfehlung des Herstellers durch. Verwenden Sie kurz gesagt die Methode, die auf der Wechselwirkung des Endotoxins mit dem Limulus-Amöbozytenlysat (LAL) basiert. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,005 EU/ml. ANMERKUNG: Der LAL-Assay ist trotz seiner Einschränkungen derzeit nach wie vor die Standardmethode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Endotoxinkontamination in verschiedenen Arten von Lösungen und anderen Produkten, die in Wissenschaft oder Medizin verwendet werden8. Der limitierende Faktor dieses Kits ist die Stabilität der rekonstituierten Amöbozytenlysatlösung, die bei -20 °C nur 1 Woche stabil ist, wenn sie unmittelbar nach der Rekonstitution eingefroren wird.</li>
	<li>Verwenden Sie eine zehnfache Verdünnung von EVs und anderen Proben und eine 50-fache Verdünnung des Serums. Verwenden Sie für weitere Experimente nur Reagenzien mit niedrigem Endotoxingehalt wie EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/ml) und LPS-freie Kulturüberstände.</li>
</ol>7. Nachweis des prokaryotischen 16S-rRNA-Gens in EV-Proben
<ol><li>Isolieren Sie DNA aus den EV-Proben. Versuchen Sie, die Reagenzien und den Ort der Isolierung aseptisch zu halten. Messen Sie die DNA-Konzentration und -Qualität (z. B. mit einem Spektralphotometer).</li>
	<li>Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, wie zuvor beschrieben21. Bereiten Sie 1,5% Agarosegel mit Ethidiumbromid oder SYBR-Grün vor, um die PCR-Produkte im ultravioletten Licht (UV) sichtbar zu machen.</li>
	<li>Elektrophorese der Probe und des Gewichtsmarkers mit TRIS-Acetat-EDTA-Puffer bei 75 V für 45 min. Visualisieren Sie DNA-Banden mit dem Bildgebungssystem.</li>
</ol>8. Bestimmung der effektiven LPS-Konzentration zur Stimulation im humanen Monozytenmodell
<ol><li>Bereiten Sie 2 x 106 Monozyten/ml Monozytensuspension in RPMI 1640 vor, ergänzt mit L-Glutamin, Glucose und 2% EE-FBS. 50 μl der Suspension pro Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte22 werden zugegeben.</li>
	<li>Fügen Sie ein geeignetes Volumen LPS oder Kulturmedium hinzu, um die folgenden Endkonzentrationen zu erhalten: 0 pg/ml (Kontrolle), 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml und 100 ng/ml in 100 μl Gesamtvolumen der Zellsuspension. Verdreifachen Sie jede LPS-Konzentration.</li>
	<li>Die Zellen werden 18 h lang bei 37 °C, 5% CO2 kultiviert. Sammle den Überstand.</li>
	<li>Den Überstand bei 2.000 x g 5 min herunterschleudern. Übertragen Sie die Überstände in neue Röhrchen. Messen Sie die Konzentration von TNF 8,23 und IL-10 23 in gesammelten Überständen mit dem humanen Zytokin-Kit (CBA) des zytometrischen Beads-Arrays (CBA) gemäß dem Verfahren des Herstellers mit einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt konstruiert werden könnten.

