Netzwerk Pharmakologische Vorhersage und metabolomische Validierung des Mechanismus von Fructus phyllanthi gegen Hyperlipidämie

Unsere Forschung umfasst serielle experimentelle Techniken und das Protokoll enthält diese Details, die für die Leser notwendig sind, um unsere Methoden zu verstehen. Unsere integrierte Methode kompensiert den Nachteil der Netzwerkpharmakologie und Metabolomik und kann für die therapeutische Metaanalyse der Naturheilkunde eingesetzt werden. Diese Methode wird verwendet, um den Wirkstoff aus dem Inhaltsstoff des Unternehmens und dem Anzug für Jogger mit massiver chemischer Zusammensetzung, wie z. B. einer traditionellen chinesischen Medizin, zu screenen.

Wählen Sie zunächst die Wirkstoffe und Hauptziele aus, indem Sie in der Datenbank der Systeme der traditionellen chinesischen Medizin nach dem Stichwort phyllanthi fructus suchen. Um die Liste der Wirkstoffkandidaten und Zielmoleküle von Fructus phyllanthi (FP) zu erhalten, suchen Sie nach dem Stichwort Hyperlipidämie in der Genkartendatenbank, der Online-Datenbank Mendelsche Vererbung beim Menschen und der therapeutischen Zieldatenbank, um die jeweiligen Kandidatenziele für Hyperlipidämie zu erhalten. Laden Sie die Tabellen der Krankheitsziele herunter, speichern Sie sie in einem Ordner und löschen Sie die wiederholten Ziele, um die Liste der Hyperlipidämieziele zu erhalten.

Kopieren Sie dann die Listen der FP-Wirkstoffe, FP-Targets und Hyperlipidämie-Targets in eine neue Tabelle. Verwenden Sie die Funktion zur Identifizierung von Datenduplikaten in der Symbolleiste, um Schnittpunktziele abzurufen. Importieren Sie die Kreuzungszielliste in die UniProt-Wissensdatenbank, um die Gen- und Proteinnamen zu standardisieren.

Um ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk zu konstruieren, fügen Sie die Kreuzungszielliste von FP gegen Hyperlipidämie in das Dialogfeld "Namensliste" der String-Datenbank 11.5 ein. Selektion des Homo sapiens in Organismen. Klicken Sie auf "Suchen" und dann auf "Weiter".

Sobald die Ergebnisse verfügbar sind, aktivieren Sie die Anzahl der getrennten Knoten im Netzwerk in den erweiterten Einstellungen. Legen Sie die höchste Konfidenz auf 0,900 in der minimal erforderlichen Interaktionsbewertung fest. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Aktualisieren.

Klicken Sie in der Titelleiste auf Exporte und laden Sie den kurzen Tabellentext des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks im PNG- und TSV-Format herunter. Um ein Zielnetzwerk für Arzneimittelkomponenten zu erstellen, öffnen Sie Cytoscape 3.9.1 und importieren Sie die Datei im TSV-Format. Optimieren Sie die Farbe, die Schriftart und die Seite der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der Systemsteuerung.

Verwenden Sie die Funktion "Netzwerk analysieren" für die Analyse der Netzwerktopologie, um Hub-Gene in CytoHubba in Cytoscape zu erhalten und das Zielkrankheitsnetzwerk für den Wirkstoff zu erstellen. Um eine GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse durchzuführen, öffnen Sie die Bioinformatik-Ressourcen von David. Klicken Sie auf Analyse starten und fügen Sie die Zielliste in das linke Dialogfeld ein.

Wählen Sie das offizielle Gensymbol bei der Auswahl des Identifikators und den Homo sapiens bei der Auswahl der Spezies aus. Aktivieren Sie dann die Genliste im Listentyp und klicken Sie auf Liste senden. Klicken Sie als Nächstes auf Functional Annotation Clustering unter Analysieren der obigen Genliste mit einem der David-Werkzeuge.

Aktivieren Sie den GO-Term BP direkt, den GO-Term CC direkt, den GO-Term MF direkt und die Genontologie für die GO-Funktionsanreicherungsanalyse. Aktivieren Sie den KEGG-Pfad in Pfaden für die KEGG-Pfadanreicherungsanalyse. Klicken Sie auf das funktionale Beschriftungsdiagramm, um die Ergebnisse anzuzeigen.

Verwenden Sie die SIMCA P-Software für die multivariate statistische Analyse der Integralwerte, die aus den LCMS-Ergebnissen gewonnen wurden. Verwenden Sie die orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLSDA) für die mittleren Mittelpunktdaten und die Modellierung von Stichprobenklassen. Betrachten Sie nach dem OPLSDA-Test die Metaboliten mit integraler variabler Bedeutung in der Projektion oder VIP-Werte von mehr als eins und einem P-Wert von weniger als 0,05 aus dem T-Test des Schülers als potenzielle differentielle Metaboliten.

