Name: Isolierung und Kultivierung von humanen Fettstammzellen mit einer innovativen xenogenfreien Methode für die Humantherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Lernen Sie eine xenogenfreie Methode zur Isolierung und Kultivierung humaner Fettstammzellen für die Zelltherapie. Diese Technik gewährleistet Biosicherheit und ist für klinische Anwendungen reproduzierbar.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

hASCs wurden aus dem abdominalen Fettgewebe einer gesunden Frau isoliert, die sich am Universitätsspital Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz, einer Brustrekonstruktion mit abdominalen Autolappen (tiefe untere epigastrische Perforatorlappen, [DIEP]) unterzogen hatte. Der verworfene Teil des Lappens und das Fettgewebe wurden erhalten, nachdem der Patient eine Einverständniserklärung unterschrieben hatte. Alle Protokolle wurden von der Biobank-Abteilung DAL (Nummer 314 GGC) und den Ethikkommissionen des Krankenhauses in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki geprüft und genehmigt.
HINWEIS: Alle Schritte müssen unter einer Laminar-Flow-Haube und unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Handschuhe und Laborkittel zum persönlichen Schutz sollten immer getragen werden, und alle Oberflächen sollten mit geeigneten Bioziden gewaschen werden. Überschüssiges Gewebe sollte ordnungsgemäß als biomedizinischer Abfall entsorgt werden.
1. Benötigte Materialien und Vorbereitung der Kulturlösungen
<ol><li>Besorgen Sie sich für die Zellisolierung, -expansion und -kryokonservierung die folgenden Instrumente: sterile Schere; sterile Skalpelle; sterile Pinzette; eine 10 cm Petrischale; 15-ml-Röhrchen; T25-Kolben; eine Burker-Kammer; Kryozellen; ein Gefrierbehälter für Zellen; ein optisches Mikroskop mit Objektiven mit 4-facher und 10-facher Vergrößerung; und eine schwingende Eimerzentrifuge.</li>
	<li>Für die Immunphänotypisierung erhalten Sie die folgenden Instrumente und Reagenzien: FACS-Röhrchen, sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS); Dulbeccos minimales essentielles Medium (DMEM); hPL; Dimethylsulfid; und tierversuchsfreies Trypsin.</li>
	<li>Bereiten Sie das komplette Nährmedium vor, indem Sie DMEM mit 5% heparinfreiem hPL ergänzen. Lagern Sie das Medium bis zu 3 Wochen bei 4 °C und verwenden Sie es immer warm (zwischen Raumtemperatur und 37 °C). Befolgen Sie die GMP-Richtlinien für die Herstellung von Zellarzneimitteln, die für die Humantherapie bestimmt sind, und fügen Sie dem Nährmedium keine Antibiotika hinzu.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Gefriermedium vor, das 20% hPL und 10% Dimethylsulfid in DMEM enthält.</li>
</ol>2. Isolierung von hASCs aus der Fettgewebsprobe
<ol><li>Verarbeiten Sie die Fettgewebsprobe innerhalb von 6 Stunden nach der Gewinnung. Bevor Sie mit der etablierten mechanischen xenogenfreien Isolationsmethode fortfahren, waschen Sie das Gewebe 2x mit PBS für 10 Minuten, bis Bindegewebe und Blut freigesetzt werden.</li>
	<li>Lagern Sie die erhaltene Fettgewebsprobe aus der abdominoplastischen Chirurgie bis zur Verarbeitung in PBS bei 4° C und in jedem Fall nicht länger als 24 h, um die hASC-Lebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen.</li>
	<li>Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer sterilen Schere in kleinere Stücke von ca. 1 cm2 .</li>
	<li>Zerlegen Sie jedes Stück mit einem Skalpell in kleine Fragmente mit einem Durchmesser <5 mm und verteilen Sie fünf davon in einer 10-cm-Petrischale (Abbildung 2A).</li>
	<li>Um jedes Fragment zu befestigen, verwenden Sie das Skalpell, um Einschnitte auf der Kunststoffoberfläche zu machen, und ziehen Sie jedes Fragment, bis es fest an der Petrischale klebt. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Fragment zu handhaben (Abbildung 2B).</li>
	<li>Fügen Sie vorsichtig 10 ml des vollständigen Nährmediums hinzu, um alle Fragmente abzudecken, ohne sie abzulösen.</li>
	<li>Die Petrischalen werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die hASCs wandern aus dem Gewebe und werden aufgrund ihrer plastischen Adhärenz ohne enzymatische Verdauung selektiert.</li>
	<li>Überwachen Sie die hASC-Ausdehnung bis zur Zellkonfluenz einmal täglich unter einem optischen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung. Wenn die hASCs beginnen, aus dem Gewebe auszutreten, erscheinen sie als kleine Cluster um die Gewebestücke mit einer typischen fibroblastenähnlichen Morphologie. Die hASCs werden aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, an der Kunststoffoberfläche zu haften. Entfernen Sie alle 72 h so viel Medium wie möglich und ersetzen Sie es durch frisches vollständiges Medium, um Zelltrümmer zu entfernen.</li>
	<li>Lassen Sie die Gewebefragmente bis zum ersten Zelldurchgang, der normalerweise nach 7 Tagen erfolgt, an Ort und Stelle.</li>
</ol>3. hASC-Kultur nach der Isolationsphase
