Name: Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Analyse der Lokomotorik von Drosophila mittels Videoaufzeichnung und Open-Source-Software Fiji. Diese Technik ermöglicht die quantitative Bewertung von Verhaltensänderungen bei Fliegenmodellen menschlicher Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde durch einen speziellen Startfonds der Soochow-Universität und der National Science Foundation of China (NSFC) (82171414) unterstützt. Wir danken den Labormitgliedern von Prof. Chunfeng Liu für ihre Diskussionen und Kommentare.

Für die vorliegende Studie wurden W1118 adulte Fliegen und Larven im dritten Stadium verwendet.
1. Versuchsvorbereitung
HINWEIS: Eine Freilandarena für die Fortbewegungsverfolgung von Drosophila besteht aus einem farb- und geruchlosen Kieselgel.
<ol><li>Mischen Sie Reagenz A und Reagenz B im Verhältnis 1:10 gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Kieselsäure-Kit (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass der Mischung Natriumbicarbonat durch Rühren zugesetzt wird, bis die Farbe weiß wird. Die Mischung in eine saubere Petrischale geben und bei 40 °C zum Trocknen für 48 Stunden in den Ofen stellen.</li>
	<li>Stellen Sie die HD-Kamera (siehe Materialtabelle) auf ein Stativ und stellen Sie sie so ein, dass das Kameraobjektiv senkrecht zur Oberfläche der Siliziumdioxidarena steht. Stellen Sie durch Einstellen der Brennweite und der Blendenöffnungen der Kamera sicher, dass die Kamera auf die Oberfläche des Siliziumdioxids fokussiert ist und das Display ausreichend beleuchtet ist. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt.</li>
	<li>Bringen Sie eine Fliege in die Freilandarena, um ein kontinuierliches Video von mindestens 61 s aufzunehmen. HINWEIS: In Anbetracht der Trägheit der Larven wird eine Videoaufnahmezeit von mehr als 10 Minuten empfohlen.<ol><li>Öffnen Sie das Video mit Fidschi, ziehen Sie den Fortschrittsbalken auf das erste Bild und stimmen Sie stillschweigend zu. Wählen Sie den gesamten Körper der Fliege mit dem Werkzeug "Freihandauswahl" aus (Abbildung 2B, C).</li>
		<li>Klicken Sie auf das Bild > passen Sie > Helligkeit und Kontrast an, um den Weißabgleich anzupassen, bis sich der Grauwert des ausgewählten Bereichs dem breiten Hintergrund nähert (Abbildung 2D-F). HINWEIS: Die Hintergrundhomogenisierung des ersten Frames ermöglicht es der Software, den Hintergrund ohne Objekte zu unterscheiden und einen Kontrast zu erzeugen, wenn eine Fliege vorhanden ist, sodass die Software sie verfolgen kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das gesamte Experiment in einer Testumgebung mit 25 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem ruhigen Bereich durch, der keinem hellen Licht ausgesetzt ist.</li>
</ol>2. Videoaufzeichnung und -vorverarbeitung
<ol><li>Nach einer kurzen Narkosezeit mit 95 % Kohlendioxid (CO2) bringen Sie eine Fliege in die offene Arena und drücken Sie die Aufnahmetaste an der Kameraanwendung, um die Videoaufnahme zu starten. Anmerkungen: Um die Wirkung des Anästhetikums auf die Fortbewegung zu minimieren, lassen Sie die Fliegen 10 Minuten lang sich erholen, bevor Sie mit der Videoaufzeichnung beginnen. Eine kühle Betäubung durch Kühlung wird ebenfalls empfohlen.<ol><li>Sobald sich die Fliegen von der Narkose erholt haben, stellen Sie die Arenaschale mit der Fliege unter die Kamera und schütteln Sie die Platte schnell von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass die Fliege in Bewegung ist, wenn die Aufnahme beginnt.</li>
	</ol></li>
	<li>Drücken Sie nach Abschluss der Aufnahme die Stopp-Taste , um die Videoaufnahme zu beenden. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Videoaufzeichnungszeit die Zielverfolgungszeit geringfügig überschreitet. Um die experimentelle Effizienz zu verbessern, ist es außerdem möglich, mehrere Fliegen spontan zu verfolgen. Dies hängt von der Auflösung der Kamera ab, um einen qualitativ hochwertigen Videoausschnitt zu ermöglichen.</li>
	<li>Konvertieren Sie die aufgenommenen Videos in das AVI-Format mit MJPEG-Kodierung, damit sie mit Fidschi geöffnet und analysiert werden können. Stellen Sie in der Zwischenzeit die Bildrate pro Sekunde (fps) des Videos auf 15 fps für erwachsene Fliegen und 12 fps für Larven ein.</li>
</ol>3. Videoanalyse
<ol><li>Öffnen Sie das Video, das transformiert wurde, mit "Virtuellen Stapel verwenden" und "In Graustufen konvertieren", zwei Optionen im Popup-Fenster, wenn Sie das Video mit Fidschi öffnen (Abbildung 2A).</li>
	<li>Erstellen Sie einen leeren ersten Frame, wie oben erwähnt.</li>
	<li>Erhalten Sie ein Verarbeitungsfenster, indem Sie das Werkzeug "Aktives Bild setzen" des AnimalTracker-Plugins verwenden, und erstellen Sie mit dem Werkzeug "Oval" einen Tracking-Bereich, der die Arena im ursprünglichen Videofenster umkreist (Abbildung 3A).</li>
