Name: Messung der Lipolyserate in ex vivo murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten, die in vitro differenziert wurden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Messung der Lipolyserate in murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Vergleiche zwischen Genotypen und Behandlungen für metabolische Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der US National Institutes of Health R01DK126944 an S.M.R.

Die Verwendung aller Tiere wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Weill Cornell Medical College der Cornell University genehmigt.
1. Vorbereitung von Puffern und Sammelplatten
<ol><li>Stellen Sie 5 % Kälberserumalbumin (BSA) her, indem Sie 5 g BSA in 100 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) ohne Phenolrot auflösen. Rühren Sie das BSA vorsichtig um, damit es sich auflöst (Schütteln ist kontraproduktiv). Sobald das BSA vollständig aufgelöst ist, sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter. Lagern Sie die BSA-Medien bis zu 1 Monat bei 4 °C.</li>
	<li>Stellen Sie Arbeitskonzentrationen von Kontroll- und Stimulationsmedien her. Steuermedien: 5% BSA-Medien mit Fahrzeugsteuerung. Stimulationsmedien: 5% BSA-Medien mit 0,5 μM CL-316,243. Stellen Sie für jedes Experiment neue Stimulationsmedien her.</li>
	<li>Erwärmen Sie das zu verwendende Medium auf 37 °C. Beschriften Sie eine 96-Well-Platte für die Mediensammlung.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>Führen Sie die Zellkultur wie unten beschrieben durch. Führen Sie alle Zellarbeiten in einem sterilen Abzug durch, um die Kontamination von außen zu minimieren.<ol><li>Isolieren und differenzieren Sie primäre Präadipozyten, wie in73,74.<ol><li>Platte primäre Präadipozyten mit hoher Dichte, z. B. 1 x 105 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte in 1 ml/Well Kulturmedium (15 % fetales Kälberserum (FBS) und 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin in DMEM/F12).</li>
			<li>Nachdem die Zellen eine 100%ige Konfluenz erreicht haben, differenzieren Sie 3 Tage lang mit 5 μM Dexamethason, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin, 1 μg/ml Insulin und 1 μM Thiazolidindion (TZD) in Nährmedien. Wechseln Sie dann für mindestens 3 Tage zu Nährmedien mit 1 μg/ml Insulin, um Lipidtröpfchen zu züchten. Verwenden Sie 1 ml/Vertiefung des Mediums in der 24-Well-Platte.</li>
			<li>Wechseln Sie das Nährmedium (1 ml/Well) alle 2 bis 3 Tage mit Insulin. Die Zellen können bis zu 2 Wochen in Medien mit Insulin gehalten werden. Verwenden Sie für diesen Assay nur Kulturen, in denen die Differenzierungsraten über 90 % liegen und in allen Gruppen ähnlich sind, da eine reduzierte Differenzierung als Verringerung der lipolytischen Rate fehlinterpretiert werden könnte.</li>
			<li>Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in insulinfreien Medien, bevor Sie die Lipolyse messen. HINWEIS: Insulin im Medium hält die Lipidtröpfchen aufrecht, hemmt aber auch die Lipolyse. Die Inkubation ohne Insulin für 24 h ermöglicht eine vollständige lipolytische Aktivierung ohne Verlust des Lipidtröpfchenvolumens. In einigen Systemen muss die Kulturzeit ohne Insulin möglicherweise verkürzt oder verlängert werden.</li>
		</ol></li>
		<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, um Serumreste aus dem Nährmedium zu entfernen. HINWEIS: Dieses Protokoll beinhaltet keinen Serummangel, der die Lipolyse aktivieren kann. Die Serumverhungerung kann nach Ermessen des Forschers eingesetzt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Ex-vivo-Kultur wie unten beschrieben durch.<ol><li>Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, mit einer Vertiefung für jedes Gewebe, das von jeder Maus entnommen werden soll. Geben Sie 4 ml DMEM bei Raumtemperatur in jede zu verwendende Vertiefung. HINWEIS: BSA in den Sammelmedien ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 48-Well-Platte für den Lipolyse-Assay vor, mit einer Well für jedes Replikat. Geben Sie 400 μl DMEM bei Raumtemperatur in jede zu verwendende Vertiefung. Verwenden Sie zwei bis vier Kontroll- und zwei bis vier stimulierte Vertiefungen pro Gewebe und Maus.</li>
		<li>Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation unter Narkose mit einer sekundären Methode wie einem bilateralen Pneumothorax. Hier verwendeten wir eine 32 g schwere, 7 Monate alte weibliche C57BL/6J-Maus, die 4 Monate lang mit einer 45% fettreichen Diät gefüttert wurde. HINWEIS: Dieses Protokoll kann auch für Männer sowie für andere Sorten, Diäten und Altersgruppen verwendet werden.</li>
		<li>Mit 70%igem Ethanol besprühen und mit einer Schere einen kleinen (~ 1 cm) seitlichen Schnitt in der Mitte der Bauchhaut machen, die Haut auseinanderziehen, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten zusammendrücken und die untere Bauchhaut umklappen, um die hinteren subkutanen Depots freizulegen. Lokalisieren und entfernen Sie den inguinalen Lymphknoten und stumpf präparieren Sie das inguinale Fettgewebe unmittelbar hinter dem inguinalen Lymphknoten mit einer Pinzette.</li>