<ol><li>Wenn die hASC-Kultur eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht, können die hASCs abgelöst und weiter expandiert werden, um entweder für andere Experimente oder für die Langzeitlagerung verwendet zu werden.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette alle Gewebestücke aus der Petrischale und entsorgen Sie sie. Entfernen Sie das erschöpfte Medium und entsorgen Sie es, wobei Sie darauf achten, die hASCs nicht zu berühren, um sie nicht zu lösen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit 10 ml PBS. 1 ml 1x tierfreies Trypsin zugeben und die Petrischale 5 min bei 37 °C im Inkubator stehen lassen.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter einem optischen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung, ob sich alle Zellen gelöst haben. Andernfalls lassen Sie die Petrischale weitere 2 Minuten im Inkubator und klopfen Sie schließlich vorsichtig auf die Kunststoffoberfläche, um die Zellablösung zu unterstützen.</li>
	<li>Stoppen Sie die Trypsin-Wirkung, indem Sie 2 ml des vollständigen Mediums hinzufügen und alle Zellen in einem 15-ml-Röhrchen sammeln.</li>
	<li>Um das restliche Trypsin zu entfernen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen mit 5 ml vollständigem Medium und überführen Sie die Zellsuspension in einen neuen T25-Kolben. Halten Sie die hASCs in Kultur und erweitern Sie sie, bis sie benötigt werden.</li>
</ol>4. Immunphänotypuntersuchung mittels Durchflusszytometrie
<ol><li>Wenn die hASC-Kultur eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht, trennen Sie die hASCs wie zuvor in Abschnitt 3 beschrieben.</li>
	<li>Nachdem Sie die Zellen gesammelt haben, suspendieren Sie sie in 1 ml vollständigem Medium und zählen Sie ein Aliquot mit dem Zellzähler unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die hASCs bei 300 x g für 5 min und suspendieren Sie sie bei 1 x 106 Zellen/ml FACS-Puffer. 100 μl der Suspension mit 1 x 105 Zellen werden in ein FACS-Röhrchen überführt. Verwenden Sie ein FACS-Röhrchen für jedes untersuchte Antigen sowie ein weiteres für jede isotypische Kontrolle.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit 100 μl der folgenden Antikörper, verdünnt in FACS-Puffer: Anti-CD73 (1:1.000, IgG1, FITC-markiert), Anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-markiert); Anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-markiert); Anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC-markiert); und isotypische Kontrollen für jedes Fluorophor, IgG1 FITC-markiert (1:1.000) und IgG1 PE-markiert (1:50).</li>
	<li>Inkubation der Proben für 1 h im Dunkeln unter Rühren bei 4 °C. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 5 min, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 500 μl FACS-Puffer.</li>
	<li>Beurteilen Sie den Immunphänotyp der Zelle mit einem Durchflusszytometrie-Gerät und zeichnen Sie 50.000 Ereignisse für jedes Röhrchen innerhalb des Tors auf, das ausgewählt wurde, um Zelltrümmer auszuschließen. Berechnen Sie den Prozentsatz der exprimierenden Zellen als Differenz zur spezifischen isotypischen Kontrolle.</li>
</ol>5. Proliferationstest von hASC
<ol><li>Wenn die hASC-Kultur eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht, trennen Sie die hASCs wie in Abschnitt 3 beschrieben.</li>
	<li>Nachdem Sie die Zellen gesammelt haben, suspendieren Sie sie in 1 ml vollständigem Medium und zählen Sie ein Aliquot mit dem Zellzähler unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Aussaat von 5 x 102 hASCs in 200 μl vollständigem Medium in transparenten 96-Well-Platten. Säen Sie die Zellen in technische Replikate, mit einer Vertiefung für jeden Zeitpunkt.</li>
	<li>Beginnen Sie 3 Tage nach der Aussaat mit dem Nachweis der Zellproliferation mit einem Proliferations-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, ersetzen Sie das Kulturmedium durch 100 μl frisches Medium, das zu 20 μl Assay-Reagenz pro Vertiefung hinzugefügt wird. Inkubieren Sie die hASCs 2,5 h lang bei 37 °C, 5 % CO2 für die Reagenzienentwicklung und messen Sie dann die Absorption bei 490 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
	<li>Drücken Sie die hASC-Proliferation als prozentuale Absorption nach Entfernung der Blindabsorption aus.</li>
</ol>6. Kryokonservierung und Lagerung der hASCs
<ol><li>Lösen Sie die Zellen wie in Abschnitt 3 beschrieben ab und zählen Sie ein Aliquot mit dem Zellzähler unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zellen mit einer Gefriermischung bei einer Dichte von 1 x 106 hASCs/ml und geben Sie 1 ml der Zelllösung in ein Kryoventil.</li>
	<li>Legen Sie die Kryobiale bei −80 °C in einen Gefrierbehälter, der die Temperatur um 1 °C/min senkt, und stellen Sie die Kryobiale dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Aus Fett gewonnene Stammzellen haben in den letzten zehn Jahren aufgrund ihrer Häufigkeit, ihrer schnellen und erschwinglichen Isolationsmethoden, ihrer hohen In-vitro/In-vivo-Proliferationsrate und ihrer Stamm-/Differenzierungseigenschaften das Interesse der translationalen Forschung geweckt18,19,20. Daher gelten hASCs als hervorragender Kandidat für zellbasierte Strategien in der regenerativen Medizin<sup cla...

