Name: Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung globaler Histonmodifikationen in isolierten Mikroglia des Mausgehirns mittels intranukleärer Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht schnelle epigenetische Hochdurchsatzanalysen.

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Vielen Dank an Yanyang Bai für die Hilfe beim Immunoblot in Abbildung 5. Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 to AC] unterstützt; Kanadische Forschungsrat für Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaften [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 bis AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 bis AC] und die Brain Canada Foundation [AWD-023132 bis AC]; Aborigine-Graduiertenstipendium der Universität von British Columbia (6481 bis MT); British Columbia Graduiertenstipendium (6768 bis MT); Kanadische Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 bis JK); Vierjähriges Promotionsstipendium der University of British Columbia (6569 für JK). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datenerhebung und -analyse, bei der Entscheidung über die Veröffentlichung oder bei der Vorbereitung des Manuskripts.

Quantifizierung der Histonmodifikation des Mausgehirns mittels Durchflusszytometrie

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Flow+Cytometry+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li>
<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
<li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+in+the+brain%3A+measuring+global+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li>
<li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRvix%22%5BJournal%5D)">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die quantitative Bestimmung der globalen HPTM-Spiegel mittels Durchflusszytometrie. Obwohl dieses Protokoll eine neuartige Methode darstellt, haben frühere Studien die quantitative Bewertung von Proteinen mit einem ähnlichen Ansatz durchgeführt26. Zu den bisherigen Methoden, die zur Bestimmung des globalen HPTM-Niveaus verwendet wurden, gehören die Immunhistochemie und der Western Blot 16,17,19,20. Die vorgestellte auf Durchflusszytometrie basierende Methode ist eine leicht quantifizierbare Methode, während Western Blot und Immunhistochemie semi-quantitativ sind und einen geringeren Durchsatz aufweisen. Western Blot beruht auf Zelllyse und erfordert daher sowohl eine Proteinnormalisierung als auch ein Beladungskontrollprotein, von dem angenommen wird, dass es durch die experimentelle Bedingungunverändert bleibt 27. Die Immunhistochemie ist semiquantitativ und hat einen sehr geringen Durchsatz, da es schwierig ist, die Proteinmenge quantitativ zu bestimmen, ohne sie auf Einzelzellebene zu untersuchen16. In ähnlicher Weise ist die Verwendung der Durchflusszytometrie-Methode für die isolierten Mikroglia aufgrund der begrenzten Ausbeute von Vorteil, da Western Blot einen viel größeren Proteininput erfordert19. Die niedrigen Anforderungen an die Zellzahl ermöglichen es, mehrere Färbepanels vom selben Tier zu verwenden.
Wie bei jeder anderen Methode gibt es jedoch auch bei dieser Technik Einschränkungen, einschließlich der Kosten und der Verfügbarkeit von Antikörpern, da nicht alle Antikörper in einer Durchflusszytometrie gut funktionieren. Darüber hinaus ist die erforderliche Antikörperkonzentration im Vergleich zum Immunoblot viel höher. Während das Multiplexing die Verwendung mehrerer Antikörper auf derselben Zellgruppe ermöglicht, können die Zellen nach der Analyse nicht von dem Antikörper befreit werden, wodurch die Zellverwendung auf einen Antikörper pro Antikörperspezies beschränkt wird. Dies unterscheidet sich vom Immunoblot, bei dem derselbe Blot wiederholt verwendet werden kann. Abhängig von der Verfügbarkeit von Antikörpern und der Anzahl der Nachweiskanäle auf einem Zytometer wäre es jedoch möglich, bis zu einem Dutzend Markierungen gleichzeitig zu untersuchen.
Die derzeitige Methode erfasst nur globale Proteinexpressionsniveaus und nicht die spezifische genomische Lokalisation, und Änderungen der globalen Niveaus spiegeln möglicherweise keine Veränderungen an einzelnen genomischen Loci wider. In ähnlicher Weise bedeutet das Fehlen von Veränderungen in den globalen Konzentrationen nicht, dass keine genomischen Loci Veränderungen erfahren, sondern lediglich, dass die globalen Veränderungen in der Summe keine Unterschiede zwischen den Behandlungen ergeben. Daher soll diese Technik als Screening verwendet werden, um HPTMs zu identifizieren, die für die Genomanalyse von Interesse sind. Darüber hinaus erlaubt diese Methode keinen Vergleich zwischen verschiedenen Proteinmarkierungen, es sei denn, sie wird als Faltungsänderung zur Kontrolle bewertet. Daher ist dies im Vergleich zu einer standardmäßigen kurvenbasierten Methode wie dem ELISA zur Proteinbestimmung begrenzt.