		<li>Um das Gonadenfettgewebe zu gewinnen, machen Sie einen lateralen und einen vertikalen Schnitt im Bauchfell, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten. Halten Sie das Gonadenfettpolster mit einer Pinzette fest und schneiden Sie entlang der Gebärmutter (oder des Nebenhodens bei Männern), um das Gonadenfettgewebe zu entfernen. Legen Sie die gesammelten Depots in eine 6-Well-Platte.</li>
		<li>Entfernen Sie das Taschentuch aus der Vertiefung, legen Sie es auf eine Silikonmatte und schneiden Sie es mit einer Schere in 5 bis 7 mg große Stücke.</li>
		<li>Wiegen Sie 25 bis 30 mg (fünf oder sechs Stücke) für jede Assay-Vertiefung ab und geben Sie sie in eine 48-Well-Assay-Platte. Tupfen Sie das Taschentuch vor dem Wiegen auf ein sauberes Handtuch, um alle Medien zu entfernen. Wiegen Sie das Gewichtsboot nach der Entnahme des Gewebes und notieren Sie das Gewicht der zurückgebliebenen Rückstände. Wischen Sie das Gewichtsboot zwischen den Proben sauber und tarieren Sie es bei Bedarf erneut. Verwenden Sie für jedes Gewebe ein neues Gewichtsschiffchen.</li>
		<li>Nachdem alle Gewebeproben gewogen wurden, legen Sie die 48-Well-Assay-Platte für 15 Minuten in einen Inkubator mit 10 % CO2 bei 37 °C und 10 %.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lipolyse-Assay
<ol><li>Führen Sie die Mediensammlung durch. Führen Sie den Transfer des Mediums und die anschließende Probenentnahme in einem sterilen Abzug durch, um eine mögliche Kontamination durch externe Quellen zu minimieren.<ol><li>Entfernen Sie bei t = 0 das Medium und fügen Sie 400 μl pro Well Kontroll- oder Stimulationsmedium hinzu, und stellen Sie die Assay-Platte in einen Inkubator mit 37 °C und 10 % CO2 . Bei Ex-vivo-Gewebekulturen ist das Medium vorsichtig mit einer Pipette zu entfernen. Die Absaugung sollte niemals verwendet werden. Anmerkungen: Alternativ können Sie eine zweite Platte mit Kontroll- und Stimulationsmedien vorbereiten und das Gewebe übertragen.</li>
		<li>Bei t = 1, 2, 3 und 4 h werden 200 μl Medium gesammelt, durch 200 μl des entsprechenden Kontroll- oder Stimulationsmediums ersetzt und die Assayplatte in den Inkubator zurückgelegt. Lagern Sie den Auffangteller bei 4 °C. Um die FFA-Pufferkapazität der BSA-Medien zu ermitteln, verwenden Sie eine zusätzliche Sammlung nach 24 h. HINWEIS: Die Experimente können hier gestoppt und die gesammelten Medien bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kolorimetrischer FFA-Assay
<ol><li>Erwärmen Sie die Reagenzien auf Raumtemperatur und lösen Sie eine Flasche Farbreagenz A mit einer Flasche Lösungsmittel A und eine Flasche Farbreagenz B mit einer Flasche Lösungsmittel B auf. Ab dem Datum der Rekonstitution werden diese Reagenzien am besten innerhalb von 1 Woche verbraucht. 1 Monat nach der Rekonstitution verwerfen.</li>
	<li>Tauen Sie die Proben auf und mischen Sie sie.</li>
	<li>Erstellen Sie eine FFA-Standardkurve. Die Standardlösung ist 1 mM. Verwenden Sie das folgende Volumen mit den Reagenzien für die Standardkurve: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 Verdünnung), 10 μL (1:4 Verdünnung), 10 μL (1:8 Verdünnung) und 10 μL Wasser für maximale Reichweite. Für niedrige FFA-Spiegel können 10 μl mit 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM und 0,05 mM Standard besser geeignet sein.</li>
	<li>Pipettieren Sie Standards und Proben in eine 96-Well-Assay-Platte. Das empfohlene Probenvolumen beträgt 10 μl. Fügen Sie drei Vertiefungen mit dem gleichen Volumen an BSA-Medien wie die Proben zur Hintergrundkorrektur hinzu. Anmerkungen: Wenn die Probenkonzentrationen außerhalb des Bereichs der Standardkurve liegen, wiederholen Sie den Assay und stellen Sie das Probenvolumen auf 2-25 μl ein.</li>
	<li>Geben Sie 150 μl Reagenz A in jede Vertiefung und mischen Sie. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen. Lass alle Blasen mit einer feinen Nadel platzen. Inkubieren Sie die Assayplatte bei 37 °C für 5 min.</li>
	<li>Lesen Sie die Absorption der Platte bei 550 nm und 660 nm Referenz ab (Messwert A).</li>
	<li>Geben Sie 75 μl Reagenz B in jede Vertiefung und mischen Sie. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen. Lass alle Blasen mit einer feinen Nadel platzen. Inkubieren Sie die Assayplatte bei 37 °C für 5 min.</li>
	<li>Lesen Sie die Absorption der Platte erneut bei 550 nm und 660 nm Referenz ab (Messwert B).</li>
</ol>5. Kolorimetrischer Glycerin-Assay
<ol><li>Rekonstituieren Sie das freie Glycerin-Reagenz mit 36 ml Reinstwasser und akklimatisieren Sie es auf Raumtemperatur. Diese Reagenzien werden am besten innerhalb weniger Wochen verwendet. 2 Monate nach der Rekonstitution verwerfen.</li>
	<li>Tauen Sie die Proben auf und mischen Sie sie.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Glycerin-Standardkurve, indem Sie eine siebenstufige, 2-fache serielle Verdünnung der Glycerin-Standardlösung und einen Wasserrohling vornehmen. HINWEIS: Die Standardkurve ist bis zu 25 μl 2,8 mM Glycerin relativ linear, bei höheren Konzentrationen jedoch nicht linear.</li>
	<li>Pipettieren Sie jeweils 25 μl Standard und Proben in die 96-Well-Assay-Platte. Fügen Sie drei Vertiefungen mit dem BSA-Medium zur Hintergrundkorrektur hinzu.</li>
	<li>Geben Sie 175 μl freies Glycerinreagenz in jede Vertiefung und mischen Sie. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen. Lass alle Blasen mit einer feinen Nadel platzen. Inkubieren Sie die Assayplatte bei 37 °C für 5 min.</li>