In den letzten Jahrzehnten hat die steigende Nachfrage nach innovativen therapeutischen Behandlungen zu erheblichen Anstrengungen und Ressourceninvestitionen im Bereich der translationalen Medizingeführt 1. Zellbasierte Produkte sind mit Risiken verbunden, die durch die Zellquelle, den Herstellungsprozess (Isolierung, Expansion oder genetische Veränderung) und die nicht-zellulären Nahrungsergänzungsmittel (Enzyme, Wachstumsfaktoren, Kulturzusätze und Antibiotika) bestimmt werden, und diese Risikofaktoren hängen von der spezifischen therapeutischen Indikation ab. Die Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit des Endprodukts könnte stark von den oben genannten Elementenbeeinflusst werden 2. Die Stammzelltherapie erfordert die Einhaltung der Grundsätze der biologischen Sicherheit. Die potenziellen Risiken einer pathogenen Übertragung mit tierischen Produkten in Zellkulturen könnten problematisch sein, und die gründliche Prüfung jedes Produkts, das bei der Herstellung eingeführt wird, ist unerlässlich3.
Die traditionelle Methode zur Isolierung von aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen (hASCs) beinhaltet einen enzymatischen Aufschluss mit Kollagenase, gefolgt von Waschschritten durch Zentrifugation4. Während die enzymatische Isolierung im Allgemeinen in Bezug auf Zellausbeute und Lebensfähigkeit als effizienter angesehen wird als andere mechanische Techniken, werden die verwendeten tierischen Komponenten wie Kollagenase von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als mehr als minimal manipuliert angesehen. Dies bedeutet, dass ein signifikant erhöhtes Risiko für Immunreaktionen oder Krankheitsübertragungen besteht, wodurch die Übertragung der hASC-Therapie auf das klinische Umfeld eingeschränktwird 5,6.
Die Trypsin-basierte Verdauung ist ein weiteres enzymatisches Protokoll zur Isolierung von ASCs. Es wurden verschiedene Techniken mit geringfügigen Modifikationen in Bezug auf die Trypsinkonzentration, die Zentrifugationsgeschwindigkeit und die Inkubationszeit beschrieben. Leider ist diese Methode nicht gut beschrieben, und in der Literatur besteht ein Mangel an Vergleichen, insbesondere mit den mechanischen Isolationsprotokollen7. In Bezug auf die Übersetzbarkeit des Ansatzes hat Trypsin jedoch die gleichen Nachteile wie Kollagenase.
Alternative Isolationsmethoden zur Gewinnung von ASCs, die auf mechanischen Kräften und ohne Enzymzugabe basieren, beinhalten eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation (800 x g oder 1.280 x g, 15 min) der Fettgewebefragmente. Dann wird das Pellet mit einem Lysepuffer für rote Blutkörperchen (5 min) inkubiert, gefolgt von einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 600 x g vor der Resuspension in Kulturmedium. Obwohl in den ersten Tagen im Vergleich zu den Explantatmethoden eine größere Anzahl von Zellen isoliert wurde, zeigte eine frühere Studie eine geringere oder fehlende Proliferation über die zweite Kulturwoche hinaus8.
Darüber hinaus ist eine weitere Manipulation mit xenogenem zugesetztem Medium, wie z. B. fetalem Rinderserum (FBS), das als Wachstumsfaktorergänzung für die Zellkultur verwendet wird, mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und Exposition gegenüber viralen, bakteriellen oder Prioneninfektionen des Wirtspatienten verbunden 9,10. Immunreaktionen und die Entwicklung urtikariformer Hautausschläge wurden bereits bei Personen beschrieben, die mehrere Dosen mesenchymaler Stammzellen erhielten, die mit FBS11 hergestellt wurden. Darüber hinaus unterliegt FBS einer Variabilität von Charge zu Charge, die sich auf die Qualität des Endprodukts auswirken kann12.
