Name: Evidenz für EpCAM und Zytokeratin-exprimierende Epithelzellen in normalem menschlichem und murinem Blut und Knochenmark (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Lernen Sie eine reproduzierbare Methode zur Isolierung epithelialer Zellen aus Blut und Knochenmark gesunder Individuen mittels Durchflusszytometrie. Diese Technik ermöglicht kostengünstige Analysen für Entwicklungs- und Stammzellbiologie.

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Josh Monts, Durchflusszytometer-Techniker der Core Facility, Hormel Institute
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, Statistiker, Rutgers University
Wir bedanken uns bei Karen Klein von Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM für ihre redaktionelle Unterstützung.
Diese Arbeit wurde teilweise vom National Institute of Arthritis and Muskuloskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer R21 AR075281 und einem Grant-in-Aid of Research, Artistry and Scholarship, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (Vorschlag #324240) unterstützt. Wir bedanken uns für die Unterstützung durch das Hormel Institute.

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Interessenkonflikte sind nicht bekannt.

In der Literatur gibt es einige Hinweise auf das Vorhandensein von Epithelzellen im Knochenmark. Bisher wurde in der Regel die Rolle von Epithelzellen im Zusammenhang mit Krankheiten und Verletzungen untersucht, z. B. in Leber, Lunge, Magen-Darm-Trakt, Thymusdrüse und Haut14,15,16,17. Über das Vorkommen dieser Epithelzellen im Knochenmark gesunder Personen ist jedoch nicht viel bekannt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methode zu etablieren, mit dem Ziel, Epithelzellen aus normalem Blut und Knochenmark zu identifizieren und zu isolieren. Diese Methode wird das Feld vorantreiben, um herauszufinden, warum Epithelzellen vorhanden sind und welche Rolle sie im Blut und Knochenmark spielen, wenn keine Krankheit vorliegt. Möglicherweise sind diese Zellen Teil der normalen Gewebeerhaltung oder werden bei Verletzungen aktiviert. Das Knochenmark ist ein Speicher für Stammzellen. Es ist jedoch unklar, was die Abstammung dieser Epithelzellen sein könnte. In einer kürzlich erschienenen Arbeit werden aus dem Knochenmark stammende Epithelzellen im Thymus diskutiert, die zunächst EpCAM und den hämatopoetischen Marker CD45 exprimieren und dann nach einer Verletzung im Laufe der Zeit ihre CD45-Expression verlieren15. Untersuchungen aus unserem Labor haben auch das Vorhandensein von CD45+ EpCAM+-Zellen in gesundem Blut und Knochenmark bestätigt, wenn keine Verletzung vorliegt12. Die Rolle dieser Zellen muss jedoch noch geklärt werden.
Es bestand Bedarf an einer reproduzierbaren Methode zur Untersuchung von Epithelzellen im gesunden Knochenmark. Die beschriebene Methode wird helfen, diese Zellen in ihrem Normalzustand weiter zu charakterisieren. Es gibt wichtige Schritte in dieser Methode, um die Reproduzierbarkeit zu erhalten. Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung in der Haube bei der Entnahme des Knochenmarks von Mäusen. Bei der Ernte von mehreren Mäusen wird eine Kreuzkontamination zwischen den Proben vermieden, indem für jede Maus neue Nadeln und Spritzen verwendet werden. Dadurch wird auch sichergestellt, dass die Probe sauber und frei von Verunreinigungen ist, die die Ergebnisse beeinträchtigen könnten. Darüber hinaus sollte die Anzahl der vorbereiteten Spritzen und beschrifteten konischen Röhrchen für jede weitere Maus erhöht werden. Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, die Knochen zu spülen, bis eine saubere weiße Farbe sichtbar ist, um sicherzustellen, dass die meisten Knochenmarkzellen entfernt wurden. Die Chancen, seltene Zellen zu erkennen, erhöhen sich in einer reineren Probe. Es wurde eine Modifikation vorgenommen, um das Protokoll zur Lyse der roten Blutkörperchen zu optimieren. Es wurden mehrere Lysepuffer getestet, um den richtigen zu finden, der eine gleichbleibend hohe Viabilität lieferte, da fast die Hälfte der Zellen während dieses Schritts verloren ging. Unterschiedliche Reagenzien und Inkubationszeiten müssen möglicherweise optimiert werden, um in anderen Umgebungen bessere Ergebnisse zu erzielen.
Die bedeutendste Einschränkung dieses Protokolls ist die Verwendung der Durchflusszytometrie zum Auffinden seltener Zellpopulationen. Wie bereits erwähnt, trägt das Hinzufügen von Kontrollen und inkrementellen Zählungen dazu bei, die Spezifität und Genauigkeit der Analyse zu erhöhen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass geeignete Marker für die interessierende Population im Voraus identifiziert werden müssen. Daher muss man über wichtige Marker, Antikörper für die Durchflusszytometrie und Antikörper, die mit der Zielspezies kompatibel sind, Bescheid wissen.
Diese Methoden stellen eine Verbesserung gegenüber bestehenden Methoden dar, da sie die Einzelzellanalyse zu einem Bruchteil der Kosten des bestehenden automatischen CTC-Isolators und der Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglichen. Darüber hinaus ist die Durchflusszytometrie leichter verfügbar. FACS behielt eine höhere Viabilität der Zellen im Vergleich zu früheren berichteten Ergebnissen unter Verwendung der magnetischen Mikroperlentrennung bei. Schließlich ermöglichen diese Techniken die Trennung von Zellen für nachgelagerte Analysen, wie z. B. die Bulk-RNA-Sequenzierung, die scRNA-Sequenzierung oder die Zellkultur.

