Verwendung von Referenzreagenzien zur Bestätigung der Robustheit von Zytokin-Freisetzungsassays für die Vorhersage der Sicherheit monoklonaler Antikörper

Die Sicherheitsprüfung neuer Medikamente ist von entscheidender Bedeutung, und dieses Protokoll beschreibt, wie validierte Standards verwendet werden, um die Reproduzierbarkeit, Robustheit und potenziellen Einschränkungen einer CRS-Plattform zu bewerten. Diese Technik wurde mit diesen Reagenzien in 11 verschiedenen Labors validiert und in einer internationalen Kooperationsstudie wurden ähnliche Reaktionsmuster beobachtet, wodurch die Bemühungen um Harmonisierung und Reproduzierbarkeit verbessert wurden. Die Anwendungen dieser Technik erstrecken sich auf verbesserte CRS-Risikotests neuartiger therapeutischer Antikörper und werden auch dazu beitragen, für das klinische Management potenzieller Nebenwirkungen gerüstet zu sein.

Diese Arbeit dient der Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Harmonisierung, und eine visuelle Demonstration erhöht die Chancen auf Reproduzierbarkeit. Beginnen Sie mit der Rekonstitution des Inhalts der Referenzreagenzampullen in einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser und lassen Sie eine Rehydratation von 5 bis 10 Minuten zu. Mischen Sie dann jede Antikörperlösung ordnungsgemäß, bevor Sie sie in ein steriles Röhrchen mit Deckel umfüllen.

Als nächstes verdünnen Sie jeden rekonstituierten Antikörper und Testantikörper auf 10 Mikrogramm pro Milliliter in sterilem PBS. Nehmen Sie eine sterile, nicht TC-behandelte 96-Well-Mikrotiterplatte aus Polypropylen mit U-Boden und geben Sie 100 Mikroliter der gewünschten verdünnten Antikörperlösung in die dafür vorgesehenen Vertiefungen der Platte. Inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei vier Grad Celsius, bevor Sie den Festphasenassay durchführen.

Nachdem Sie mindestens 30 Milliliter peripheres Vollblut in ein heparinisiertes Röhrchen gesammelt haben, drehen Sie es mehrmals um, um eine ordnungsgemäße Vermischung der Blutprobe mit Natriumheparin zu gewährleisten. 15 Milliliter der Vollblutprobe in einem separaten Röhrchen für die spätere Verwendung in der Vollblutuntersuchung in der wässrigen Phase beiseite stellen. Verdünnen Sie die restlichen 15 Milliliter Vollblut, indem Sie das gleiche Volumen entweder PBS oder serumfreies RPMI 1640-Medium hinzufügen.

Schichten Sie das verdünnte Blut vorsichtig auf 15 Milliliter eines Dichtegradientenmediums in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit einem Ausschwingrotor ohne Bremse und mit reduzierter Beschleunigung bei 500 G und Raumtemperatur für 20 Minuten, um das Blut in seine verschiedenen Bestandteile zu trennen. Nach der Zentrifugation trennt sich der Dichtegradient als oberste Plasmaschicht, gefolgt von einer dünnen Schicht aus Buffy-Hülle, die PBMCs enthält, und einer unteren Schicht, die Erythrozyten und polymorphkernige Granulozyten, einschließlich Neutrophilen und Eosinophilen, enthält.

Entfernen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht, gefolgt von der nächsten Schicht, um die PBMCs zu ernten. Zum Waschen resuspendieren Sie das geerntete Buffy Coat in 10 Millilitern PBS oder serumfreiem RPMI 1640-Medium. Zentrifugieren Sie das Röhrchen zunächst 10 Minuten lang bei 500 g, um die Zellen zu pelletieren.

Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang erneut. Suspendieren Sie dann das resultierende Pellet in zwei Millilitern vollständigem RPMI-Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die PBMC-Konzentration auf 1 Million Zellen pro Milliliter bei vollständiger RPMI ein.

Für den Vollblut-Zytokin-Freisetzungsassay in der wässrigen Phase nehmen Sie die zuvor beiseite gelegte Vollblutprobe, geben Sie 190 Mikroliter der Probe in die Vertiefungen einer 96-Well-Polystyrolplatte mit U-Boden, Wärmebehandlungsantikörper und Referenzreagenzien, die auf 100 Mikrogramm pro Milliliter in PBS vorverdünnt sind, und fügen Sie 10 Mikroliter des gewünschten verdünnten Antikörpers in die dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzu, die 190 Mikroliter Vollblut enthalten. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Für den Festphasen-PBMC-Zytokin-Freisetzungsassay besorgen Sie sich die zuvor vorbereiteten beschichteten Platten.

Verwerfen Sie die Antikörperlösung mit einer Mehrkanalpipette von den beschichteten Platten. Nachdem Sie ein Reagenzreservoir mit PBS gefüllt haben, waschen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern PBS, um ungebundene monoklonale Antikörper zu entfernen. Geben Sie 200 Mikroliter der zuvor vorbereiteten PBMC-Suspension in jede Vertiefung.

Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der 48-stündigen Inkubation mit monoklonalen Kontroll- und Testantikörpern zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 400 g. Sammeln Sie das zellkonditionierte Medium oder Plasma, ohne das Zellpellet zu stören.

Frieren Sie den gesammelten Überstand oder das Plasma bei minus 20 Grad Celsius ein. Die Ergebnisse des PBMC-Festphasenassays zeigten, dass die Positivkontrollantikörper im Vergleich zu den übereinstimmenden Isotypkontrollen signifikant hohe Zytokinspiegel induzierten. Es wurde auch beobachtet, dass der Anti-CD28-Superagonist eine signifikant stärkere Veränderung der Interleukin-2- oder IL-2-Freisetzung induzierte als sein passender Isotyp, während anti-CD3 und anti-CD52 zwar immer noch die IL-2-Expression induzierten, aber zu geringeren Veränderungen führten.

Im wässrigen Vollblut-Phasen-Assay war der Gehalt an nachweisbaren Zytokinen relativ geringer als im Festphasen-Assay, zeichnete sich jedoch durch eine höhere Empfindlichkeit gegenüber der Stimulation durch Anti-CD52 aus.