In Übereinstimmung mit den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) sollte eine enzymatische Gewebedissoziation vermieden und FBS durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden. Diese Schritte sind zusammen mit zuverlässigeren und reproduzierbareren Protokollen unerlässlich, um die Anwendung der Zelltherapie zu unterstützen 3,13.
In diesem Zusammenhang wurde humanes Thrombozytenlysat (hPL) als Ersatz für FBS vorgeschlagen, da es sich um ein zellfreies, proteinhaltiges, mit Wachstumsfaktoren angereichertes Nahrungsergänzungsmittel handelt, und es wurde früher unter den zellbasierten Produkten in klinischer Qualität als Zusatz von Wachstumsmedium für die In-vitro-Zellkultur und -expansion eingeführt14,15. Da es sich bei hPL um ein vom Menschen stammendes Produkt handelt, wird es häufig als Ersatz für FBS während der In-vitro-Kultur von hASCs verwendet, die für klinische Anwendungen bestimmt sind, wodurch Probleme in Bezug auf immunologische Reaktionen und Infektionen im Zusammenhang mit der FBS-Übersetzbarkeit reduziertwerden 15,16.
Trotz der höheren Produktionskosten konnte bereits gezeigt werden, dass hPL im Vergleich zu FBS die Zelllebensfähigkeit für viele Zelltypen unterstützt, die Proliferation erhöht, die Seneszenz verzögert, die genomische Stabilität gewährleistet und den zellulären Immunphänotyp auch in späten Zellpassagen konserviert. All diese Elemente unterstützen den Wechsel zu dieser Kulturergänzung11.
Ziel dieser Arbeit war es, ein standardisiertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von hASCs mit einer vollständig tierversuchsfreien Methode zu entwickeln, ohne die Zellphysiologie und die Stammeigenschaften im Vergleich zu klassischen FBS-kultivierten hASCs zu verändern (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Euroclone</td><td>et5015b</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560839</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555821</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555482</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>BD561254</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung (FACS-Puffer)</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Gerät (Durchflusszytometrie-Instrument)</td><td>BD Accuri-Burker-Kammer</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Blaubrand</td><td>717810</td><td></td></tr><tr><td>Zellgefrierbehälter</td><td>Corning</td><td>CLS432002</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Zellproliferationsassay</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell Gefrierbehälter</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS432002</tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Clearline</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Einwegklingenskalpell</td><td>Paragon</td><td>bs 2982</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - hoher Glukosegehalt</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Thrombozytenlysat FD (GMP-Qualität)</td><td>Stemulat</td><td>PL-NH-500</td><td></td></tr><tr><td>Infinite F50 Spektralphotometer</td><td></td> <td>Tecan-Optisches</td><td></td></tr> <tr><td>Mikroskop mit Objektiven mit 4- und 10-facher Vergrößerung</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 10 cm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Skalpelle</td><td>Reda</td><td>07104-00</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Schere</td><td>Bochem</td><td>4071</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pinzette</td><td>Bochem</td><td>1152</td><td></td></tr><tr><td>Schwingeimerzentrifuge</td><td>Sigma</td><td>3-16K</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td>Greiner bio-one</td><td>6910170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLe (tierversuchsfreier Trypsin-Ersatz)</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kultivierung von humanen fettstammzellen mit einer innovativen xenogenfreien methode für die humantherapie