	<li>Lesen Sie die Absorption der Platte bei 540 nm ab.</li>
</ol>6. Berechnung der lipolytischen Rate
<ol><li>Beginnen Sie mit den Werten für die optische Dichte (OD). Verwenden Sie für Glycerin direkt die OD-Werte vonA 540 . Berechnen Sie den OD des FFA-Assays nach der folgenden Formel: OD = (Messwert B: A 550 - A 660) - (Messwert A: A550 - A 660)</li>
	<li>Verwenden Sie die Standardkurve, um die FFA- und Glycerinwerte in den gesammelten Proben zu berechnen. Zeichnen Sie die Standard-OD-Werte auf der y-Achse auf und verwenden Sie auf der x-Achse Standardkonzentrationen relativ zum Probenvolumen (d. h. die Konzentration der Wells mit 20 μl 1 mM FFA-Standard auf einer Platte mit 10 μl-Proben entspricht 2 mM). Passen Sie eine lineare Trendlinie an: y = mx + b</li>
	<li>Untersuchen Sie die Standardkurve visuell und entfernen Sie alle Punkte, die außerhalb des linearen Bereichs des Assays liegen. Berechnen Sie die Probenkonzentrationen mit der folgenden Gleichung: Probenkonzentration: x = (OD - b) ÷ m</li>
	<li>Passen Sie Proben an, die außerhalb des linearen Untersuchungsbereichs liegen, und untersuchen Sie sie erneut. Um die endgültige Probenkonzentration zu erhalten, subtrahieren Sie die Konzentration der Hintergrundvertiefungen, die nur BSA-Medien enthalten, von der Konzentration der Proben.</li>
	<li>Berechnen Sie die Mol FFA und Glycerin, die von jeder Probe zu jedem Zeitpunkt produziert werden, gemäß der Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65106/65106eq01.jpg" style="margin: auto;"> wobei C n = Konzentration zum Zeitpunkt t = n; Vt = Gesamtvolumen im Bohrloch; Vs = Probenentnahmevolumen; und M n = Mol, die zum Zeitpunkt t = n produziert werden (wenn die Konzentrationen in mM und die Volumina in ml angegeben sind, beträgt die Ausgabe μMol). Zum Beispiel zu verschiedenen Zeitpunkten: M 1 = C1 × Vt M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs oder M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s</li>
	<li>Normalisieren Sie das Gewebegewicht, indem Sie es durch das Gewebegewicht für jede Probe in Gramm dividieren, um Einheiten von μmol/g zu erhalten. Für kultivierte Zellen werden die Werte als μmol/well angegeben. Stellen Sie sicher, dass die Zellzahl und die Differenzierungseffizienz von Well zu Well vergleichbar sind. HINWEIS: Unterschiede in der Proliferations- oder Differenzierungseffizienz erschweren die Interpretation der Ergebnisse und erfordern eine andere Methode der Normalisierung (z. B. Normalisierung auf Protein; siehe Diskussion).</li>
	<li>Berechnen Sie die Steigung der erzeugten μmol/g (y-Achse) über der Zeit (x-Achse) für jede Probe einzeln.<ol><li>In einer Tabellenkalkulation kann dies mit der Funktion =SLOPE(known_ys,known_xs) erfolgen. Geben Sie in einer neuen Zelle "=SLOPE" ein (markieren Sie dann mit dem Cursor die Glycerin- oder FFA-Werte der Probe in μmol/g und markieren Sie dann die entsprechenden Zeitwerte).</li>
		<li>Überprüfen Sie die Linearität der Daten. R2-Werte sind eine schnelle Möglichkeit, die Linearität der Proben zu bestimmen. In einer Tabellenkalkulation kann dies mit der Funktion =RSQ(known_ys,known_xs) auf die gleiche Weise wie in Schritt 6.7.1 beschrieben erfolgen, aber die anfängliche Eingabe ist =RSQ. Stellen Sie sicher, dass die R2-Werte &gt; 0,98 liegen. Niedrigere Werte weisen auf eine Abweichung von der Linearität hin. Dies kann durch einen Mess-/Abtastfehler oder einen Verlust der Linearität entstehen.<ol><li>Eine andere Möglichkeit, die Linearität zu testen, besteht darin, eine lineare Regression für jede Stichprobe durchzuführen und die Residuen darzustellen. Generieren Sie in einer statistischen Analysesoftware eine XY-Tabelle mit einem einzelnen Y-Wert für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie Analysieren &gt; Einfache lineare Regression aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Residualdiagramm , bevor Sie auf OK klicken. Das Residuendiagramm wird als neues Diagramm angezeigt.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie die FFA- und Glycerinproduktionsrate (d. h. die Steigung [(μmol/g/h]) für jede Probe als individuellen Datenpunkt, um statistische Analysen durchzuführen und Werte darzustellen, wenn verschiedene lipolytische Bedingungen verglichen werden. Wenn lipolytische Raten über Genotypen hinweg verglichen werden, verwenden Sie zwei oder drei Proben pro Tier als technische Replikate und verwenden Sie den Durchschnitt für einen Datenpunkt pro Tier, so dass die Stichprobengröße gleich der Anzahl der Tiere ist.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier stellen wir ein grundlegendes Protokoll zur Messung der Lipolyserate in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe zur Verfügung. Um die Lipolyse zu quantifizieren, ist es wichtig, die lipolytische Rate in der linearen Phase zu messen. Wir verwenden eine serielle Probenahmetechnik, bei der ein großer Teil der Medien gesammelt und in regelmäßigen Abständen durch frische Medien ersetzt wird. Diese semikonservative Methode ermöglicht die Zugabe von frischem BSA mit FFA-Pufferkapazität und verzögert die Rückkopplungshem...