	<li>Stellen Sie die Filter (Abbildung 3A,3) und die Parameter der beiden Filter (Abbildung 4A-G) für das erste leere Bild im Verarbeitungsfenster ein. Wählen Sie dann das nächste Bild im ursprünglichen Videofenster aus und wählen Sie die gefilterte Oberfläche des Verarbeitungsfensters aus (Abbildung 5A-C). HINWEIS: Der Filterschritt dient dazu, das Bildrauschen zu verringern und/oder den Hintergrund zu entfernen, wodurch es einfacher wird, den Vordergrund beim Binarisieren der Frames vom Hintergrund zu trennen.</li>
	<li>Sobald ein gefiltertes Verarbeitungsfenster ausgewählt ist, drehen Sie die verfolgte Fliege mit einem roten Profil, das im Verarbeitungsfenster verdeckt ist, indem Sie das Werkzeug "Schwellenwert festlegen" verwenden (Abbildung 3A, 4, Abbildung 5D-E und Abbildung 6A).</li>
	<li>Verwenden Sie den "set blob-detector", damit der Computer die Fliege mit einem roten Profil erkennen kann, das im Verarbeitungsfenster abgedeckt ist (Abbildung 3A, 5 und Abbildung 6B).</li>
	<li>Legen Sie Frame 901 als letztes Frame für die erwachsene Fliege fest, berechnet anhand der Aufnahmedauer und der fps des Videos (Abbildung 3A,6, Abbildung 6C). HINWEIS: Das folgende Experiment mit Larven wurde 10 Minuten lang verfolgt, daher ist Frame 7200 als letzter Frame festgelegt.</li>
	<li>Verwenden Sie das Werkzeug "Blobs anzeigen", um ein Tracking-Rechteck im ursprünglichen Videofenster darzustellen (Abbildung 3A,7 und Abbildung 6D,E). Starten Sie dann das Tracking und exportieren Sie die Tracking-Datei, nachdem die Überwachung abgeschlossen ist (Abbildung 3A,8,9 und Abbildung 7A,B).</li>
</ol>4. Tracking-Dateianalyse
<ol><li>Laden Sie die Track- und Zonendateien mit dem Animal Tracker > Tracking Analyzer-Plug-in (Abbildung 8A).</li>
	<li>Wählen Sie den gewünschten Index mithilfe der Zoneneinstellungen aus und ändern Sie die Parametereinstellungen (Abbildung 8). Berechnen Sie die Zeit des Frame-Intervalls anhand der Framerate. HINWEIS: In diesem Zustand beträgt die Bildrate 15 fps und das Bildintervall beträgt ca. 0,067 s, was der Standardeinstellung entspricht (Abbildung 8D).</li>
	<li>Erstellen Sie die quantitativen Analysediagramme mit der Tabellenkalkulationssoftware und GraphPad Prism, nachdem sie im Tracking Analyzer analysiert wurden (Abbildung 9).</li>
</ol>5. Analyse pro Frame
<ol><li>Führen Sie eine Geschwindigkeitsanalyse pro Frame-Intervall durch. Analysieren Sie die Track-Datei ohne Fidschi, wenn eine detailliertere Recherche erforderlich ist.<ol><li>Öffnen Sie die Track-Datei, kopieren Sie alle Koordinaten in Microsoft Office Excel, und teilen Sie die Zellen mit der Leertaste. HINWEIS: Wenn die Datei beispielsweise in die Spalten "C" und "D" unterteilt wurde, wird die Geschwindigkeit von Drosophila pro Frame-Intervall mit der Formel SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2) berechnet, die in der Spalte "E" angezeigt wird (Abbildung 10A). Die Daten in Spalte "E" geben die Anzahl der Pixel an, die die Fliege zwischen zwei Frames bewegt hat, wobei der erste Frame nicht berücksichtigt wird. Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus und fügen Sie ein Liniendiagramm ein, um eine intuitive Flugbewegungsgeschwindigkeit pro Frame-Intervall mit einem Peak auf dem Liniendiagramm anzuzeigen (Abbildung 10B).</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie die Immobilitätszeit pro Frame-Intervall. Nachdem die Datei in die Spalten "C" und "D" aufgeteilt wurde, berechnen Sie den Immobilitätsstatus von Drosophila pro Frame-Intervall mit der Formel IF(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), die in der Spalte "E" angezeigt wird. (Abbildung 10C). HINWEIS: Im Gegensatz zur Geschwindigkeitsanalyse wurden die Ergebnisse des ersten Frames definiert. Fliegen, die sich weniger als 20 Pixel bewegten, galten als unbeweglich und wurden als "0" in Spalte "E" aufgezeichnet.<ol><li>Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus, und fügen Sie ein Säulendiagramm ein, um die Immobilitätszeit am Rand des gesamten Säulendiagramms visuell darzustellen (Abbildung 10D).</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass sich der Richtungswinkel ändert. HINWEIS: Die Analyse des Richtungswinkels stellt die Richtungswahl der Fliegen dar. Nachdem die Datei in die Spalten "C" und "D" aufgeteilt wurde, wird der Winkel der Richtungsänderung mit der Formel ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), die in der Spalte "E" dargestellt ist (Abbildung 10E). Die berechneten Ergebnisse geben den Winkel zwischen drei Koordinaten an.<ol><li>Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus und fügen Sie ein Streudiagramm ein, um den Winkel der Richtungsänderung der Fliegenbewegung zu veranschaulichen (Abbildung 10F).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben eine Methode entwickelt, die auf dem Open-Source-Material AnimalTracker API basiert, das mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist und es Forschern ermöglicht, die Bewegungsaktivität systematisch zu bewerten, indem sie sowohl erwachsene als auch einzelne Larvenfliegen verfolgen. AnimalTracke ist ein in Java geschriebenes Tool, das sich leicht in bestehende Datenbanken oder andere Tools integrieren lässt, um die Analyse des von der Anwendung entworfenen Tierverfolgungsverhaltens<...

Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung zellulärer und molekularer Funktionen in neuronalen Krankheitsmodellen, die durch Genmodifikation1, medikamentöse Behandlung2 und Seneszenz3 entstanden sind. Die hohe Erhaltung biologischer Signalwege, physikalischer Eigenschaften und krankheitsassoziierter Homologgene zwischen Mensch und Drosophila macht die Fruchtfliege zu einem idealen Nachahmer von der molekularen bis zur Verhaltensebene4. In vielen Krankheitsmodellen ist die Verhaltensschwäche ein wichtiger Index, der ein hilfreiches Modell für verschiedene menschliche Neuropathien darstellt 5,6. Drosophila wird heute verwendet, um mehrere menschliche Krankheiten, die neurologische Entwicklung und neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und amyotrophe Lateralsklerose zu untersuchen 7,8. Die Detektion der motorischen Fähigkeiten der Krankheitsmodelle ist entscheidend für das Verständnis des pathogenen Verlaufs und könnte eine phänotypische Korrelation zu den molekularen Mechanismen liefern, die dem Krankheitsprozess zugrunde liegen.
In jüngster Zeit wurden kommerziell erhältliche Software-Tools und kostengünstige Programme für Strategien zur Detektion des Bewegungsapparates von Drosophila entwickelt, wie z. B. Hochdurchsatztests in gruppierten Fliegen9,10 und Messungen der Fortbewegung in Echtzeit11,12. Ein solcher konventioneller Ansatz ist die schnelle interaktive negative Geotaxis (RING), auch Kletterassay genannt, der mehrere Kanäle umfasst, die es ermöglichen, eine große Fliegenpopulation mit gleichem Geschlecht und Alter einzudämmen, wodurch die Variation reduziert wird, während die Daten gesammelt werden 9,13. Ein weiteres Vortestverfahren zur Analyse des Bewegungsverhaltens ist der TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), eine Vorrichtung, die mehrere Strahlen verwendet, um die Bewegung der Fliegenaktivität innerhalb eines dünnen Glasröhrchens14 zu erfassen. Die Vorrichtung zeichnet kontinuierlich die Position auf, die eine automatisierte Fortbewegung darstellt, indem die Strahlkreuzungen berechnet werden, um die Aktivität und den circadianen Rhythmus von Fliegen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen15. Obwohl diese Methoden bei der Analyse von Verhaltensfehlern bei Fruchtfliegen weit verbreitet sind, um Veränderungen in der Verhaltensfortbewegung zu bestimmen, erfordern sie immer spezielle Testgeräte oder komplexe Analyseprozesse und schränken ihre Anwendung in einigen Modellen mit einem begrenzten, einfachen Gerät ein. Gruppenbasierte Strategien zur Tierverfolgung zum Testen der adulten Drosophila, wie z. B. FlyGrAM11 und der Drosophila Island Assay10, implementieren soziale Rekrutierung und individuelles Tracking in einem vordefinierten Bereich. Nichtsdestotrotz können sich soziale individuelle Einschränkungen in benachteiligten Gebieten negativ auf die Identifizierung in den Bildern auswirken, verursacht durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen. Auch wenn einige materialbasierte Open-Source-Methoden wie TRex16, MARGO 12 und FlyPi17 einen Notfall haben, können sie die Fliegen mit flexiblem Einsatz in Verhaltenstests schnell verfolgen. Diese Testansätze sind mit aufwendigen Versuchsapparaturen, speziellen Softwareanforderungen oder professionellen Computersprachen verbunden. Bei Larven sind die Messung der Gesamtstrecke, die über die Anzahl der Gitterbegrenzungslinien pro Zeiteinheit18 zurückgelegt wird, oder die grobe Zählung der Körperwandkontraktionen für Individuen19 die vorherrschenden Methoden zur Beurteilung ihrer Bewegungsfähigkeit. Aufgrund der mangelnden Präzision von Geräten oder Vorrichtungen und Analysemethoden kann es vorkommen, dass einige Verhaltensbewegungen von Larven nicht entdeckt werden, was es schwierig macht, Verhaltensbewegungen, insbesondere feine Bewegungen, genau zu beurteilen15.
Die hier entwickelte Methode nutzt die AnimalTracker-Programmierschnittstelle (API), die mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm (ImageJ) kompatibel ist, um die Bewegungsaktivität sowohl von adulten als auch von Larvenfliegen systematisch zu bewerten, indem ihr Tracking-Verhalten aus hochauflösenden (HD) Videos analysiert wird. Fiji ist eine Open-Source-Software-ImageJ-Distribution, die robuste Softwarebibliotheken mit zahlreichen Skriptsprachen kombinieren kann, was zu einem schnellen Prototyping von Bildverarbeitungsalgorithmen führt, was sie bei Biologen wegen ihrer Bildanalysefunktionen beliebt macht20. Im aktuellen Ansatz wird die Integration von Fidschi in die AnimalTracker-API genutzt, um einen einzigartigen Drosophila-Verhaltensassay mit personalisierter Algorithmus-Einfügung zu entwickeln, und bietet einen nützlichen Schritt für detaillierte Dokumentationen und Tutorials, um robuste analytische Fähigkeiten des Bewegungsverhaltens zu unterstützen (Abbildung 1). Um die Komplikation der objektiven Identifizierung in den Bildern zu umgehen, die durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen verursacht wird, ist jede Arena darauf beschränkt, nur eine Fliege zu beherbergen. Nach der Bewertung der Tracking-Präzision des Ansatzes wurde er implementiert, um die Bewegungsbewegungen von Drosophila zu verfolgen und zu quantifizieren, die mit dem toxischen Medikament Rotenon verabreicht wurden, das im Allgemeinen für Tiermodelle der Parkinson-Krankheit verwendet wird, und schließlich eine Beeinträchtigung der Fortbewegung in der medikamentösen Behandlung entdeckte21. Diese Methodik, die Open-Source- und freie Software verwendet, erfordert keine kostspieligen Instrumente und kann die Verhaltensbewegung von Drosophila präzise und reproduzierbar analysieren.