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

In Anbetracht der zunehmenden Auswirkungen der Stammzelltherapie wurden Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit hinsichtlich einer möglichen Kontamination oder Infektionsübertragung aufgrund der Einführung tierischer Produkte während der In-vitro-Manipulation geäußert. Die xenogenen Komponenten, wie Kollagenase oder fötales Rinderserum, die üblicherweise während der Zellisolierungs- und Expansionsschritte verwendet werden, könnten mit den potenziellen Risiken einer Immunreaktivität oder einer Virus-, Bakterien- und Prioneninfektion bei den empfangenden Patienten in Verbindung gebracht werden. Gemäß den Richtlinien der guten Herstellungspraxis sollte eine chemische Gewebedissoziation vermieden werden, während fetales Rinderserum (FBS) durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden kann. Um die Sicherheit von Zellprodukten zu gewährleisten, ist es außerdem wichtig, zuverlässigere und reproduzierbarere Methoden zu definieren. Wir haben eine innovative, vollständig xenogenfreie Methode zur Isolierung und In-vitro-Expansion von humanen Fettstammzellen entwickelt, ohne deren Eigenschaften im Vergleich zu Kollagenase-FBS-kultivierten Standardprotokollen zu verändern. Hier wurden aus menschlichem Fettgewebe gewonnene Stammzellen (hASCs) aus abdominalem Fettgewebe isoliert. Die Probe wurde mechanisch mit einer Schere/einem Skalpell zerkleinert, mikropräpariert und mechanisch in einer 10 cm Petrischale dispergiert und mit Skalpellschnitten vorbereitet, um das Anheften der Gewebefragmente und die Migration von hASCs zu erleichtern. Im Anschluss an die Waschschritte wurden hASCs aufgrund ihrer plastischen Adhärenz ohne enzymatischen Aufschluss ausgewählt. Die isolierten hASCs wurden mit Medium kultiviert, das mit 5% heparinfreiem humanem Thrombozytenlysat angereichert und mit einem tierfreien Trypsinersatz abgetrennt wurde. Gemäß den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) zur Herstellung von Zellprodukten, die für die Humantherapie bestimmt sind, wurden keine Antibiotika in Nährmedien verwendet.