In den letzten Jahren haben Methoden zur ordnungsgemäßen Isolierung von Elektrofahrzeugen zunehmend an Bedeutung gewonnen, um weitere zuverlässige Analysen zu ermöglichen, z. B. im Zusammenhang mit der Gewinnung zuverlässiger Omics- und Funktionsdaten24. Basierend auf früheren Forschungserfahrungen scheint es, dass nicht nur die Art der Isolationsmethode, sondern auch andere Bedingungen während dieses Verfahrens wichtig sein können. Die Verwendung von EV-abgereichertem FBS wird weithin als Notwend...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nach der Nomenklatur MISEV 2018 ein Sammelbegriff, der verschiedene Subtypen von zellsezernierten membranösen Vesikeln beschreibt, die bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen 1,2. Darüber hinaus sind Elektrofahrzeuge als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten sowie als Therapeutika und Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten vielversprechend. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Anschaffunggibt 3. Eine solche Herausforderung ist die Isolierung von endotoxinfreien Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen vernachlässigt wurde. Eines der häufigsten Endotoxine ist das Lipopolysaccharid (LPS), das ein Hauptbestandteil gramnegativer bakterieller Zellwände ist und aufgrund der Freisetzung einer großen Anzahl von entzündlichen Zytokinen durch verschiedene Zellen eine akute Entzündungsreaktion hervorrufen kann 4,5. LPS induziert eine Reaktion durch Bindung an das LPS-bindende Protein, gefolgt von einer Interaktion mit dem CD14/TLR4/MD2-Komplex auf myeloischen Zellen. Diese Wechselwirkung führt zur Aktivierung von MyD88- und TRIF-abhängigen Signalwegen, was wiederum den Kernfaktor Kappa B (NFkB) auslöst. Die Translokation von NFkB in den Zellkern initiiert die Produktion von Zytokinen6. Monozyten und Makrophagen reagieren sehr empfindlich auf LPS, und ihre Exposition gegenüber LPS führt zu einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (z. B. IL-6, IL-12, CXCL8 und TNF-α)7,8. Die CD14-Struktur ermöglicht die Bindung verschiedener LPS-Spezies mit ähnlicher Affinität und dient als Co-Rezeptor für andere Toll-like-Rezeptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 und 9)6. Die Zahl der Studien, die zu den Auswirkungen von EVs auf Monozyten/Makrophagen durchgeführt werden, nimmt immer noch zu 9,10,11. Insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung der Funktionen von Monozyten, ihren Subpopulationen und anderen Immunzellen ist das Vorhandensein von Endotoxin und sogar ihre maskierte Anwesenheit in EVs von großer Bedeutung12. Die übersehene Kontamination von Elektrofahrzeugen mit Endotoxinen kann zu irreführenden Schlussfolgerungen führen und ihre wahre biologische Aktivität verschleiern. Mit anderen Worten, die Arbeit mit monozytären Zellen erfordert Vertrauen in die Abwesenheit einer Endotoxinkontamination13. Mögliche Quellen für Endotoxine können Wasser, kommerziell erhältliche Medien und Seren, Medienkomponenten und -additive, Laborglaswaren und Kunststoffwaren 5,14,15 sein.
Daher zielte diese Studie darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung von niedrig endotoxinhaltigen EVs zu entwickeln. Das Protokoll enthält einfache Hinweise, wie eine Endotoxinkontamination während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden werden kann, anstatt Endotoxine aus Elektrofahrzeugen zu entfernen. Zuvor wurden viele Protokolle vorgestellt, wie Endotoxine beispielsweise aus technisch hergestellten Nanopartikeln entfernt werden können, die in der Nanomedizin verwendet werden. Keiner von ihnen ist jedoch für biologische Strukturen wie EVs nützlich. Die effektive Depyrogenisierung von Nanopartikeln kann durch Ethanol- oder Essigsäurespülen, Erhitzen auf 175 °C für 3 h, γ Bestrahlung oder Triton-X-100-Behandlung erfolgen; Diese Verfahren führen jedoch zur Zerstörung von Elektrofahrzeugen16,17.
Das vorgestellte Protokoll ist eine bahnbrechende Studie, die sich auf die Vermeidung von Endotoxinverunreinigungen in EVs konzentriert, im Gegensatz zu früheren Studien zur Wirkung von EVs auf Monozyten9. Die Anwendung der vorgeschlagenen Prinzipien auf die Laborpraxis kann dazu beitragen, zuverlässige Forschungsergebnisse zu erhalten, was entscheidend sein kann, wenn die mögliche Verwendung von EVs als Therapeutika in der Klinik in Betracht gezogen wird12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Alix (3A9) Maus mAbs;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2171</td><td></td></tr><tr><td>1250ul Filter Universal Pipettenspitzen, klar, Polypropylen, nicht pyrogen</td><td>GoogLab Scientific</td><td>GBFT1250-R-NS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBA Human Th1/Th2 Zytokin-Kit II</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>CD9 (D8O1A) Kaninchen mAb</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>13174</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Bildgebungssystem</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>17001401</tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ELX800NB, Universal-Mikroplatten-Reader</td><td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum Südamerika mit extrem niedrigem Endotoxingehalt</td><td> Biowest</td><td>&nbsp; S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin, 50 mg/ml</td><td>&nbsp; PAN &ndash; Biotech</td><td>P06-13100</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG - HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG - HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membran</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1620177</tr><tr><td>LPS aus Salmonella abortus equi S-Form (TLRGRADE)</td><td>&nbsp; Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ALX-581-009-L002</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoretische Mini-Trans-Blot-Transferzelle</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>Analyse der Verfolgung von Nanopartikeln&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS-Probenpuffer (4X)</td><td> Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Probenreduktionsmittel (10x)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>transparente Folie</td></tr><tr><td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td><td>EURx</td><td>E3141-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PierceTM Chromogenes Endotoxin Quant Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39552</td><td></td></tr><tr><td>PP Oak Ridge Röhrchen mit Verschlusskappen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3929, 03613</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>RPMI-1640 (Gibco)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermocycler</td><td>Applied Biosystem</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Zentrifuge mit T-1270 Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75000100</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT Horizontales Elektrophoresesystem</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1704401</tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>SW480 Zelllinie</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW480 Zelllinie</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter 0,22 um</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>1703940</td><td>Transfergerät</td></tr><tr><td>Transferpipette, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von extrazellulären vesikeln mit niedrigem endotoxingehalt, die aus krebszelllinien stammen