Epithelzellen befinden sich in den physischen Barrieren zwischen unserem Körper und der Umwelt und sind in der Lage, Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu erkennen und darauf zu reagieren1. Sie haben eine proliferierende Stammzellnische, die eine Möglichkeit bietet, neues Gewebe umzudrehen und Schäden zu reparieren2. Unser Labor untersucht Stammzellen in den Haarfollikeln der Haut; Die Haut ist ein gutes Modell für die Untersuchung der Proliferation von Epithelgewebe und Stammzellen, da sie leicht sichtbar ist und ein ständiger Zellumsatz stattfindet. Epithelkarzinome sind die häufigste Krebsform, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass Epithelgewebe wie die Haut die erste Verteidigungslinie gegen Umweltkarzinogene sind, was zu hohen Umsatzraten und der Vermehrung von Epithelzellen führt3. Der größte Teil der Epidermis der Haut, die oberste Schutzschicht, besteht aus Keratinozyten, die verschiedene Arten von Keratinen exprimieren, um Halt und Struktur zu bieten4. Patienten mit Epithelkarzinomen haben oft Epithelzellen im Blut und Knochenmark, die ebenfalls Keratine exprimieren. Flüssigbiopsien sind eine nicht-invasive Methode, um diese Epithelzellen in verschiedenen Körperflüssigkeiten nachzuweisen und zu überwachen5. Zirkulierende Epithelzellen, auch zirkulierende Tumorzellen (CTCs) genannt, kommen im peripheren Blut vor und können Biomarker für die Krebsprognose sein und individualisierte Therapien steuern. CTCs können auch Aufschluss über das Fortschreiten der Erkrankung, die Wirksamkeit der Behandlung und das Gesamtüberleben der Patienten geben 5,6.
Das Epithelzelladhäsionsmolekül (EpCAM) ist ein klinisch verwendeter Marker für CTCs und kann Tumore epithelialen Ursprungs bei Krebspatienten identifizieren. EpCAM spielt eine Rolle bei der Zelladhäsion, -migration, -signaltransduktion, -proliferation und -differenzierung6. Damit eine zirkulierende Epithelzelle als CTC klassifiziert werden kann, muss sie positiv für die Zytokeratine 8, 18 und 19 und negativ für CD45, einen häufigen Leukozytenmarker6, sein. CTCs werden in der Regel identifiziert, indem zuerst CD45 mit magnetischen Mikrokügelchen depletiert wird, gefolgt von einem Test auf EpCAM und Cytokeratin 19 mittels Immunfluoreszenzmikroskopie7. Die Haupteinschränkung bei der Erkennung von CTCs ist ihre Seltenheit; Sie machen weniger als 0,01 % aller Zellen im Blut aus, und nur sehr wenige überleben im Blutkreislauf, um entfernte Organe zu erreichen 8,9,10. Bei der Planung von Experimenten und Techniken zur Isolierung und Identifizierung dieser Zellen muss aufgrund ihrer seltenen Natur berücksichtigt werden. Derzeit gibt es nur einen von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen automatisierten Einzelzellsortierer, der zur Identifizierung von CTCs verwendet wird und EpCAM als Biomarker verwendet. Andere Methoden sind die magnetische Bead-Trennung und die Durchflusszytometrie oder eine Kombination dieser Methoden. Es besteht ein Bedarf an neuen Techniken, die eine höhere Sensitivität und Spezifität für den Nachweis seltener CTCs aufweisen11.
Die Durchflusszytometrie ist eine bevorzugte Methode zum Nachweis seltener Zellpopulationen im Blut, Knochenmark und anderen Gewebeproben. Zu diesen seltenen Zellen können Stammzellen, zirkulierende Endothelzellen, CTCs und Krankheitsrestzellen gehören. Die Durchflusszytometrie ermöglicht quantitative Messungen jedes Zelltyps und sortiert diese Zellen für weitere Tests 7,9. Es wurden inkrementelle Zählungen durchgeführt, um eine genaue Beurteilung dieser seltenen Zellen zu gewährleisten. Die Möglichkeit, Zellen mithilfe von Gating von der weiteren Analyse auszuschließen, ist eine Möglichkeit, die Spezifität bei der Analyse von Zellen zu erhöhen. Die Einschränkungen der Durchflusszytometrie sind der Zeitaufwand für die Analyse großer Proben und das Fehlen einer visuellen Bestätigung der Zellidentität. Um dies zu überwinden, wurde eine Immunfluoreszenzmikroskopie an den sortierten Zellen durchgeführt, um ihre Identität zu bestätigen.
