Effiziente Vaskularisierung von Nierenorganoiden durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen

In vitro kultivierte Nierenorganoide bleiben unausgereift, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Und diese Methode der intrazölomischen Transplantation induziert eine Vaskularisierung und fördert die Reifung der Organoide. Das Verfahren ist sehr effizient und ermöglicht die Transplantation und Analyse einer großen Anzahl von Organoiden in einem Experiment.

Nach der Herstellung von HIPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden und der Inkubation bilden die befruchteten Leghorn-Eier am dritten Tag der Inkubation ein Fenster in der Eierschale. Legen Sie ein kleines Stück transparentes Klebeband auf die spitze Spitze des Eies. Machen Sie ein kleines Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen.

Führen Sie als Nächstes eine 19-Gauge-Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze in einem 45-Grad-Winkel in das Loch ein. Saugen Sie zwei bis drei Milliliter Albumin aus der Eizelle ab, um den Embryo in die Eizelle zu senken. Decken Sie das Loch mit einem zweiten Stück transparentem Klebeband ab und legen Sie dann ein großes Stück transparentes Klebeband auf den Bleistift, der mit der nach oben zeigenden Seite des Eies markiert ist.

Machen Sie ein Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen. Schneiden Sie aus diesem Loch mit einer gebogenen Präparierschere ein kleines rundes Fenster in die Eierschale. Schauen Sie durch dieses Fenster, um den Embryo zu finden.

Vergrößern Sie dann das Fenster, um den Zugang zum Embryo zu optimieren. Entfernen Sie alle großen Stücke der Eierschale, die möglicherweise auf den Embryo gefallen sind, mit einer Pinzette. Entfernen Sie kleinere Stücke, indem Sie einige Tropfen DPBS mit Kalzium und Magnesium mit einer Plastiktransferpipette auf den Embryo geben und dann das DPBS mit der Eierschale in die Pipette aspirieren.

Geben Sie mit einer Transferpipette aus Kunststoff drei Tropfen DPBS, ergänzt mit 0,5 % Penicillin-Streptomycin, in die Eizelle. Verschließe das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück transparentem Klebeband, bevor du das Ei bis zum vierten Tag der Inkubation wieder in den Inkubator legst. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab.

Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop auf einen Gummihalter oder Eierkarton. Der Hühnerembryo befindet sich nun in den Hamburger-Hamilton-Stadien 23 bis 24 und liegt auf der linken Seite, wobei die rechte Seite dem Betrachter zugewandt ist. Lokalisieren Sie den rechten Flügel und die Beinknospe des Embryos, da das Zölom zwischen diesen beiden Gliedmaßenknospen beurteilt wird.

Schaffen Sie im Bereich zwischen rechtem Flügel und Beinknospe nacheinander eine Öffnung in der Vitellinmembran, dem Chorion und dem Amnion, indem Sie sie mit zwei Paaren Präparierzangen halten und vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen. Prüfen Sie, ob ein ungehinderter Zugang zur Zölomhöhle besteht. Fassen Sie den Rand der Körperwand zwischen Flügel und Gliedmaßenknospe vorsichtig mit einer Präparierzange und ziehen Sie sie leicht in Richtung des Betrachters.

Die Zölomhöhle muss gut sichtbar sein. Führen Sie vorsichtig ein stumpfes, aber schlankes Instrument in die Zölomhöhle ein. Legen Sie ein halbes Organoid in das Ei auf die Allantois mit einem Dura-Dissektor.

Fassen Sie mit einer Präparierzange vorsichtig den Rand der Körperwand und ziehen Sie ihn leicht in Richtung des Betrachters, um die Öffnung zum Coelum sichtbar zu machen. Bewegen Sie das Organoid vorsichtig mit einem stumpfen Wolframdraht und einem Mikroskalpellhalter in Richtung und durch die Öffnung in der Körperwand in das Coelum. Drücken Sie das Organoid leicht nach kranial, um es im Coelum zu platzieren.

Es ist jetzt direkt hinter der Flügelknospe sichtbar. Geben Sie drei Tropfen DPBS mit einer Transferpipette aus Kunststoff in das Ei. Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück transparentem Klebeband, bevor Sie das Ei bis zum 12. Tag der Inkubation wieder in den Inkubator legen.

Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop in einen Gummihalter. Beurteilen Sie die Gefäße und lokalisieren Sie die Venen, die sich durch ihre etwas hellere rote Farbe von den Arterien unterscheiden lassen.

Um den Zugang zum Gefäßsystem zu verbessern, vergrößern Sie das Fenster vorsichtig, indem Sie es mit einer gebogenen Präparierschere schneiden. Nachdem Sie die Vene ausgewählt haben, führen Sie die Spitze der Mikrokapillarnadel in einem Winkel von null bis 20 Grad in die Vene ein. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der Vene befindet, indem Sie die Spitze vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen.

Blasen Sie vorsichtig und gleichmäßig in das Injektionssystem, um das Agglutinin der Linse culinaris zu injizieren. Und legen Sie das Ei für 10 Minuten wieder in den Inkubator, damit es zirkulieren kann. Legen Sie das Ei in einen Gummihalter auf die Bank.

Schneiden Sie dann die Membranen, die den Embryo umgeben, mit einer gebogenen Präparierschere durch. Schöpfen Sie den Embryo mit einem perforierten Löffel aus dem Ei und enthaupten Sie den Embryo sofort mit einer Schere. Legen Sie den Körper des Embryos unter das Seziermikroskop in eine Petrischale.

Legen Sie den Embryo auf den Rücken in die Petrischale und spreizen Sie seine Gliedmaßen. Öffnen Sie die Bauchdecke des Embryos vorsichtig mit einer Pinzette entlang der Längsachse. Lokalisieren Sie das Organoid im Inneren des Embryos.

Das Organoid heftet sich am häufigsten an den rechten Leberlappen, entweder an der Coddle-Spitze oder kranial, direkt unter dem Brustkorb. Es ist also ratsam, sich zunächst diese Standorte anzusehen. Sobald das Organoid lokalisiert ist, entfernen Sie es aus dem Embryo, indem Sie es mit einer Mikroschere umschneiden.

Legen Sie das Organoid in das unweigerlich daran haftende Hühnergewebe in einer Petrischale unter das Präpariermikroskop. Entfernen Sie so viel Hühnergewebe wie möglich mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus Edelstahl. Immunfluoreszenzbilder eines nicht transplantierten Nierenorganoids und eines transplantierten Nierenorganoids enthalten beide glomeruläre und tubuläre Strukturen.

In den nicht transplantierten Organoiden sind einige menschliche Endothelzellen vorhanden. Im transplantierten Organoid ist ein perfundiertes Gefäßnetz im gesamten Organoid sichtbar. Vergrößerte Bilder der eingerahmten Bereiche zeigen die drei Arten von Endothelzellen, die in transplantierten Organoiden unterschieden werden können: perfundierte menschliche Endothelzellen, nicht durchblutete menschliche Endothelzellen und perfundierte Endothelzellen aus Hühnern.

In nicht transplantierten Organoiden umgeben Endothelzellen glomeruläre Strukturen, dringen aber nicht in diese ein. In transplantierten Organoiden werden glomeruläre Strukturen jedoch durch perfundierte Kapillaren vaskularisiert. Transplantierte Organoide können je nach Ziel des Experiments mit unterschiedlichen Techniken analysiert werden.

Der direkte Vergleich mit nicht transplantierten Kontrollen kann Aufschluss über den Prozess der Vaskularisierung und Reifung geben.