Überschüssige Nährstoffe werden im weißen Fettgewebe in Form von Triglyceriden im neutralen Lipidkern der Lipidtröpfchen gespeichert. Triglyceridspeicher werden über Lipolyse mobilisiert, ein Prozess, bei dem die Fettsäureseitenketten nacheinander durch Fettgewebe-Triglyceridlipase (ATGL), hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoglyceridlipase (MGL) gespalten werden, was zur Freisetzung freier Fettsäuren (FFAs) und des Glycerinrückgratsführt 1,2. Die Lipolyse wird durch Katecholamin-Signalübertragung im Fettgewebe aktiviert. Sympathische Nervenendigungen setzen lokal Katecholamine frei, die an β-adrenerge Rezeptoren auf der Plasmamembran der Adipozyten binden. Nach der Ligandenbindung aktivieren diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) die Adenylylcyclase über Gαs. Die anschließende Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) durch cAMP führt zu einer Hochregulation sowohl von ATGL als auch von HSL. Die Phosphorylierung von Perilipin-1 durch PKA bewirkt die Dissoziation von ABHD5 (auch bekannt als CGI-58), das ATGL3 bindet und koaktiviert. PKA phosphoryliert HSL direkt und fördert seine Translokation vom Zytosol zum Lipidtröpfchen, wo die Interaktion mit phosphoryliertem Perilipin-1 die Lipaseaktivität weiter fördert 4,5,6,7. Die dritte Lipase, die an der Lipolyse beteiligt ist, MGL, scheint nicht durch den Katecholamin-Signalweg reguliertzu werden 8. Wichtig ist, dass die Triglyceridsynthese in Adipozyten durch den Glycerinlipidsyntheseweg vermittelt wird, bei dem keine Monoglyceride als Zwischenprodukt gebildet werden. Stattdessen katalysieren Glycerin-3-phosphat-Acyltransferasen die Bildung von Lysophosphatidsäure, die mit einem anderen Fettacyl-CoA zu Phosphatidsäure kombiniert und dann vor der endgültigen Synthese von Triglyceriden zu Diglyceriden isomerisiert wird (Abbildung 1)9,10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65106/65106fig01.jpg"> Abbildung 1: Lipolyse- und Glycerinlipidsynthesewege. Oben: Lipolytischer Weg; Rot dargestellte Enzyme: Fettgewebe-Triglyceridlipase (ATGL), hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoglyceridlipase (MGL). Unten: Glycerin-Lipid-Syntheseweg; Grün dargestellte Enzyme: Diglycerid-Acyltransferase (DGAT), Phosphatidsäure-Phosphatase (PAP), Lysophosphatidsäure-Acyltransferase (LPAT, auch bekannt als LPAATs) und Glycerin-3-Phosphat-Acyltransferase (GPAT). Lipide: Triglyceride (TG), Diglyceride (DG), Monoglyceride (MG), freie Fettsäuren (FFA), Fettacyl-CoA (FA-CoA), Lysophosphatidsäure (LPA) und Phosphatidsäure (PA). Weitere Metaboliten: anorganisches Phosphat (Pi) und Glycerin-3-phosphat (G3P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65106/65106fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Extrazelluläres Adenosin ist ein weiterer wichtiger Regulator der Lipolyse, der durch Gs- und Gi-gekoppelte GPCRs die Aktivität der Adenylcyclase beeinflusst. Der in Adipozyten vorherrschende Adenosinrezeptor ADORA1 hemmt die Adenylylcyclase und damit die Lipolyse durch die Aktivierung von Gi12. ADORA2A wird in niedrigeren Konzentrationen und vor allem in braunen Adipozyten exprimiert und aktiviert die Lipolyse über den Gs-Signalweg 13. ADORA1 beeinflusst sowohl die basale Lipolyse als auch die Reaktion auf adrenerge Agonisten. Die Wirkung von Adenosin auf die Lipolyse kann durch Zugabe von Adenosin-Deaminase zur Neutralisierung von Adenosin sowie des ADORA1-spezifischen Agonisten Phenylisopropyladenosin14,15 kontrolliert werden. Die hormonelle Aktivierung von G q-gekoppelten GPCRs kann auch die Lipolyse über die Aktivierung der Phospholipase C und der Proteinkinase Cbeeinflussen 16,17,18,19. Entzündungssignale wirken sich auch auf die lipolytischen Raten aus. Die Aktivierung von TLR4 durch LPS (und andere Endotoxine) erhöht die lipolytische Rate durch die Aktivierung von ERK, das Perilipin-1 und HSL20 phosphoryliert. TNF-α aktiviert auch die Lipolyse über ERK- und NF-κB-Aktivierung sowie die transkriptionelle Herunterregulierung der Phosphodiesterase PDE-3B und CIDEC21,22,23. IL-6 wurde auch mit einer erhöhten Lipolyse von Adipozyten in Verbindung gebracht, insbesondere im mesenterialen Fettgewebe, dessen FFA-Freisetzung die Lebersteatose und die Gluconeogenese beeinflusst24,25,26.