Das vorgestellte Protokoll bietet eine Strategie zur Isolierung lebender Hirnmikroglia. Dieses Protokoll basiert auf der Expression des P2RY12-Proteins für die Isolierung von Mikroglia. P2RY12 ist jedoch ein homöostatischer Marker in Mikroglia und kann in Krankheitsmodellen wie 5XFAD22 herunterreguliert werden. Achten Sie daher bei der Verwendung eines Krankheitsmodelltieres darauf, andere Markerproteine wie TMEM119, CD11b oder CD45 zu wählen, um die Isolierung von Mikroglia23 zu unterstützen. In ähnlicher Weise stellen wir dieses Protokoll als Isolierung vom Hippocampus und/oder dem Kortex dar. Dieses Protokoll würde funktionieren, um Mikroglia aus anderen Gehirnregionen, einschließlich Regionen der weißen Substanz, zu isolieren, jedoch können mehrere Tiere erforderlich sein, um je nach Größe der interessierenden Regionen genügend Mikroglia zu erhalten.
Das vorgestellte Protokoll kann lebende Gehirnmikroglia robust isolieren, aber es gibt mehrere Schritte, die im Folgenden beschrieben werden, in der Isolationsphase, die die Zellausbeute verringern können, wenn sie falsch durchgeführt werden.
Perfusionen für dieses Protokoll führen zu einem höheren Prozentsatz an Mikroglia im immunangereicherten Fragment, was die Zeit am Sortierer verkürzt. Eine Perfusion ist jedoch nicht erforderlich, und bei Bedarf können andere Methoden der Euthanasie angewendet werden.
Bei der Isolierung von Mikroglia sollte das Myelin vollständig entfernt werden. Durchflusszytometer sind darauf angewiesen, dass Zellen in der Lage sind, sich in einem schnellen Tempo durch enge Schläuche zu bewegen. Aufgrund seiner Viskosität und seiner Neigung zum Verklumpen verursacht Myelin Probleme mit Zytometern, die oft zu Verstopfungen führen, die sowohl das Gerät beschädigen als auch die Probe zerstören können, was die Ausbeute drastisch reduziert. Seien Sie vorsichtig, um das gesamte Myelin während der Entnahme von immunangereicherten Fragmenten zu entfernen, um Probleme stromabwärts zu vermeiden.
Plattenfärbung versus Röhrchenfärbung: In diesem Protokoll haben wir zwei Optionen für die Färbung von Zellen in 1,5-ml-Röhrchen oder einer 96-Well-Platte beschrieben. Der Anwendungsfall hängt jeweils vom Experiment ab. Im Allgemeinen ist die Röhrchenfärbung jedoch ein geringeres Risiko, die Ausbeute zu beeinträchtigen, als die Plattenfärbung, da das Flicken bei falscher Durchführung den Verlust von Zellen riskiert. Die Plattenfärbung ist viel schneller, da das Absaugen des Überstandes für jedes Röhrchen zeitaufwändig ist. Verwenden Sie vor der Fixierung (zum Sortieren usw.) eine Röhrchenfärbung, um die Ausbeute zu maximieren und das Verlustrisiko zu verringern. Bei der HPTM-Analyse ist das Pellet jedoch stabiler, sobald die Zellen für die intranukleäre Färbung fixiert sind, und es besteht ein geringeres Verlustrisiko beim Schnippen.
Etablierung des diskontinuierlichen Dichtegradienten: Bei der Etablierung der Schichtung ist es wichtig, die Schichten richtig einzurichten, um die immunangereicherte Fraktion zu erhalten. Wenn die Schichten gestört oder vermischt sind und trüb erscheinen, sortieren sich die Zellen nicht an ihren gewünschten Ort, und es wird schwierig sein, die immunangereicherte Zellfraktion zu erhalten. Wenn dies der Fall ist, schleudern Sie mit dem Dichtemedium, um das Myelin zu entfernen, und sammeln Sie dann die gesamten verbleibenden Fraktionen, verdünnen Sie mit 3 ml FACS-Puffer auf 1 ml Dichtemedium und mischen Sie gut (dies erfordert mehrere Röhrchen). Bei 500 x g 10 min bei eingeschalteter Bremse schleudern. Verwerfen Sie den Überstand und lassen Sie nur ~300 μl Lösung übrig. Entnehmen Sie die gesamte Probe und färben Sie sie ein. Dies führt zu reduzierten Sortierprozentsätzen und einer höheren Zeit, die am Zytometer verbracht wird, aber die Ausbeute kann immer noch vergleichbar sein.