Zuvor hat unser Labor gezeigt, dass bei Mäusen die Knochenmarkszellen rekrutiert werden und zu Hauttumoren beitragen12. Diese aus dem Knochenmark stammenden Zellen sind positiv für Pan-Zytokeratin und epidermales Zytokeratin. Um die Rolle von epithelialen Stammzellen, aus dem Knochenmark stammenden Zellen und Zytokeratin-exprimierenden Zellen bei der Tumorprogression weiter aufzuklären, wurde nach EpCAM+-Zytokeratin-positiven Zellen in normalen murinen und menschlichen Blut- und Knochenmarkproben gesucht. Wie bei den meisten Experimenten wurde auch diese Methode durch mehrere Iterationen entwickelt. Bisher wurden transgene Mäuse zusammen mit inkrementellen Zählungen verwendet, um nach K14GFP-exprimierenden Zellen im Knochenmark zu suchen12. Je mehr Zellen gezählt wurden, desto mehr konnte eine repräsentative Population seltener Zellen identifiziert werden, wie in Abbildung 1 im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" dargestellt. Die Begründung für die Untersuchung von Epithelzellen in normalem Blut und Knochenmark basierte auf der frühen Literatur zu CTCs, bei denen normale gesunde Spender Hintergrundspiegel von EpCAM+-Zellen aufwiesen13. Wie bereits erwähnt, beginnt die EpCAM-Charakterisierung oft mit der Depletion von CD45. Dieser Schritt wurde ausgelassen, da einige hämatopoetische Zellen aus unbekannten Gründen, die weiter untersucht werden müssen, eine EpCAM- und Zytokeratin-Expression aufweisen. Daher wurden die Zellen unabhängig von der Zelllinie nach dem Vorhandensein oder Fehlen von EpCAM sortiert und dann auf Zytokeratin immungefärbt. Das nachstehende Protokoll und der in Abbildung 2 gezeigte Arbeitsablauf beschreiben eine Technik, die Durchflusszytometrie mit Kompensation und Kontrollen, statistische Methoden und Immunfluoreszenzbildgebung verwendet, um diese seltenen Populationen von Epithelzellen zu isolieren und zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Wird verwendet, um große Zellklumpen aus dem Knochenmark herauszufiltern</td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>Röhrchen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>500 ml Glas mit Deckel</td><td>Nalgene</td><td>11-823-32</td><td>Wird zum Waschen der Maus</td></tr><tr><td>verwendet 190 proof Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>2801</td><td>Auf 70% mit dH2O</td></tr> <tr><td>verdünntAlexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Verdünnung: 1:1000</td></tr><tr><td>Brightline Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-10</td><td>Wird verwendet, um lebende Zellen zu zählen</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>Bestandteil des Antikörperverdünnungsmittels</td></tr><tr><td>Charakterisiertes fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03</td><td>Bestandteil des Färbepuffers und der Erntelösung</td></tr><tr><td>Curity Mullschwämme</td><td>Covidien</td><td>2187</td><td>Wird verwendet, um einen sauberen Arbeitsbereich bei der Entnahme von Gliedmaßen und Knochenmark zu halten</td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Miltex</td><td>18-784</td><td>Wird während der Ernte</td></tr><tr><td>verwendet Cytokeratin, Wide Spectrum Screening</td><td>Dako</td><td>Z0622</td><td>Verdünnung 1:750 *Jetzt eingestellt</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung (DPBS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144 500 ml</td><td>Wird verwendet, um die Lysereaktion der roten Blutkörperchen</td></tr><tr><td>zu stoppen Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td>Verwendet bei 0,5 M&nbsp;</td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td>Bestandteil der Erntelösung</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14175-095 500mL</td><td>Bestandteil der Erntelösung und der Färbepufferlösung</td></tr><tr><td>Luer-Lok Spitze 10 mL