Die Lipolyse wird im gefütterten Zustand durch Insulin unterdrückt. AKT phosphoryliert und aktiviert PDE-3B, um den cAMP-Signalweg zu unterdrücken und die PKA-Aktivierung zu verhindern27. Insulin reguliert ATGL28 auch transkriptionell herunter. Adipositas fördert die Katecholaminresistenz durch eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich der Herunterregulierung von β-adrenergen Rezeptoren in Adipozyten 29,30,31,32,33. Adipozyten exprimieren alle drei β-adrenergen Rezeptoren (β-1, β-2 und β-3). Während β-1 und β-2 adrenerge Rezeptoren ubiquitär exprimiert werden, wird der β-3 adrenerge Rezeptor in Mäusen überwiegend in Adipozyten exprimiert34,35. Die Expression von Adrb3 wird durch C/EBPα während der Adipogenese induziert36. Der adrenerge Rezeptor β-3 wird in reifen Adipozyten stark exprimiert. Die Aktivierung von β-1 und β-2 adrenergen Rezeptoren ist aufgrund der Rückkopplungshemmung durch β-Arrestin37 selbstlimitierend. Die Hemmung der Rückkopplung des β-3-adrenergen Rezeptors wird durch andere Signalwege vermittelt, die die Adrb3-Expression reduzieren33,38,39.
Zahlreiche Verbindungen können verwendet werden, um die Lipolyse der Adipozyten zu aktivieren. Katecholamine sind wichtige physiologische Aktivatoren der Lipolyse. Noradrenalin (oder Noradrenalin) und Adrenalin (oder Adrenalin) aktivieren alle drei β-adrenergen Rezeptoren40. Noradrenalin und Adrenalin beeinflussen die Lipolyse auch durch die Aktivierung des α-adrenergen Rezeptorsignals41. Häufig verwendete β-adrenerge Rezeptoragonisten sind Isoproterenol, ein nicht-selektiver β-adrenerger Rezeptoragonist, und die β-3-Adrenosensor-Agonisten CL-316,243 und Mirabegron42. Da Adipozyten überwiegend den β-3 adrenergen Rezeptor exprimieren, verwenden wir hier CL-316.243 als Beispiel. Seine Spezifität für den β-3-adrenergen Rezeptor macht es auch zu einem relativ spezifischen Aktivator der Adipozyten-Katecholamin-Signaltransduktion, der auch sicher in vivo verwendet werden kann. Beachten Sie, dass die üblicherweise verwendete Konzentration von 10 μM CL-316,243 in Zellkultur um Größenordnungen höher ist als die ~0,1 μM-Dosis, die erforderlich ist, um ein maximales Ansprechen zu erreichen33. Forskolin umgeht den adrenergen Rezeptor und aktiviert direkt die Adenylylcyclase und die nachgeschaltete lipolytische Signalübertragung. Es gibt noch viele weitere Aktivatoren sowie Unterdrücker der Lipolyse. Bei der Auswahl einer Verbindung zur Stimulierung der Lipolyse sollten die Rezeptorspezifität und die nachgeschalteten Signalwege innerhalb des experimentellen Designs sorgfältig berücksichtigt werden.
Die Lipolyserate im weißen Fettgewebe ist ein wichtiger Stoffwechselfaktor, der sich auf die Kältetoleranz und die Nährstoffverfügbarkeit während des Fastens oder der körperlichen Betätigung auswirkt43,44,45,46. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Lipolyserate in Adipozyten und Fettgewebe zu messen, was das Verständnis des Adipozytenstoffwechsels und dessen Auswirkungen auf den metabolischen Phänotyp verschiedener Mausmodelle erleichtern wird. Um die lipolytische Rate zu quantifizieren, messen wir das Vorkommen lipolytischer Produkte in den Medien (d.h. FFAs und Glycerin). Die Methode beruht auf der Freisetzung lipolytischer Produkte aus den Adipozyten in das Medium. Da weiße Adipozyten geringe Mengen an Glycerinkinase exprimieren, sind die Glycerin-Wiederaufnahmeraten niedrig47. Umgekehrt sollte auch die Produktion von FFAs und Glycerin über andere Stoffwechselwege als die Lipolyse in Betracht gezogen werden. Adipozyten scheinen eine Phosphatase mit Aktivität gegen Glycerin-3-Phosphat zu exprimieren, was die Produktion von Glycerin aus Glycerin-3-phosphat ermöglicht, das aus Glukoseabgeleitet wird 48,49,50. Die Glykolyse ist eine Quelle für Glycerin-3-phosphat, die für die FFA-Wiederveresterung in weißen Adipozyten verwendet wird. Wenn der Glukosespiegel begrenzt ist, benötigt die Glyceroneogenese andere 3-Kohlenstoffquellen wie Laktat undPyruvat 51. Die Kanalisierung von FFAs, die durch Lipolyse innerhalb der Zelle freigesetzt werden, und ihr metabolisches Schicksal sind nur unzureichend verstanden. FFAs, die durch Lipolyse freigesetzt werden, müssen in Fettacyl-CoA umgewandelt werden, bevor sie wieder verestert oder einer β-Oxidation unterzogen werden. Es scheint, dass FFAs, die durch Lipolyse freigesetzt werden, wahrscheinlich die Zelle verlassen, bevor sie wieder aufgenommen und in Fettacyl-CoA umgewandeltwerden 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFAs können außerhalb der Zelle durch Albumin sequestriert werden. Wichtig ist, dass langkettige FFAs dafür bekannt sind, die Lipolyse rückkopplungshemmend zu sein, wenn sie nicht durch Albumin 63,64,65,66,67 