<table><tbody><tr><td>Animal Tracker</td><td>Ungarisches Hirnforschungsprogramm</td><td>Version: 1.7</td><td>Offizielle Website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads</td></tr><tr><td>Kamerasoftware</td><td>Microsoft-Version</td><td>: 2021.105.10.0</td><td>integriertes Windows 10-System</td></tr><tr><td>Computer</td><td>DELL</td><td>Vostro-14-5480</td><td>ein Computer mit Win 10-System ist verfügbar</td></tr><tr><td>Drosophila Kohlendioxid-Anästhesie-Workstation</td><td>Wu han Yihong technology</td><td>#YHDFPCO2-018</td><td>offizielle Website: http://www.yhkjwh.com/</td></tr> <tr><td>Fidschi Software</td><td>Fidschi</td><td>Team Version: 1.53v</td><td>offizielle Website: https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Format factory software</td><td>Pcfreetime</td><td>Version: X64 5.4.5</td><td>offizielle Website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html</td></tr><tr><td>Graph Pad Prisma</td><td>GraphPad Software</td><td>Version: 8.0.2</td><td>Offizielle Website: https://www.graphpad-prism.cn</td></tr><tr><td>Hight Definition Kamera</td><td>TTQ</td><td>Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)</td><td>Offizielle Website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 Office-Software Microsoft-Version</td></tr><tr><td></td><td></td><td>: Office 2019</td><td>Offizielle Website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Bkman</td><td>110301003</td><td>Größe: 60 mm</td></tr><tr><td>Kieselgel</td><td>DOW</td><td>SYLGARD 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Gut mischen gemäß den Anweisungen</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Macklin</td><td>#144-55-8</td> Gut <td>mischen mit Kieselgel</td></tr></tbody></table>