Bei der Verwendung der Isolationsmethode ist es von Vorteil, Zellen für RNA und für die HPTM-Auswertung aus demselben Mäusegehirn sammeln zu können. In dieser Situation können die Zellen nach dem Sortieren der lebenden Mikroglia geteilt werden, um einen Teil für die RNA-Bewertung (die Mindestanzahl der Zellen, um eine anständige RNA-Ausbeute zu erhalten, beträgt 75.000 Zellen) und einen Teil für die weitere Durchflusszytometrie-Analyse (mindestens 10.000 Zellen pro Vertiefung für eine gute Bestimmung des MFI) zuzuweisen. In diesem Fall ist eine Durchflusszytometer-Sortierung erforderlich. Wenn die Zellen jedoch nur für die HPTM-Analyse verwendet werden sollen, ist keine Sortierung erforderlich, und die Immunfraktion kann mit dem P2RY12-Antikörper und dem HPTM-Antikörper gefärbt werden. Das Gating am Zytometer kann dann für P2RY12+-Mikroglia eingestellt werden, wie es bei der Durchflusssortierung der Fall wäre, um nur das HPTM-Signal innerhalb der Mikroglia zu analysieren. Durch den Wegfall der Sortierung kann das Protokoll schneller und kostengünstiger werden. Darüber hinaus ist es bei der Bewertung von HPTMs aus kultivierten Zellen ausreichend, mit dem Färbeprotokoll zu beginnen, und es sind keine Zellmarker-Antikörper erforderlich, wie in Abbildung 6 gezeigt. Das HPTM-Evaluierungsprotokoll kann für viele Zelltypen verwendet werden, einschließlich kultivierter, primärer und IPSC-abgeleiteter Zellen.
Während wir nur zwei mögliche Anwendungen von Mikroglia nach der Isolierung vorgestellt haben, gibt es viele andere, darunter epigenetische Techniken wie ChIP, CUT&Tag und CUT&RUN. Im Falle genomischer epigenetischer Techniken, bei denen die Charakterisierung von Veränderungen an bestimmten Loci von Interesse ist, sind spezifische Inhibitoren für Schreiber und Radierer von Chromatinmarkierungen11 zu wählen, die auf die Experimente zugeschnitten sind, um sicherzustellen, dass alle mikrogliaartigen epigenetischen Modifikationen, die profiliert werden, keine technischen Artefakte aus irgendwelchen Schritten des Isolierungsverfahrens, wie z. B. der enzymatischen Verdauung, sind. Bei der Beurteilung von Veränderungen der globalen Niveaus epigenetischer Markierungen, wie z. B. mit Hilfe der quantitativen Durchflusszytometrie, ist nicht zu erwarten, dass verfahrensbedingte Veränderungen so groß sind, dass sie auf globaler Ebene erkannt werden.
Insgesamt stellen die diskutierten Methoden eine neuartige Einzelzellmethode zur Quantifizierung globaler Konzentrationen von Histonmodifikationen und anderen epigenetischen Veränderungen mittels Durchflusszytometrie dar. Wir konnten zeigen, dass diese Methode ausreichend sensitiv ist, um globale Veränderungen des Enhancer-Markers H3K27ac in Mikroglia als Reaktion auf LPS in vivo zu detektieren. Dies stimmt mit der früheren ChIP-Sequenzierung von H3K27ac nach LPS-Stimulation überein, die einen dramatischen Umbau von Enhancern zeigte, die auf LPS28 ansprechen. Die Anwendung dieser Methode wird es ermöglichen, globale epigenetische Veränderungen über verschiedene Gehirnzelltypen hinweg in Entwicklung und Krankheit zu untersuchen.

Epigenetik ist die Untersuchung der Mechanismen, die die Genexpression regulieren, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern. Die epigenetische Regulation der Genexpression ist innerhalb von Zellen dynamisch und kann schnelle und koordinierte Reaktionen auf verschiedene Umweltreize ermöglichen. Die dynamische Regulation erfolgt zum Teil aufgrund von Veränderungen in der Chromatinstruktur auf der Ebene des Nukleosoms, das aus Histonproteinen (H2A, H2B, H3, H4) besteht, die zu einem Oktamerkern zusammengesetzt sind, der von DNA1 eng umwickelt ist. Die Wechselwirkungen zwischen den Histonproteinen und der DNA können die Zugänglichkeit der DNA zur Transkriptionsmaschinerie steuern, die letztendlich die Genexpression und andere Aspekte der Chromatinbiologie kontrollieren kann2. Histonproteine haben unstrukturierte Schwänze, die positiv geladene Reste aufweisen, die elektrostatische Wechselwirkungen mit dem negativ geladenen DNA-Rückgrat eingehen. Diese Wechselwirkungen führen zu einer dichten Packung der DNA und einer verminderten Zugänglichkeit der DNA. Kovalente Modifikationen an den Histonschwänzen, sogenannte posttranslationale Histonmodifikationen (HPTMs), können diese Wechselwirkungen regulieren 3,4. Zu den am besten charakterisierten HPTMs gehören die Histonschwanz-Acetylierung und -Methylierung, die die Affinität der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Histonschwänzen und der DNA verändern kann, was zu einer unterschiedlichen Zugänglichkeit der zugrunde liegenden DNA und zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren führt, die diese HPTMs an bestimmten Stellen erkennen. HPTMs werden durch drei wichtige Klassen von Enzymen reguliert, die als Reader bezeichnet werden: Reader, die erkennen, Schreiber, die sich ablagern, und Radierer, die HPTMs entfernen. Daher kann die Rekrutierung oder Auflösung von Lese-, Schreib- oder Löschenzymen letztendlich die Landschaft von HPTMs verändern und die Struktur und Funktion des Chromatins steuern, was ihre Regulation und ihr Auslesen für das Verständnis der Zellbiologie und -funktion unerlässlich macht 3,4.