Identifizieren Sie die gestörten Metaboliten und Stoffwechselwege anhand offener Datenbankquellen, einschließlich menschlicher Metabolome, Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome und MetaboAnalyst 5.0. Visualisieren Sie die Ergebnisansichten von MetaboAnalyst 5.0 und der Wukong-Plattform. Laden Sie die ausgewählte 3D-Struktur der FP-Inhaltsstoffe aus der Pharmakologie-Datenbank für Systeme der traditionellen chinesischen Medizin herunter.

Suchen Sie die Namen der Inhaltsstoffe im Suchfeld für chemische Namen und laden Sie die entsprechenden 3D-Strukturdateien im MOL-Zwei-Format herunter. Laden Sie als Nächstes die Kristallstrukturen der wichtigsten Targets aus der Alpha-Faltungsproteinstrukturdatenbank herunter. Suchen Sie die Zielnamen im Suchfeld und laden Sie die entsprechenden Kristallstrukturdateien im PDB-Format herunter.

Importieren Sie dann Zutaten und Zielstrukturdateien in die AutoDock Tools-Software. Klicken Sie auf Wasser bearbeiten und löschen, um Wassermoleküle zu löschen. Klicken Sie dann auf Wasserstoff bearbeiten und hinzufügen, um Wasserstoff hinzuzufügen.

Legen Sie die Inhaltsstoffe als Liganden fest und führen Sie ein blindes Andocken durch, indem Sie die gesamten Ziele als Rezeptor auswählen. Geben Sie einen Wert in das Feld hinter der Mitte und der Größe ein, um den neu entwickelten Raum anzupassen, so dass der Ligand und der Rezeptor vollständig umschlossen werden können. Speichern Sie die Liganden- und Rezeptordateien im PDBQT-Format.

Verwenden Sie AutoDock Vina, um molekulares Docking durchzuführen. Setzen Sie den Rezeptorbalken auf den Namen des Rezeptorpunkts PDBQT und den Ligandenbalken auf den Namen des Ligandenpunkts PDBQT. Ermitteln Sie die optimale Position für die Bindung des Liganden an den Rezeptor und zeichnen Sie den Wert der Bindungsenergie an der optimalen Position auf.

Importieren Sie die Docking-Dateien in den Protein-Liganden-Interaktionsprofiler, um das visuelle Systemmodell zu erhalten. Laden Sie die Modelldateien im PSC-Format herunter und importieren Sie sie in die PyMOL-Software, um weitere Visualisierungen zu erstellen. Durch Netzwerkpharmakologie wurden insgesamt 19 Inhaltsstoffe und 134 inhaltsstoffbezogene Ziele von FP gefunden.

Nach dem Abgleich der FP-bezogenen Targets mit den Hyperlipidämie-bezogenen Targets wurden 62 als potenzielle Ziele für FP gegen Hyperlipidämie identifiziert. Das Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk wurde von String und Cytoscape konstruiert. Die Ergebnisse der GO-Anreicherung deuten darauf hin, dass die biologischen Prozesse und die molekulare Funktion von FP gegen Hyperlipidämie hauptsächlich mit der Genexpression und der Proteinbindung zusammenhängen.

Die KEGG-Anreicherung bewies, dass FP in den Fettstoffwechsel und die Atherosklerose eingreifen kann. Die OPLSDA-Analyse wurde verwendet, um die Metabolitentrennung zwischen den Gruppen der Negativkontrolle, der fettreichen Diät und der Hochdosis-FP-Mäuse zu untersuchen, was zeigte, dass sich die gleichen Gruppenproben gruppierten und verschiedene Gruppenproben sich gut unterschieden. Insgesamt wurden 16 bzw. sechs Metaboliten als differentielle Metaboliten in FP identifiziert, die HFD-Mäuse im Plasma und in der Leber betreffen.

Heatmaps, die von MetaboAnalyst 5.0 erstellt wurden, zeigten, dass alle differentiellen Metaboliten im Plasma und in der Leber in der fettreichen Diätgruppe verändert waren und die meisten in der FP-Gruppe umgekehrt waren. Der Tryptophan-Stoffwechsel war im Plasma signifikant beeinflusst. Der Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel war in der Leber signifikant betroffen.

Differentielle Metaboliten wurden in das MetScape-Plugin in Cytoscape importiert und mit den in der Netzwerkpharmakologie identifizierten Hub-Genen abgeglichen, um die Gennetzwerke des Reaktionsenzyms zu sammeln. Darüber hinaus wurde ein Netzwerk von Metaboliten aufgebaut, das auf die Inhaltsstoffe abzielt. Molekulares Docking wurde verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen den aktiven Zentren der Liganden zu analysieren.

Diese Technologie ist eine umfassende Methode, um die pharmakologischen genetischen Inhaltsstoffe der traditionellen chinesischen Medizin zu starten. Es bietet eine neue Idee für die Forschung mit Medikamenten mit vollständigen Inhaltsstoffen.