sequestriert werden. Daher ist die Optimierung der FFA-Pufferkapazität des Mediums während des Lipolyse-Assays von entscheidender Bedeutung. Das hier beschriebene Verfahren ähnelt den bisher veröffentlichten Methoden zur Messung der lipolytischen Rate in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen und Menschen 15,68,69,70,71. Dieses Protokoll unterscheidet sich durch die Verwendung von seriellem Sampling; Durch die Durchführung von seriellen Abtastungen können wir intern überprüfen, ob die Lipolyse in der linearen Phase gemessen wird, und mehrere Messungen verwenden, um die Lipolyserate zu berechnen, wodurch Messfehler reduziert werden, um das Vertrauen in den endgültigen berechneten Wert zu erhöhen. Der Nachteil der seriellen Probenahme besteht darin, dass der Assay mehr Zeit und Reagenzien benötigt. Der längere Zeitrahmen verringert jedoch die Auswirkungen von Messfehlern auf den Standardfehler der Schätzungen des Satzes. Darüber hinaus misst dieses Protokoll sowohl die FFA- als auch die Glycerinfreisetzung und berücksichtigt das Verhältnis von FFA:Glycerinfreisetzung mit dem Ziel, ein Verhältnis von 3:1 zu erreichen, wie es bei vollständiger Lipolyse und Freisetzung von lipolytischen Produkten in das Medium zu erwarten wäre72.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Platte mit Gewebekultur behandelt</td><td>Corning Inc</td><td>3527</td><td>Muss zur Adipozytendifferenzierung mit Gewebekultur behandelt</td></tr> werden <tr><td>48-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>und Deckel Corning Inc</td><td>353078</td><td>Kann mit Gewebekulturen behandelt werden</td></tr><tr><td>6-Well-Platte mit flachem Boden und Deckel</td><td>Corning Inc</td><td>353046</td><td>Kann mit Gewebekulturen behandelt werden</td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Platte</td><td>USA sceintific</td><td>1402-9100</td><td>Jede konische 0,2-ml-PCR-Platte ist praktisch&nbsp;</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>FFA-freies BSA wie A8806 wird ebenfalls häufig verwendet. Die BSA sollte keine nachweisbare FFA haben, auch Schwankungen der BSA von Charge zu Charge können die beobachtete Lipolyserate beeinflussen</td></tr><tr><td>CL-316,243</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5976</td><td>CAS #: 138908-40-4 von anderen Lieferanten erhältlich</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVH</td><td>CO2 sollte idealerweise auf 10% für Fettgewebe eingestellt werden, 5% CO2 funktionieren jedoch auch</td></tr><tr><td>DMEM, niedrige Glukose, kein Phenolrot</td><td>Thermofischer</td><td>11054020</td><td>Alle phenolrotfreien Medien sollten funktionieren, DMEM/F12, RPMI, sollten aber flüchtige Pufferkapazität enthalten, d.h. Biocarbonat</td></tr><tr><td>FFA-freies Rinderserumalbumin</td><td>Equitech-Bio, Inc,&nbsp;</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Freies Glycerin Reagenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin Standardlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7793&nbsp;</td><td>Dies kann auch durch Verdünnen von Glycerin auf die gewünschte Konzentration erfolgen</td></tr><tr><td>HR-Serie NEFA Standardlösung</td><td>Fujifilm</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>HR-Serie NEFA-HR (2) Farbreagenz A</td><td>Fujifilm</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR-Serie NEFA-HR (2) Farbreagenz B</td><td>Fujifilm</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR-Serie NEFA-HR (2) Lösungsmittel A&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR Serie NEFA-HR (2) Lösemittel B&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologischer Inkubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>S28668</td><td>Jeder Inkubator bei 37C kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well-Platten</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>Jede optisch klare 96-Well-Platte mit flachem Boden funktioniert</td></tr><tr><td>Silikon-Labor-Tischmatte</td><td>VWR</td><td>76045-300</td><td>Glasplatte kann ebenfalls verwendet werden. Absorbierende Oberflächen werden nicht empfohlen</td></tr><tr><td>Spektralphotometer/Mikroplatten-Reader</td><td>Molekulare Geräte</td><td>SpectraMax i3x&nbsp;</td><td>Jeder Plattenleser, der mit 540, 550 und 660 mm lesen kann, funktioniert</td></tr><tr><td>V Rinderserum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>WypAll X70 Scheibenwischer</td><td>Kimberly-Clark</td><td>41200</td><td>Jedes hochwertige Papiertuch funktioniert</td></tr></tbody></table>