Die Zellen im Zentralnervensystem (ZNS) sind epigenetisch flexibel, da sie ihr Transkriptom verändern, um sich an Umweltreize anzupassen. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass Veränderungen im Epigenom, wie DNA-Methylierung, nicht-kodierende RNAs und HPTMs, eine wesentliche Rolle bei der Gedächtnisbildung und der synaptischen Funktion spielen5. Die Störung der HPTM-Dynamik durch Manipulation der relevanten Lese-, Schreib- oder Radiergummier kann assoziatives Lernen und langfristige Potenzierung blockieren oder verstärken 6,7,8. Mikroglia, die residenten Immunzellen des ZNS, regulieren ihr Transkriptom als Reaktion auf Immunstimulation schnell durch dynamische Veränderungen in ihrem Epigenom 9,10,11. Dieses hohe Maß an Anpassung an ihre lokale Gehirnumgebung macht es schwierig, sie in einem isolierten Kontext zu untersuchen, da Studien gezeigt haben, dass das Epigenom und das Transkriptom von Mikroglia bereits nach wenigen Stunden in Nährmedien nach der Entfernung aus der Gehirnumgebung verändert werden11. Da Mikroglia nur 10 % der Gehirnzellen ausmachen, mangelt es den Messungen, die Veränderungen auf der Ebene des gesamten Gewebes untersuchen, an Sensitivität und Spezifität12,13. Daher müssen Mikroglia schnell isoliert werden, um die epigenetischen Veränderungen wie den HPTM-Spiegel ex vivo zu untersuchen.
Zu den Methoden, die üblicherweise zur Untersuchung von HPTMs verwendet werden, gehören die Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq) und die Spaltung unter Zielstrukturen und die Tagmentierungssequenzierung (CUT&Tag-seq)4. Obwohl diese Techniken sehr spezifisch für ein einzelnes HPTM sind und das Vorhandensein von HPTMs in einem bestimmten genomischen Kontext bestimmen können, können sie nur eines der vielen möglichen HPTMs innerhalb eines einzigen Experiments untersuchen11,14 Daher ist es sehr wertvoll, vor der Durchführung solcher Experimente, die einen erheblichen Zeit- und Geldaufwand erfordern, die Liste der potenziell interessanten HPTM für weitere Untersuchungen einzugrenzen, indem zunächst die Veränderungen in der globalen HPTM-Konzentrationen. Die beiden Hauptansätze zur Untersuchung der globalen HPTM-Spiegel sind die Immunhistochemie und die Western-Blot-Analyse, aber beide Ansätze sind nur semi-quantitativ, haben einen geringen Durchsatz und erfordern eine große Anzahl von Gewebeschnitten oder isolierten Zellen15,16. Unser Ziel war es daher, eine hochempfindliche, quantitative Methode zu entwickeln, mit der die globalen HPTM-Konzentrationen schnell und auf Einzelzellebene untersucht werden können.