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine heterogene Population von Membranvesikeln, die von Zellen in vitro und in vivo freigesetzt werden. Ihre Allgegenwart und ihre bedeutende Rolle als Träger biologischer Informationen machen sie zu faszinierenden Studienobjekten, die zuverlässige und sich wiederholende Protokolle für ihre Isolierung erfordern. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Forschung gibt (wie z.B. die richtige Beschaffung). Diese Studie stellt ein Protokoll für die Isolierung kleiner EVs (gemäß der MISEV 2018-Nomenklatur) aus dem Kulturüberstand von Tumorzelllinien vor, das auf differentieller Zentrifugation basiert. Das Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxinen während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden und richtig bewertet werden kann. Eine Endotoxin-Kontamination von EVs kann nachfolgende Experimente erheblich behindern oder sogar ihre wahren biologischen Auswirkungen verschleiern. Andererseits kann das übersehene Vorhandensein von Endotoxinen zu falschen Schlussfolgerungen führen. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn es um Zellen des Immunsystems, einschließlich Monozyten, geht, da Monozyten eine Population darstellen, die besonders empfindlich auf Endotoxinrückstände reagiert. Daher wird dringend empfohlen, EVs auf Endotoxinkontamination zu untersuchen, insbesondere wenn mit endotoxinempfindlichen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, myeloischen Suppressorzellen oder dendritischen Zellen gearbeitet wird.

Voraussetzung oder obligatorischer Schritt für dieses Protokoll ist der Ausschluss einer möglichen Endotoxinkontamination aus Reagenzien. Alle verwendeten Reagenzien wie FBS, DMEM, RPMI, PBS und sogar Ultrazentrifugenröhrchen müssen endotoxinfrei sein (&lt;0,005 EU/ml). Es ist nicht einfach, das Regime ohne Endotoxinkontamination aufrechtzuerhalten, da z. B. das Normal-/Standardserum für die Zellkultur eine reichhaltige Quelle sein kann (0,364 EU/ml; siehe Tabelle 1).
Obwohl d...

Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Dieses Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass jedes Labor, das sich mit Elektrofahrzeugen befasst, die Endotoxinkontamination begrenzen kann, indem es ein aseptisches Verfahren durchführt und einfache und weit verbreitete Geräte verwendet. Jeder, der diese Technik zum ersten Mal ausprobiert, sollte mit neuen Medien, Reagenzien und Kunststoffen beginnen, die endotoxinarm, nicht pyrogen markiert sind.Verwenden Sie für dieses Protokoll endotoxinfreie Reagenzien, Wasser, Nährmedien, gefiltertes PBS, FBS mit extrem niedrigem Endotoxingehalt und Ultrazentrifugenröhrchen. Sammeln Sie zunächst den Überstand von zuvor kultivierten SW480- und SW620-Zelllinien in entsprechend markierten 15-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie den Überstand fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 x g zentrifugieren.Sammeln Sie den Überstand, ohne den Schmutz zu stören, in einem neuen beschrifteten Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 3.200 x g für 12 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie vorsichtig 45 Milliliter des Überstands in ein senkrecht aufgestelltes steriles 50-Milliliter-Röhrchen, ohne die Ränder des Röhrchens zu benetzen. Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens mit einer sterilen, transparenten Folie ein und lagern Sie sie senkrecht bei minus 80 Grad Celsius, um anschließend extrazelluläre Vesikel zu isolieren.Beginnen Sie mit der Isolierung, indem Sie 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter, Spritzen und Röhrchen mit etwa 90 Millilitern Überstand vorbereiten. Füllen Sie eine Spritze mit dem Überstand und befestigen Sie den Filter am Nadeladapter. Filtern Sie den Überstand durch den Filter in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Sieben Milliliter des Filtrats werden in ein vorbereitetes Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert und zwei Stunden lang bei 100.000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um den Überstand zu entsorgen. Ziehen Sie die Pellets mit einer langen gefilterten Pipettenspitze in ein Ultrazentrifugenröhrchen.Spülen Sie die extrazellulären Vesikel durch Zugabe von sieben Millilitern gefiltertem endotoxinfreiem PBS. Nach der Ultrazentrifugation wird der Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette verworfen und das Pellet in 200 Mikrolitern endotoxinfreiem PBS resuspendiert. Übertragen Sie die Suspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Reagenzglas mit geringer Proteinbindung.Übertragen Sie dann 10 Mikroliter Suspension zur weiteren Analyse in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Verdünnen Sie nun in einem neuen Röhrchen einen Mikroliter Suspension mit gefiltertem PBS im Verhältnis 1 zu 1000 für die Nanopartikel-Tracking-Analyse.Um eine Blotting-Analyse durchzuführen, mischen Sie zunächst 20 Mikrogramm der Proben mit einem Beladungspuffer. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Laden Sie dann 20 Mikrogramm der Probe in jede Vertiefung eines 10 bis 14%igen Polyacrylamidgels mit SDS und führen Sie eine Elektrophorese für 45 Minuten bei 150 Volt mit laufendem Puffer durch.Als nächstes geben Sie das Gel in eine Transfermaschine mit Towbin-Puffer und führen eine Stunde lang einen halbtrockenen Transfer von Proteinen auf eine Polyvinylidendifluoridmembran bei 25 Volt durch. Blockieren Sie die Membran mit 1% BSA, indem Sie sie eine Stunde lang auf einer Wippe inkubieren. Fügen Sie der Membran BSA-verdünnte Antikörper, Anti-CD9 oder Anti-Alix, hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippe.Waschen Sie die Membran nach dem Entfernen der Antikörper dreimal 10 Minuten lang mit 10 Millilitern TBST. Fügen Sie nun Ziegen-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie erneut eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Entsorgen Sie den Antikörper und waschen Sie die Membran wie zuvor gezeigt.Gießen Sie einen Milliliter der Lösung, die Substrat und Luminol enthält, in einem gleichen Verhältnis auf die Membran. Platzieren Sie die Membran sofort in einem Bildgebungssystem und visualisieren Sie die Proteinbanden auf dem Bildschirm. In der vorliegenden Studie bestätigte die Western-Blot-Analyse das Vorhandensein von zwei extrazellulären Vesikelmarkern, CD9 und Alix.Die mittlere Größe und die Konzentrationen der Vesikel, die sowohl aus SW480 als auch aus SW620 isoliert wurden, waren ähnlich. Die Stimulation von Monozyten mit verschiedenen Dosen von Lipopolysaccharid (LPS) zeigte die niedrigste Dosis von LPS, die die Sekretion von Interleukin 10 ermöglichte, und der Tumornekrosefaktor in Monozyten betrug 50 Pikogramm pro Milliliter. Der chromogene LAL-Test zeigte, dass die LPS-Kontamination der extrazellulären Vesikel für beide Zelllinien etwa 50 Pikogramm pro Milliliter betrug.Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist die Verwendung von LPS-freien oder abgereicherten Reagenzien und die routinemäßige LPS-Messung bei jedem Schritt des Verfahrens. Es ist einfacher, eine Endotoxinkontamination zu verhindern, als sie zu beseitigen. Das vorgeschlagene Protokoll begrenzt die Möglichkeit falscher Ergebnisse aufgrund der Kontamination von EVs mit Endotoxin und ermöglicht die Bewertung der EV-Aktivität pro Zelle.Das vorgeschlagene Protokoll ist nützlich für Forscher, die mit Endotoxin-empfindlichen Zellen wie Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen arbeiten.

isolation-low-endotoxin-content-extracellular-vesicles-derived-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Watson, D. C., et.al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Isolierung und Konzentration von extrazellulären Vesikeln (EVs), die aus der äußeren Membran von gentechnisch veränderten Bakterien gewonnen werden. Der Prozess umfasst die Kultivierung der Bakterien, um EVs freizusetzen, gefolgt von sequenziellen Zentrifugations- und Filtrationsschritten, um Zellen und Ablagerungen...

Isolierung und Anreicherung von extrazellulären Vesikeln aus der äußeren Membran aus Bakterien

Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

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Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.

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In dieser Arbeit beschreiben wir eine magnetische Separations-gestützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimikern (EMs), die den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur, Morphologie und Proteinzusammensetzung von nativen extrazellulären Vesikeln (EVs) aufweisen.

Ein magnetabscheidungsunterstütztes Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsverfahren für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Vesikeln

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Skalierbarer Biomanufacturing-Workflow zur Herstellung und Isolierung von natürlichen, aus Killerzellen gewonnenen extrazellulären Krebs-Biotherapeutika auf Vesikelbasis

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die effektive Isolierung extrazellulärer Vesikel aus der menschlichen Muttermilch mit hoher Reinheit zu beschleunigen und zu ermöglichen.

Schnelle Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus der menschlichen Muttermilch

Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel mit niedrigem Endotoxingehalt aus SW480- und SW620-Zelllinien. Diese Methode minimiert Kontaminationen und verbessert die Zuverlässigkeit von EV-Studien erheblich.

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

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