messung der lipolyserate in ex vivo murinem fettgewebe und primären präadipozyten, die in vitro differenziert wurden

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipozyten speichern Energie in Form von Triglyceriden in Lipidtröpfchen. Diese Energie kann über die Lipolyse mobilisiert werden, bei der die Fettsäureseitenketten nacheinander vom Glycerinrückgrat abgespalten werden, was zur Freisetzung freier Fettsäuren und Glycerin führt. Aufgrund der geringen Expression der Glycerinkinase in weißen Adipozyten sind die Wiederaufnahmeraten von Glycerin vernachlässigbar, während die Wiederaufnahme von Fettsäuren durch die Fettsäurebindungskapazität von Medienkomponenten wie Albumin bestimmt wird. Sowohl die Freisetzung von Glycerin als auch von Fettsäuren in Medien kann durch kolorimetrische Assays quantifiziert werden, um die lipolytische Rate zu bestimmen. Durch die Messung dieser Faktoren zu mehreren Zeitpunkten kann man die lineare Lipolyserate mit hoher Sicherheit bestimmen. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Messung der Lipolyse in in vitro differenzierten Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen zur Verfügung. Dieses Protokoll kann auch für andere Präadipozyten-Zelllinien oder Fettgewebe aus anderen Organismen optimiert werden. Überlegungen und Optimierungsparameter werden diskutiert. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Rate der Adipozyten-Lipolyse zwischen Mausmodellen und Behandlungen zu bestimmen und zu vergleichen.