Das vorgestellte Protokoll ermöglicht den schnellen Nachweis globaler HPTM-Spiegel mittels intranukleärer Durchflusszytometrie. Frühere Studien an Krebszellen haben die Bedeutung der Untersuchung globaler Ebenen aus klinischer Sicht gerechtfertigt17,18. Es ist auch üblich, dass Studien globale Konzentrationen als Screening-Methode verwenden, bevor die genomische Lokalisation bestimmter HPTMs von Interesse beurteiltwird 19,20. Für Mikroglia ist die Bestimmung der globalen Konzentrationen nach der Isolierung aufgrund der geringen Zellausbeute eine Herausforderung. Pan et al. präsentieren globale HPTM-Spiegel aus isolierten Mikroglia, in denen Mikroglia von drei Tieren gepoolt wurden, um den Nachweis des Proteinspiegels durch Western Blot19 zu ermöglichen. Mit unserem Protokoll sind wir in der Lage, globale Veränderungen mit viel geringerem Zelleintrag zu erkennen, was das Screening mehrerer Markierungen pro Tier ermöglicht und die Notwendigkeit eliminiert, Proben zu poolen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum schnellen Nachweis von HPTM-Spiegeln mittels quantitativer intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia. Während wir uns der Kürze halber speziell auf die HPTM-Quantifizierung konzentrieren, kann dieses Protokoll auf die gleiche Weise verwendet werden, um die globalen Konzentrationen von Lese-, Schreib- und Radiergummi-Enzymen zu quantifizieren. Das Protokoll besteht aus zwei Teilen: erstens der Isolierungsmethode für Mikroglia und zweitens der auf Durchflusszytometrie basierenden Methode zur Bestimmung des HPTM-Spiegels. Die Isolierungsmethode liefert Zellen, die sowohl für die RNA-Isolierung als auch für die HPTM-Bewertung verwendet werden können, was die Bewertung der Genexpression und des HPTM-Spiegels aus derselben Probe ermöglicht. Darüber hinaus kann die Methode zur HPTM-Bewertung auf andere Zelltypen angewendet werden, wie im Protokoll angegeben.

<table><tbody><tr><td>0,5 m EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24-Well, klare, unbehandelte Platten</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 Well, klare Polystyrol-Mikroplatte, klarer runder Boden, unbehandelte Oberfläche</td><td>Corning</td><td>3788 Acetyl</td><td></td></tr><tr><td>Histon 3 K9 (C5B11)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>9649S</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>Acetyl Histon H4 K8 (2594)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>2594S</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>Acetyl-Histon H3 K27 (D5E4)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>8173S</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>Acetyl-Histon H3 Lys27 (MA523516)</td><td>Invitrogen</td><td>MA523516</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S Anti-Histon</td><td></td></tr><tr><td>H3 (Trimethyl K4) &nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Lactyl-Histon H4 (Lys 12) Kaninchen mAb</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>Verdünnung: 1:250</td></tr><tr><td>Anti-L-Lactyllysin Kaninchen pAb</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>Verdünnung: 1:250</td></tr><tr><td>Apc anti-P2RY12 Antikörper, Klon: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Cyto-Last Buffer</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid, steril</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Mouse AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>Verdünnung: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488</td><td>ABklonal</td><td>AS035</td><td>Verdünnung: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Verdünnung: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>Verdünnung: 1:500</td></tr><tr><td>Fisherbrand Einweg-Messpipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Einweg-PES-Filtereinheit, 250mL&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>H3K18ac Polyklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>720095</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X), kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>Histon 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>Verdünnung: 1:100</td></tr><tr><td>KONTES Dounce Tissue Grinder 125mm 7mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Lactyl-Histon H3 (Lys 18) Kaninchen mAb</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>Verdünnung: 1:250</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads Kompensationsperlen</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>PDS Kit, Papain-Fläschchen - Worthington Biochemisches</td><td>Cedarlan-LK003178</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>VWR</td><td></td><td></td>RC57004</tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Rainbow Fluoreszierende Partikel, 1 Peak (3,0-3,4 μM - Mid Range Intensity</td><td>BioLegend</td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden und Kappen, 5 mL</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triptolid</td><td>New England Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>True Nuclear Transcription Factor Buffer Set</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (Anti-Maus-CD16/32) Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixierbares Lebensfähigkeitsset</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung globaler posttranslationaler histonmodifikationen mittels intranukleärer durchflusszytometrie in isolierten mikroglia des mausgehirns

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Die Kontrolle der Genexpression erfolgt teilweise durch Modifikationen der Chromatinstruktur, einschließlich der Hinzufügung und Entfernung posttranslationaler Modifikationen an Histonschwänzen. Posttranslationale Histonmodifikationen (HPTMs) können entweder die Genexpression oder die Repression erleichtern. Zum Beispiel neutralisiert die Acetylierung von Histonschwanz-Lysinresten die positive Ladung und reduziert die Wechselwirkungen zwischen dem Schwanz und der negativ geladenen DNA. Die Abnahme der Histonschwanz-DNA-Wechselwirkungen führt zu einer erhöhten Zugänglichkeit der zugrunde liegenden DNA, was einen verbesserten Zugang zu Transkriptionsfaktoren ermöglicht. Die Acetylierungsmarkierung dient auch als Erkennungsstelle für Bromodomänen-haltige Transkriptionsaktivatoren, die zusammen zu einer erhöhten Genexpression führen. Histonmarkierungen können während der Zelldifferenzierung und als Reaktion auf verschiedene zelluläre Umgebungen und Reize dynamisch reguliert werden. Während Next-Generation-Sequencing-Ansätze begonnen haben, genomische Orte für einzelne Histonmodifikationen zu charakterisieren, kann nur eine Modifikation gleichzeitig untersucht werden. Angesichts der Tatsache, dass es Hunderte von verschiedenen HPTMs gibt, haben wir ein quantitatives Hochdurchsatzmaß für globale HPTMs entwickelt, das zum Screening von Histonmodifikationen verwendet werden kann, bevor umfangreichere Genomsequenzierungsansätze durchgeführt werden. Dieses Protokoll beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zum Nachweis globaler HPTMs und kann mit Zellen in Kultur oder isolierten Zellen aus In-vivo-Geweben durchgeführt werden. Wir präsentieren Beispieldaten von isolierten Mikroglia des Mäusegehirns, um die Sensitivität des Assays zum Nachweis globaler Verschiebungen in HPTMs als Reaktion auf einen bakteriellen Immunstimulus (Lipopolysaccharid) zu demonstrieren. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle und quantitative Bewertung von HPTMs und kann auf jeden transkriptionellen oder epigenetischen Regulator angewendet werden, der von einem Antikörper nachgewiesen werden kann.