eine einfache technik zur bestimmung der lokomotorischen aktivität in drosophila

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster ist aufgrund seiner Fülle an fortschrittlichen genetischen Manipulationstechniken und vielfältigen Verhaltensmerkmalen ein idealer Modellorganismus für die Erforschung verschiedener Krankheiten. Die Identifizierung von Verhaltensstörungen in Tiermodellen ist ein entscheidendes Maß für den Schweregrad der Erkrankung, zum Beispiel bei neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen Patienten häufig Beeinträchtigungen der Motorik erfahren. Mit der Verfügbarkeit verschiedener Systeme zur Verfolgung und Bewertung motorischer Defizite in Fliegenmodellen, wie z. B. medikamentös behandelten oder transgenen Individuen, fehlt jedoch noch ein wirtschaftliches und benutzerfreundliches System zur präzisen Auswertung aus mehreren Blickwinkeln. Hier wird eine Methode entwickelt, die auf dem Application-Programming Interface (API) AnimalTracker basiert und mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist, um die Bewegungsaktivitäten sowohl adulter als auch larvaler Individuen aus aufgezeichneten Videos systematisch auszuwerten und so deren Tracking-Verhalten zu analysieren. Diese Methode erfordert nur eine hochauflösende Kamera und eine Hardwareintegration für Computerperipheriegeräte, um das Verhalten aufzuzeichnen und zu analysieren, was sie zu einem erschwinglichen und effektiven Ansatz für das Screening von Fliegenmodellen mit transgenen oder umweltbedingten Verhaltensmängeln macht. Beispiele für Verhaltenstests mit pharmakologisch behandelten Fliegen werden gegeben, um zu zeigen, wie die Techniken Verhaltensänderungen sowohl bei erwachsenen Fliegen als auch bei Larven auf hochgradig wiederholbare Weise erkennen können.

