Name: Ferritinophagie: Bewertung des selektiven Abbaus von Eisen durch Autophagie in humanen Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie Ferritinophagie in menschlichen Fibroblasten quantitativ analysiert wird. Diese hochdurchsatzbasierte Immunfluoreszenzmethode ermöglicht die Unterscheidung autophagieabhängiger und unabhängiger Eisenabbauwege für BPAN-Forschung.

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<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Zelllinien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primäre humane Fibroblasten aus der Haut&nbsp;</td><td>Hautbiopsie, gesunder menschlicher Spender, Biobank Universitätsklinik T&uuml; bingen, Ethische Zulassung 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, Passage 9</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturbehandlungen</td><td></td><td></td><td>Endkonzentration (Verbindung)Kontrollmedium</td></tr> <tr><td></td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>(nur DMSO)</td></tr><tr><td>Kontrollmedium + BafilomycinA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>100 nM Bafilomycin A1</td></tr><tr><td>Kontrollmedium + Deferasiox (DFX)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 & Mikro; M DFX</td></tr><tr><td>Kontrollmedium + DFX + BafilomycinA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 &micro; M DFX, 100 nM Bafilomycin A1</td></tr><tr><td>Kontrollmedium + Eisenammoniumcitrat (FAC)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC</td></tr><tr><td>Kontrollmedium + FAC + BafilomycinA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/ml FAC, 100 nM Bafilomycin A1</td></tr><tr><td>Material</td>Albumin [BSA] <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraktion V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 Ziege a-Kaninchen</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 Ziege und Maus</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 10 cm Schalen mit Zellkulturbehandlung</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td><td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ohne Calcium und Magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Eisenammoniumcitrat (FAC)</td><td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FERRITIN (Milz beim Menschen)</td><td>Rockland</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%) mit Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 Well-Glasbodenplatten #0 Cellvis</td><td></td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td><stark>Lösung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,7 % Paraformaldehyd (PFA)</td><td></td><td></td><td>PFA, gelöst in PBS, pH 7,5&nbsp;</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1 100 mM Stamm</td><td></td><td></td><td>Bafilomycin A1 verdünnt in DMSO</td></tr><tr><td>Eisenammoniumcitrat (FAC) 100 mg/ml Stamm</td><td></td><td></td><td>FAC verdünnt in autoklaviertem doppelt destilliertem Wasser</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td><td>PBS, ergänzt mit 10% Tween20&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, ergänzt mit 10% Tween20, 1% BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Version 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferritinophagie: bewertung des selektiven abbaus von eisen durch autophagie in humanen fibroblasten

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

Von der menschlichen Haut stammende primäre Fibroblasten (F-CO-60) von gesunden Spendern (Abbildung 1A) wurden für Ferritinophagie-Bewertungen unter Verwendung einer Baflomycin-A1-Behandlung vorbereitet, gefolgt von einer Immunfärbung von endogenem Ferritin und LAMP2, einer automatisierten Bildanalyse und einer CellProfiler-basierten Analyse (Abbildung 1B).
Die Kolokalisation von endogenem Ferritin und LAMP2 nahm zu, nachdem der lysosomale Abbau von Ferritin durch die Zugabe von Bafilomycin A1 blockiert wurde, was mit seiner Fähigkeit übereinstimmt, lysosomale V-ATPase-Enzyme zu hemmen und somit die Ferritinophagiezu blockieren 7 (Abbildung 2). Darüber hinaus werden beispielhaft die softwarebasierte Zellerkennung, sowie die Ferritin- und LAMP2-Erkennung gezeigt (Abbildung 2).
In diesem Zusammenhang ist zu beachten, dass die hier skizzierte CellProfiler-Pipeline äußerst vielseitig ist und an zusätzliche und/oder alternative Messwerte angepasst werden kann, wie z.B. zur Bewertung der Auswirkungen bestimmter BPAN-Mutationen auf das Zellwachstum, Mitochondrien oder andere Organellen im Rahmen funktioneller Einzelzellmarkersysteme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> Abbildung 1: Experimenteller Überblick. Grafische Darstellung von (A) dem Prozess der Ferritinophagie und (B) dem experimentellen Arbeitsablauf zur Beurteilung der Ferritinophagie in primären menschlichen Fibroblasten aus der Haut, wie in diesem Protokoll beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Bilder. Primäre humane Fibroblasten aus der Haut im Kontrollmedium (Fütterbedingungen) in (A) Abwesenheit oder (B) Anwesenheit von Bafilomycin A1 wurden einer indirekten Immunfluoreszenzanalyse unter Verwendung von Anti-Ferritin- und Anti-LAMP2-Antikörpern unterzogen, während die Zellkerne mit DAPI gefärbt wurden. Vorgestellt werden beispielhafte Fluoreszenzbilder, die mit der Automatisierung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie aufgenommen wurden (Maßstabsbalken: 10 μm). Veränderungen der Ferritin- und LAMP2-Häufigkeit und der Kolokalisation konnten bei lysosomaler Hemmung unter Verabreichung von Bafilomycin A1 beobachtet werden. Die CellProfiler-basierte Analyse wird ebenfalls angezeigt und zeigt die softwareabgeleiteten Bildüberlagerungen von Zellerkennung (violett), Zellkernen (blau), Ferritin (grün), LAMP2 (rot) und co-lokalisierenden Ferritin/LAMP2 (gelb) Punkten. (C) Vergrößerte Bildausschnitte (Maßstabsleiste = 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Die in dieser Studie verwendeten Einstellungen für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Die numerischen CellProfiler-Einstellungen, die in dieser Studie verwendet wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Die in dieser Studie verwendete CellProfiler-Pipeline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Darstellung der CellProfiler-Pipeline (siehe Ergänzende Datei 1) mit Screenshots, die in aufeinanderfolgender Reihenfolge aufgenommen wurden (siehe Tabelle 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Ferritinophagie: Bewertung des selektiven Abbaus von Eisen durch Autophagie in humanen Fibroblasten

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

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Forschung

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Biology

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