Unter Anwendung der oben beschriebenen Isolationsmethode wurden hASCs erfolgreich aus abdominalen Fettgewebeproben ohne den Einsatz von Kollagenase gewonnen. Darüber hinaus wurden die hASCs unter vollständig xenogenfreien Bedingungen in Gegenwart von hPL und ohne weitere Bestandteile tierischen Ursprungs expandiert. Die folgenden Ergebnisse unterstützen das Protokoll und werden aus hASCs gewonnen, die parallel zu hPL und mit FBS als Kontrollbedingung kultiviert wurden.
Nach dem ersten Cluster-...

Xenogene (chemische oder tierische) Produkte, die in den Vorbereitungs-/Manipulationsschritten der Zelltherapie eingeführt werden, sind mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und pathogene Übertragung bei Wirtspatienten verbunden. Hier wird eine vollständige xenogenfreie Methode zur Isolierung und in vitro Expansion von humanen adipösen Stammzellen beschrieben.

Isolierung und Kultivierung von humanen Fettstammzellen mit einer innovativen xenogenfreien Methode für die Humantherapie

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Unsere exogenfreie Methode zur Isolierung und In-vitro-Expansion von aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen ist die Antwort auf die Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit im Zusammenhang mit der Zelltherapie, wenn sie für eine translationale Anwendung in Betracht gezogen wird. Unsere Isolations- und Erweiterungsmethoden sind einfach zu replizieren, schnell und haben geringe technische Anforderungen, so dass sie für jeden nützlich sind. Wir untersuchen eine auf humanen Fettstammzellen basierende Therapiestrategie für die Reparatur peripherer Nerven.Unsere Technik kann jedoch weit verbreitet sein, wenn neue Fettstammzellen in verschiedenen klinischen Forschungseinrichtungen benötigt werden. Wir haben es einfach gehalten, um eine einfachere Produzierbarkeit zu erhalten. Die Sterilität sollte vom Operationssaal bis zur Zellkultur sorgfältig beobachtet werden.Bei der Probenmanipulation und bei der Fragmentierung besteht bei der Mikrodissektion die Gefahr einer Kontamination. Nachdem Sie die Fettgewebsprobe aus der plastischen Bauchchirurgie erhalten haben, schneiden Sie sie mit einer sterilen Schere in Stücke von etwa einem Quadratzentimeter. Zerlegen Sie jedes Stück mit einem Skalpell in kleinere Fragmente und verteilen Sie fünf Fragmente in einer 10 cm langen Petrischale.Verwenden Sie zum Anheften von Fragmenten ein Skalpell, um Einschnitte auf der Kunststoffoberfläche zu erzeugen, und ziehen Sie jedes Fragment. Fügen Sie vorsichtig 10 Milliliter vollständiges Nährmedium hinzu, um alle Fragmente zu bedecken, ohne sie abzulösen, und inkubieren Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Überwachen Sie die Expansion der aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen (HASC) täglich unter einem optischen Mikroskop, bis die Zellen konfluent werden.Ersetzen Sie das Medium alle 72 Stunden durch ein frisches, vollständiges Medium, um Zellreste zu entfernen, und lassen Sie sie bis zum ersten Durchgang wachsen. Sobald die HASC-Kultur 70 bis 80 % Konfluenz erreicht hat, entfernen Sie alle Gewebestücke und entsorgen Sie sie mit einer sterilen Pinzette. Entsorgen Sie auch das erschöpfte Medium, um zu vermeiden, dass sich der HASC von der Petrischale löst.Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie nach dem Entfernen von PBS einen Milliliter tierfreies Trypsin hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem optischen Mikroskop und inkubieren Sie bei Bedarf zwei weitere Minuten.Um die Zellablösung zu unterstützen, klopfen Sie vorsichtig auf die Kunststoffoberfläche. Stoppen Sie die Trypsin-Wirkung, indem Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzufügen und alle Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Entfernen Sie das restliche Trypsin durch Zentrifugation.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter vollständigem Medium und überführen Sie die Zellsuspension in einen neuen T25-Kolben. Für die Kryokonservierung zählen Sie ein Aliquot der abgelösten Zellen mit dem Zellzähler unter einem optischen Mikroskop. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 G.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in der Gefriermischung mit einer Dichte von eins mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter und überführen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in ein Kryofläschchen. Legen Sie die Kryofläschchen bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierbehälter, der die Temperatur um ein Grad Celsius pro Minute senkt, und stellen Sie die Kryofläschchen dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff. In der anfänglichen Cluster-Erscheinung zeigten die HASCs eine klassische spindelartige Form und waren kleiner sowie länglicher im Vergleich zu den Kontrollzellen in Gegenwart von FBS.Der Immunphänotyp der Zellen schien zwischen den HASCs, die mit den beiden Ergänzungen kultiviert wurden, ähnlich zu sein. Mehr als 80 bis 90 % der HASCs waren positiv für CD73 und CD105 und weniger als 5 % für CD34 und CD45. Schließlich zeigte der Proliferationstest einen signifikanten Anstieg des Zellwachstums, wenn dem Medium humanes Thrombozytenlysat zugesetzt wurde, verglichen mit der FBS-Kontrolle.Der wichtigste Schritt ist die Mikrodissektion von Fettfragmenten und deren Befestigung mit einem Skalpellschnitt an der Petrischale. Unter Berücksichtigung der GMP-Biosicherheitskriterien wird eine gebrauchsfertige Stammzellpopulation aus menschlichem Fett erhalten, die die therapeutischen Zelleigenschaften beibehält und die Zellproliferation fördert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Reife Adipozyten können durch Dedifferenzierung eine reichhaltige Quelle für Stammzellen darstellen, was zu einer homogenen Population von Fibroblasten-ähnlichen Zellen führt. Der Kollagenaseverdau wird verwendet, um reife Adipozyten aus menschlichem Fett zu isolieren. Das Ziel unseres Protokolls ist es, multipotente, dedifferenzierte Fettzellen aus humanen reifen Adipozyten zu gewinnen.

Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Hier präsentieren wir menschliche Fettgewebe enzymfreie Mikrofragmentierung mit einem geschlossenen Systemgerät. Diese neue Methode ermöglicht die Gewinnung von Submillimeter-Clustern von Fettgewebe, die für In-vivo-Transplantationen, In-vitro-Kulturen und weitere Zellisolation und -charakterisierung geeignet sind.

Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

Wir beschreiben ein 3D-Human-Human-Extrazellmatrix-Adipozyten-In-vitro-Kultursystem, das die Zerlegung der Rollen der Matrix und der Adipozyten bei der Kodipierung des metabolischen Phänotyps des Fettgewebes ermöglicht.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methodik zur ADSC-Isolierung, die im Vergleich zur Literatur zu einer enormen zellulären Ausbeute mit Zeitgewinn führt. Diese Studie bietet auch eine einfache Methode, um eine relativ große Anzahl lebensfähiger Zellen nach langfristiger Kryokonservierung zu erhalten.

Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Das Fettgewebe ist eine ausgezeichnete Quelle für mesenchymale Stammzellen. Hier bringen wir die Schritt-für-Schritt-Extraktion, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe von Schweizer Mäusen an.

Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus

Hier präsentieren wir eine Standardmethode zur effizienten Isolierung von fettabgeleiteten Stammzellen und Adipozyten, gekennzeichnet durch &gt;90 % Verkürzung der Verarbeitungszeit, hohe Zelllebensfähigkeit und breite Kompatibilität.

Effiziente Isolierung von fett-abgeleiteten Stammzellen und Adipozyten aus schweine-fetthaltigem Gewebe

Lernen Sie eine xenogenfreie Methode zur Isolierung und Kultivierung humaner Fettstammzellen für die Zelltherapie. Diese Technik gewährleistet Biosicherheit und ist für klinische Anwendungen reproduzierbar.

Isolierung und Kultivierung von humanen Fettstammzellen mit einer innovativen xenogenfreien Methode für die Humantherapie

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