In der vorliegenden Arbeit wurden lokomotorische Defizite bei adulten Fliegen und Larven im dritten Stadium, die mit Rotenon behandelt wurden, untersucht und in ihrer motorischen Aktivität mit der einer Kontrollfliege verglichen, die mit dem Wirkstofflösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gefüttert wurde. Es hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit Rotenon bei Drosophila zu einem Verlust von dopaminergen Neuronen im Gehirn führt22 und zu signifikanten lokomotorischen Defiziten<sup class="...

Das vorliegende Protokoll bewertet die Bewegungsaktivität von Drosophila , indem es die Bewegung von Fliegen in einer handgefertigten Arena unter Verwendung der Open-Source-Software Fidschi verfolgt und analysiert, die mit Plugins kompatibel ist, um Pixel jedes Frames basierend auf hochauflösenden Videoaufzeichnungen zu segmentieren, um Parameter wie Geschwindigkeit, Entfernung usw. zu berechnen.

Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Die Methode basiert auf Open-Source-Software, um die lokalen motorischen Aktivitäten systematisch für das Trackingverhalten von adulten und den Larvenfliegen aus aufgezeichneten Videos auszuwerten. Diese Methode erfordert eine kostengünstige Geräteintegration zur Aufzeichnung und Analyse des Verhaltens, was sie zu einem erschwinglichen und effektiven Ansatz für das Screening der Fliegenbewegung macht. Diese Technologie wird eingesetzt, um Verhaltensänderungen in einem Fliegenmodell menschlicher Krankheiten mit lokaler Bewegungsbeeinträchtigung zu identifizieren, ist aber nicht für die Behandlung von Krankheiten, Behinderungen oder Schwierigkeiten geeignet.Es ist wichtig, während des Analyseprozesses das relevante Videofenster zu löschen, nämlich das Original- und das Verarbeitungsvideofenster. Mischen Sie zunächst Reagenz A und Reagenz B des Kieselsäure-Kits im Verhältnis eins zu 10 gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Freilandarena für die Verfolgung der Drosophila-Fortbewegung vorzubereiten. Stellen Sie als Nächstes die HD-Kamera auf ein Stativ und stellen Sie sie so ein, dass das Kameraobjektiv senkrecht zur Oberfläche der Siliziumdioxidarena steht.Öffnen Sie dann das Video mit Fidschi. Ziehen Sie den Fortschrittsbalken auf den ersten Frame und stimmen Sie stillschweigend zu. Wählen Sie den gesamten Körper der Fliege mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug aus.Klicken Sie auf Bild, anpassen und Helligkeit und Kontrast, um den Weißabgleich anzupassen, bis sich der Grauwert des ausgewählten Bereichs dem breiten Hintergrund nähert. Bringen Sie die betäubte Fliege in die Freilandarena. Sobald sich die Fliege von der Narkose erholt hat, stellen Sie die Arenaschale mit der Fliege unter die Kamera und schütteln Sie sie schnell von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass die Fliege in Bewegung ist, wenn die Aufnahme beginnt.Drücken Sie die Aufnahmetaste in der Kameraanwendung, um die Videoaufnahme zu starten. Drücken Sie nach Abschluss der Aufnahme die Stopp-Taste, um die Videoaufnahme zu beenden. Konvertieren Sie die aufgenommenen Videos in das AVI-Format mit heidnischer M-J-Codierung, damit sie mit Fidschi geöffnet und analysiert werden können.Stellen Sie außerdem die Bilder pro Sekunde des Videos auf 15 fps für erwachsene Fliegen und 12 fps für Larven ein. Um das Video mit Fidschi zu öffnen, wählen Sie im Popup-Fenster die beiden Optionen aus, verwenden Sie den virtuellen Stapel und konvertieren Sie ihn in Graustufen. Rufen Sie ein Verarbeitungsfenster ab, indem Sie das Werkzeug "Aktives Bild festlegen" des Tier-Tracker-Plugins verwenden, und erstellen Sie mit dem ovalen Werkzeug einen Tracking-Bereich, der die Arena