Adulte Mäuse wurden transkardial perfundiert und für die Mikroglia-Isolierung geopfert. Die Mikroglia wurden auf Eis isoliert und mit P2RY12-APC und violetten 525 lebend toten Antikörpern gefärbt. Zellen, die positiv für P2RY12 und negativ für violette 525 lebende tote Färbung waren, wurden als lebende Mikroglia sortiert. Die durchschnittliche Ausbeute an Mikroglia aus einem präparierten Mäusegehirn betrug 1,28 x 105 ± 0,05 (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (REM), N=100). Es gibt keinen Unterschied in der Ausbeute von Mikroglia von weiblichen (1,25 x 105 ± 0,09 [Mittelwert ± SEM, N=46]) und männlichen (1,32 x 105 ± 0,07 [Mittelwert ± SEM, N=54]) Mäusen (t(98)=0,6365, p=0,526). Bei der Isolierung aus bestimmten Hirnregionen beträgt die durchschnittliche Ausbeute an Mikroglia aus Mauskortex 8,3 x 104 ± 0,08 (Mittelwert ± SEM, N=15) und aus dem Hippocampus der Maus beträgt 4,1 x 104 ± 0,02 (Mittelwert ± SEM, N=16). Wie erwartet, gibt es einen signifikanten Unterschied in der Ausbeute an Mikroglia aus jeder Hirnregion (F(2, 128)=25,25, P&lt;0,0001). Nach der Isolierung der Mikroglia wurde die RNA aus den isolierten Zellen mit einem Low-Input-RNA-Isolationskit extrahiert. Konstant lag der RNA-Integritäts-Score (RIN) über 9,0 (9,62 ± 0,05) und die durchschnittliche Ausbeute an RNA pro Zelle betrug 0,25 ± 0,01 pg (Mittelwert ± SEM, N=32; Ergänzungsdatei S2).
Adulten Mäusen wurde 24 Stunden vor der Tötung 1 mg/kg Lipopolysaccharid (LPS) intraperitoneal injiziert. Die Mäuse wurden transkardial mit HBSS perfundiert und Mikroglia aus dem gesamten Gehirn gemäß dem beschriebenen Protokoll isoliert (Abbildung 5A). Für jede Färbung wurden 20.000-30.000 Zellen jedem Antikörperpanel zugeordnet. Die globalen Konzentrationen der Histon-3-Lysin-27-Acetylierung (H3K27Ac) wurden in isolierten Mikroglia mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Bei männlichen und weiblichen Mäusen induzierte die LPS-Behandlung einen Anstieg von H3K27Ac, wenn der MFI innerhalb des Geschlechts normalisiert ist (t(6)=9,676, p&lt;0,0001; Abbildung 5B). Bei der Untersuchung der Histogramme für die gefärbten Zellen bleiben die Populationen normalverteilt mit ähnlicher Variation; Die Zellen sind jedoch auf erhöhte Fluoreszenz umgestiegen, was zu einem Anstieg des MFI führt (Abbildung 5C). Bei der Untersuchung von H3K9Ac in der gleichen Behandlung kommt es zu einem ähnlichen Anstieg von H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Abbildung 5D,E) ist jedoch die Faltungsänderung des LPS relativ zum PBS des H3K9Ac-Signals geringer als das des H3K27Ac-Signals.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Abbildung 5: Globale Veränderungen der Histonacetylierung in isolierten Mikroglia. (A) Mäusen werden 24 Stunden vor der Tötung intraperitoneal phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder 1 mg/kg Lipopolysaccharid (LPS) injiziert. Die Mikroglia werden aus der immunangereicherten Fraktion entnommen und für die Durchflusszytometrie und die Bewertung der globalen Histonmodifikation nach translationaler Modifikation fixiert. Die mediane Fluoreszenzintensität wird als Proxy für die Proteinexpression bestimmt. Erstellt mit BioRender.com. (B) Die globalen Konzentrationen von H3K27Ac stiegen als Reaktion auf die LPS-Behandlung an. Faltenwechsel zu PBS normalisiert innerhalb von Experiment und Sex. Unpaarter zweischwänziger t-Test, t(6)=9,676, p&lt;0,0001. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert ± SEM. N=8 Tiere; 2 pro Bedingung in 2 unabhängigen Experimenten. (C) Beispielhistogramme, die die Verschiebung der H3K27Ac-Fluoreszenzintensität darstellen. Modal stellt Histogramme von PBS-injizierten im Vergleich zu LPS-injizierten Mäusen dar. (D) Beispielhistogramme, die die Verschiebung der H3K9Ac-Fluoreszenzintensität darstellen. Modal stellt Histogramme von PBS-injizierten im Vergleich zu LPS-injizierten Mäusen dar. (E) Die globalen Konzentrationen von H3K9Ac stiegen als Reaktion auf die LPS-Behandlung an. Faltenwechsel zu PBS normalisiert innerhalb von Experiment und Sex. Unpaarter zweischwänziger t-Test, t(6)=7,299, p=0,0003. Das Balkendiagramm zeigt den Mittelwert ± SEM. N=8 Tiere; 2 pro Bedingung in 2 unabhängigen Experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um zu bestätigen, dass die beschriebene Methode mit anderen bisher verwendeten Methoden zur Quantifizierung der globalen Histonmodifikation vergleichbar ist, haben wir versucht, Immunoblot als Vergleichswerkzeug zu verwenden. Die Ausbeute der isolierten Mikroglia ist jedoch schlichtweg zu gering, um eine vernünftige Beurteilung zu ermöglichen. Daher haben wir kultivierte BV2-Zellen verwendet, um die intrazelluläre Durchflusszytometrie-Methode mit einem Western Blot (WB) zu vergleichen. BV2-Zellen wurden in kompletten Medien (DMEMF12, 10% FBS, 1x Penicillin/Streptamycin und 1x L-Glutamin) bei 37 °C, 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden mit 0,25 % Trypsin-EDTA durchgelassen und mit einer Dichte von 250.000 Zellen/Well plattiert und in reduziertem Serummedium (DMEM F12, 2 % FBS, 1x Penicillin/Streptamycin und 1x L-Glutamin) behandelt und 12 h lang bei 37 °C, 5 %CO2 behandelt. Die Zellen wurden 24 h lang mit 25 ng/ml LPS behandelt, bevor sie wie oben beschrieben fixiert oder mit einem WB-Lysepuffer lysierten. Das Signal von H3K27Ac wurde mit beiden Methoden durchgeführt, wobei GAPDH als Ladekontrolle für WB verwendet wurde. Für jede Gruppe wurde eine Analyse der normalisierten Fluoreszenzintensität im Vergleich zur PBS-Kontrolle ermittelt (Abbildung 6A). Bei der Untersuchung der Änderung des normalisierten H3K27Ac-Signals durch WB gab es einen 1,527-fachen Anstieg des LPS-behandelten Zustands im Vergleich zurH2O-Kontrolle, der durch den ungepaarten t-Test als signifikant bestimmt wurde (t=3,024, df=5; p=0,0293). Bei der Untersuchung der Veränderung mittels Durchflusszytometrie zeigte sich eine 1,482-fache Zunahme des LPS-behandelten Zustandes, die als signifikant bestimmt wurde (t=7,843, df=10; p&lt;0,0001). Mit Hilfe einer 2-Wege-ANOVA zum Vergleich der Methoden wurde ein signifikanter Effekt der Behandlung (F(1,15)=45,21,p&lt;0,0001) festgestellt, nicht jedoch der Methode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) oder der Interaktion (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Darüber hinaus verifizieren wir hier, dass es sowohl durch Western Blot als auch durch Durchflusszytometrie keine Veränderung der Histon-H3-Spiegel gibt, da die 2-Wege-ANOVA keinen signifikanten Effekt der LPS-Behandlung (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), der Methode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) oder der Interaktion (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Abbildung 6B). Beispielhafte Blots und Histogrammverschiebungen für diese Daten sind ebenfalls dargestellt (Abbildung 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Abbildung 6: Methodenvergleich zur Quantifizierung der globalen Änderung der Histonmodifikation zwischen Durchflusszytometrie und Western Blot. (A) BV2-Zellen werden vor der Analyse 24 h lang mit 25 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) oderH2Obehandelt. Die Fluoreszenzintensität von H3K27Ac wird sowohl für die Durchflusszytometrie als auch für den Western Blot als Faltenänderung der Vehikelkontrolle, der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS), dargestellt. Die 2-Wege-ANOVA zeigte einen signifikanten Effekt der LPS-Behandlung (F(1,15)=45,21, p&lt;0,0001), aber nicht die Methode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) oder die Interaktion (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Die Tukey-Korrektur für das Testen mehrerer Hypothesen wurde auf die Residuen angewendet. * präsentiert 0,0332, ** präsentiert 0,0021. (B) Die Fluoreszenzintensität für Histon H3 wird sowohl für die Durchflusszytometrie als auch für den Western Blot als Faltenänderung zu PBS dargestellt. Die 2-Wege-ANOVA ergab keinen signifikanten Effekt der LPS-Behandlung (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) oder der Methode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) oder der Interaktion (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Beispielhafte Blots und (D) Durchflusszytometrie-Verschiebungen werden dargestellt. Die Größe des Histogramms wird basierend auf der Anzahl der Zellen, die bei der Fluoreszenzintensität des Modus vorhanden sind, auf Prozent normalisiert. Das Balkendiagramm stellt das mittlere SEM dar. n=2 unabhängige Experimente, 2 pro Bedingung pro Experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass diese Technik verwendet werden kann, um die globalen HPTM-Konzentrationen in isolierten Mikroglia quantitativ zu bestimmen. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Methode mit früheren Techniken vergleichbar ist, jedoch viel geringere Zelleingaben erfordert. Darüber hinaus kann die vorliegende Technik, auch wenn sie nicht gezeigt wurde, mit einer angemessenen Kompensation mit mehreren Antikörpern auf demselben Panel verwendet werden, um verschiedene HPTMs zu bewerten.
Ergänzungsdatei S1: Beispiel-Analysedateien. Diese Datei enthält eine WSP-Analysedatei und 7 FCS-Dateien, darunter die keine Färbung, P2RY12FMO, 568FMO, zwei PBS-behandelte Tiere und zwei LPS-behandelte Tiere, die mit H3K27Ac gefärbt wurden. Der Zweck dieser Datei besteht darin, die Analyse und das Gating eines Experiments zu demonstrieren, das darstellen könnte, wie ein erfolgreiches Experiment aussieht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei S2: Isolationsdaten. Die enthaltene Datei enthält die relevanten Daten nach der Mikroglia-Sortierung, die die Mikroglia- und RNA-Ausbeute aus dem beschriebenen Protokoll enthalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>GESCHLOSSENE BEVÖLKERUNG</td>
			<td>Häufigkeit der übergeordneten</td>
			<td>Häufigkeit der Gesamtanzahl</td>
			<td>Zählen</td>
		</tr><tr><td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2&gt;S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ &gt; APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Das Beispiel für ein Probenherkunftsdiagramm zeigt den Prozentsatz und die Ereigniszahlen, die für einen genauen Proteinnachweis erforderlich sind.

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung globaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Hirnmikroglia. Die Arbeit enthält auch das Mikroglia-Isolationsprotokoll, das für die Datenerhebung verwendet wurde.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, die grundlegenden regulatorischen Mechanismen zu verstehen, die die Genexpression im Gehirn steuern, und wir sind besonders daran interessiert zu verstehen, wie die Störung dieser Mechanismen zu neurologischen Entwicklungs- und neuropsychiatrischen Erkrankungen beiträgt. Wir konzentrieren uns darauf, zu verstehen, wie genetische und umweltbedingte Risikofaktoren zusammenwirken, um die Zellfunktion zu verändern und Verhaltensstörungen hervorzurufen. Dieses Protokoll umfasst Methoden für das Hochdurchsatz-Screening von Histonmodifikationen in isolierten Mikroglia, die es uns ermöglichen, Dutzende verschiedener epigenetischer Modifikationen zu screenen, bevor wir uns für die Hochdurchsatz-Sequenzierung und funktionelle Folgestudien entscheiden.Unser Protokoll liefert Messungen der globalen Histo-Modifikationen, ähnlich wie in der westlichen Handlung. Unsere Technik ist jedoch sowohl schneller, benötigt weniger Eingabezellen, ist quantitativer und kann gemultiplext werden.

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

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Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

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Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

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Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns (Video) | JoVE Journal

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

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