Wir maßen die basale und stimulierte lipolytische Rate von in vitro differenzierten Adipozyten. Primäre Präadipozyten aus inguinalem weißem Fettgewebe wurden durch die Behandlung konfluenter Zellen mit 5 μM Dexamethason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml Insulin und 1 μM Troglitazon über 4 Tage zu Adipozyten differenziert, gefolgt von einer zusätzlichen 3-tägigen Behandlung mit 1 μg/ml Insulin. Die Zellen wurden vor dem Lipolyse-Assay 24 h lang in Medien ohne Insulin inkubiert. Zum Zeitpunkt = 0h wurden die Zellen einmal mit...

Die Triglycerid-Lipolyse in Adipozyten ist ein wichtiger Stoffwechselprozess, der zur Freisetzung von freien Fettsäuren und Glycerin führt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen und stimulierten Lipolyse in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen zur Verfügung.

Messung der Lipolyserate in ex vivo murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten, die in vitro differenziert wurden

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Dieses Protokoll beschreibt die Bestimmung der Rate der Adipozytenlipolyse in kultivierten Adipozyten oder ex vivo Fettgewebe und ermöglicht den Vergleich der lipolytischen Raten zwischen murinen Modellen oder Behandlungen. Dieses Protokoll verwendet serielle Abtastung, die es ermöglicht, intern zu überprüfen, ob die Lipolyse in der linearen Phase gemessen wird, und den Messfehler zu reduzieren. Mit Optimierung kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Lipolyse in braunem Fettgewebe, Fettgewebe anderer Organismen oder adipogenen Zelllinien zu messen.Ex-vivo-Gewebe müssen in kleine Stücke von gleichbleibender Größe und Form zerkleinert werden, um die Sequestrierung der freigesetzten freien Fettsäuren durch BSA im Medium zu ermöglichen. Bereiten Sie zunächst das 5%ige BSA-Medium vor, indem Sie fünf Gramm Bovine Serum Albumin (BSA) in 100 Millilitern Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ohne Phenolrot auflösen. Rühren Sie die Lösung vorsichtig um, um das BSA aufzulösen.Bereiten Sie dann Arbeitskonzentrationen von Kontroll- und Stimulationsmedien vor. Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung auf 37 Grad Celsius. Beschriften Sie eine 96-Well-Platte für die Mediensammlung.Füh

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fettgewebe (AT) kann die Homöostase des ganzen Körpers beeinflussen, daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Adipozytendifferenzierung und -funktion zu verstehen. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um neue Einblicke in diese Prozesse zu gewinnen, indem wir die Homöostase, die Differenzierung und die Hypoxie-Exposition der Adipozyten als Modell für die induzierte Apoptose der Adipozyten analysieren.

Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bestimmung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse in Leistenfett-Pads, die aus normaler Chow-Diät (NCD) oder hochfettigen Diät (HFD) ± Capsaicin-gefütterten Wildtyp-Mäusen erhalten wurden. Als Index für die Lipolyse wurde die Glycerinfreisetzung aus Leistenfett-Pads gemessen.

Messung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse bei Inguinal Adipose Fat Pads

Dieses Papier bietet drei einfache und zugängliche Assays zur Beurteilung des Fettstoffwechsels bei Mäusen.

Beurteilung der Ganzkörper-Lipid-Handling-Kapazität bei Mäusen

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Phänotypisierung von mikrovaskulären Endothelzellen aus humanem subkutanem Fettgewebe (hSATMVECs). Zusätzlich beschreiben wir ein experimentelles Modell des hSATMVEC-Adipozyten-Cross-Talks.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Die Größe und Zerbrechlichkeit reifer Adipozyten haben die Techniken und Werkzeuge, die für ihre Untersuchung und Isolierung zur Verfügung stehen, eingeschränkt. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung reifer muriner Adipozyten beschrieben, das leicht an verschiedene Fettdepots und Mausdiäten angepasst werden kann.

Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

Mit einem ex-vivo-Explant-Modell werden kleine Stücke des rostralen Anteils des viszeralen weißen Fettgewebes von mageren Mäusen 7–10 Tage lang kultiviert, was die Induktion und Untersuchung der Entzündung von Fettgewebe während der fettreichen Ernährung ermöglicht.

Ein ex vivo Mausmodell für fettreiche, diätähnliche Fettgewebeentzündung

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

Die Eileiter (FT) wird als Alternative vor Ort Ursprungsbezeichnungen für seröse Ovarialkarzinom (SOC) entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Isolierung...

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Erfahren Sie die Messung der Lipolyserate in murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Vergleiche zwischen Genotypen und Behandlungen für metabolische Forschung.

Messung der Lipolyserate in ex vivo murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten, die in vitro differenziert wurden

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