im ursprünglichen Videofenster umkreist.Legen Sie die Filter und die Parameter der beiden Filter für den ersten leeren Frame im Verarbeitungsfenster fest. Wählen Sie dann das nächste Bild im ursprünglichen Videofenster aus und wählen Sie die gefilterte Oberfläche des Verarbeitungsfensters aus. Sobald ein gefiltertes Verarbeitungsfenster ausgewählt ist, verwenden Sie das Werkzeug Schwellenwert festlegen, um den Traktflug mit einem roten Profil zu drehen, das im Verarbeitungsfenster verdeckt ist.Verwenden Sie dann den gesetzten Blob-Detektor, damit der Computer die Fliege mit einem roten Profil erkennen kann, das im Verarbeitungsfenster abgedeckt ist. Legen Sie das letzte Bild für die erwachsene Fliege oder die Larven fest, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie das Tool "Blobs anzeigen", um ein Tracking-Rechteck im ursprünglichen Videofenster anzuzeigen.Starten Sie das Tracking und exportieren Sie die Tracking-Datei, nachdem das Monitoring abgeschlossen ist. Laden Sie die Track- und Zonendateien mit dem Animal Tracker and Tracking Analyzer Plugin. Wählen Sie den gewünschten Index mithilfe der Zoneneinstellungen aus und ändern Sie die Parametereinstellungen.Berechnen Sie die Zeit des Frame-Intervalls anhand der Framerate. Erstellen Sie die quantitativen Analysediagramme mit einer Tabellenkalkulationssoftware und einem Graphpad-Prisma, nachdem sie im Tracking-Analysator analysiert wurden. Öffnen Sie die Track-Datei.Kopieren Sie alle Koordinaten nach Microsoft Office Excel und teilen Sie die Zellen mit der Leertaste. Um die Immobilitätszeit pro Frameintervall zu berechnen, wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus, und fügen Sie ein Säulendiagramm ein, um die Immobilitätszeit am Rand des gesamten Säulendiagramms visuell darzustellen. Um die Änderungen des Richtungswinkels zu veranschaulichen, wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus, und fügen Sie ein Streudiagramm ein.Adulte Fliegen und Larven des dritten Stadiums, die mit Rotenon behandelt wurden, wiesen signifikante lokomotorische Defizite im Vergleich zu Kontrollfliegen auf, die mit Lösungsmittel DMSO gefüttert wurden. Die quantitative Analyse der Rotenon-Behandlung bei adulten Fliegen zeigte eine signifikante Abnahme der zurückgelegten Strecke und der mittleren Geschwindigkeit. Und eine deutliche Erhöhung der Immobilitätszeit.Repräsentative Diagramme zeigten weniger Spitzen für die Bewegungsgeschwindigkeit pro Bildintervall bei Fliegen, die mit Rotenon gefüttert wurden, im Vergleich zu denen in der Kontrolle, was auf den Schweregrad des lokomotorischen Aktivitätsdefizits hinweist. Auch die institutionistische Immobilitätsspalte der bewegten Pixel pro Frame zeigte signifikant weniger Bewegung innerhalb einer Minute für mit Rotenon gefütterte Fliegen im Vergleich zu den Kontrollfliegen. Repräsentative Diagramme, die den Bewegungswinkel der Richtungsänderungen bei Rotenon- und Kontrolltieren veranschaulichen, zeigten auch Veränderungen in der von den Fliegen gewählten Richtung.Ähnliche Ergebnisse wurden für die dritte Instar-Larve beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Verhaltensbewegung von Trackinglarven, die mit Rotenon gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrolle signifikant beeinträchtigt war. Der wichtigste Schritt im Analyseprozess ist die Bildung des ersten leeren Rahmens, da er beweist, ob die Software effektiv überprüfen kann.Diese Technologie könnte es Forschern ermöglichen, tiefer in den zugrunde liegenden Mechanismus mehrerer Defekte wie Nerven- oder Muskelverletzungen einzutauchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Die Untersuchung der komplexen Bewegungsapparat Verhalten...

Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Wir beschreiben Verfahren zur Erfassung täglichen Bewegungsaktivität...

Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila</em

Drosophila melanogaster ist eine genetisch und auf der Verhaltensebene praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet wurde, um die molekularen und zellulären Grundlagen von vielen wichtigen biologischen Prozessen seit über einem Jahrhundert ein zu verstehen. Drosophila wurde auch genutzt, um Einblicke in die genetischen Grundlagen der Fliege Verhalten zu gewinnen.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Dieses Video beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der Fortbewegung von Fliegen und zeigt den durchgeführten Kletter-Assay. Der Fly-Climbing-Assay ist ein allgemeiner Test der motorischen Funktion, der auf einer negativen Geotaxis-Reaktion beruht.

Fly Climbing Assay: Eine Methode zum Testen der allgemeinen Fortbewegung bei Drosophila melanogaster

Dieses Video beschreibt, wie man frei laufende Fliegen verfolgen kann, um ihre allgemeine Fortbewegungsfähigkeit zu beurteilen. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Einrichtung des Assays und die Datenanalyse mit Hilfe von Video-Tracking-Software.

Verfolgung frei laufender Fliegen: Eine Methode zur Beurteilung der Fortbewegung bei Drosophila

Dieses Video beschreibt das Drosophila-Aktivitätsmonitor-System (DAM), das zur Verfolgung der Bewegungsaktivität verwendet wird. Die Forscher verwenden Aktivitätsdaten, die vom DAM gesammelt wurden, um den zirkadianen Rhythmus bei Fruchtfliegen zu untersuchen. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie man Fliegen in das Gerät lädt und Aktivitätsdaten für zirkadiane Experimente aufzeichnet.

Drosophila Activity Monitor (DAM): Eine Methode zur Messung der Bewegungsaktivität bei Fliegen

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum schnellen und genauen Messung der Flugleistung in Drosophila, was eine Hochdurchsatz-Screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster sind nützlich bei der Untersuchung genetischer oder umwelt Manipulationen, die Verhaltensweisen wie spontane Bewegungsaktivität beeinflussen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Monitore mit Infrarot-Strahlen und Datenanalyse-Software, um die spontane Bewegungsaktivität zu quantifizieren nutzt.

Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Mit einer Webcam und einer Kombination aus kostenlosen und kostengünstigen Software-Programme können Lokomotive Muster in Drosophila melanogaster analysiert werden, um Unterschiede in der Geschwindigkeit, Distanz, Zeit und der verschiedenen motorischen Aktivitäten zu erkennen.

Ein Low-Cost-Methode für die Analyse von Beschlagnahme-ähnliche Aktivität und Bewegung in<em&gt; Drosophila</em

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Larvenaktivität von Drosophila mit dem TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Das Gerät nutzt Infrarotstrahlen, um die Bewegungen von bis zu 16 einzelnen Tieren zu erkennen. Die Daten können analysiert werden, um Bewegungsparameter wie Raten und die Positionen der Tiere in den Assay-Kammern darzustellen.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Analyse der Lokomotorik von Drosophila mittels Videoaufzeichnung und Open-Source-Software Fiji. Diese Technik ermöglicht die quantitative Bewertung von Verhaltensänderungen bei Fliegenmodellen menschlicher Erkrankungen.

Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila

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