Spritze</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>309604</td><td>Verwendung mit einer 26G-Nadel zum Spülen der Knochen, Verwendung mit einer 20G-Nadel zum Aufbrechen von Klumpen</td></tr><tr><td>Magic touch 2 Eiskübel</td><td>BelArt</td><td>M16807-2001</td><td>Wird verwendet, um die Proben auf Eis zu lagern</td></tr><tr><td>Fettfreie Trockenmilch</td><td>Apex</td><td>20-241</td><td>Bestandteil des Antikörperverdünnungsmittels</td></tr><tr><td>Normales Pferdeserum</td><td>Vektor</td><td>ZE0122</td><td>Bestandteil des Antikörpers Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>PE Anti-Human-CD 326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>324206</td><td>Verdünnung: 5 & Mikro; L in 100 & Mikro; l pro 1x106</td></tr><tr><td>Zellen PE Anti-Maus CD 326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>118205</td><td>Verdünnung: 3 & Mikro; L in 100 & Mikro; l pro 1x106 Zellen</td></tr><tr><td>PE Maus IgG2b, &kappa; Isotypkontrolle</td><td>Biolegend</td><td>400313</td><td>Verdünnung: 1 & Mikro; L in 100 & Mikro; l pro 1x106</td></tr><tr><td>Zellen PE Ratte Anti-Human CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>555763</td><td>Verdünnung: 20 &micro; L in 100 & Mikro; l pro 1x106 Zellen</td></tr><tr><td>PE Ratte IgG2am, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td>Verdünnung: 1 & Mikro; L in 100 & Mikro; l pro 1x106 Zellen</td></tr><tr><td>Konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen 50 mL</td><td>Basix</td><td>14-955-240</td><td>Wird in der Zentrifuge</td></tr><tr><td>verwendet Povidon-Jod-Peeling</td><td>Aplicare</td><td>82-227</td><td>Antiseptikum zur Sterilisation von Mäusen</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 20G x 1 1/2</td><td>Becton, Dickinson und Co</td><td>305176</td><td>20G Nadel zum Aufbrechen von Knochenmarkklumpen</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 26G x 1/2</td><td>Becton, Dickinson & Co</td><td>305111</td><td>26G-Nadel zum Spülen von Knochenmark aus</td></tr><tr><td>Knochen PTFE Gedruckte Objektträger</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Dienstleistungen 63422-06</td><td>8-Well-Objektträger, auf die Zellen für Immunfluoreszenz einsortiert</td></tr><tr><td>werden RBC-Lysepuffer 10X</td><td>Invitrogen</td><td>00-4300-54</td><td>Verdünnung 1:10 mit sterilem deionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-6762</td><td>Wird während der Ernte verwendet</td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge aus rostfreiem Stahl #4</td><td>Bard-Parker</td><td>371222</td><td>Einsatz bei der</td></tr><tr><td>Ernte Steriles Tablett</td><td>Polar Ware</td><td>10F</td><td>Verwendung während der Ernte</td></tr><tr><td>StretchEase Puderfreie Untersuchungshandschuhe aus Nitril</td><td>Denville Scientific</td><td>G4161</td><td>Verwendung während der</td></tr><tr><td>Ernte Griff des chirurgischen Skalpells #4</td><td>Fischer</td><td>12-000-164</td><td>Verwendung mit chirurgischer</td>Klinge</tr><tr><td>TBS 20x</td><td></td><td>Thermokomponente</td><td>von TBST, verwendet bei 1X</td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Wird verwendet, um tote Zellen zu zählen. Gefiltert mit .45 &micro; m</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500mL</td><td>Bestandteil der TBST</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Miltex</td><td>6-8</td><td>Wird während der Ernte</td></tr><tr><td>verwendet Vectashield Vibrance Antifade Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1800</td><td>Kernfärbung für Immunfluoreszenz</td></tr></tbody></table>

evidenz für epcam und zytokeratin-exprimierende epithelzellen in normalem menschlichem und murinem blut und knochenmark

Evidence for EpCAM and Cytokeratin Expressing Epithelial Cells in Normal Human and Murine Blood and Bone Marrow

Epithelzellen wurden im Blut und Knochenmark von Patienten mit Krebs und anderen Krankheiten identifiziert. Das Vorhandensein normaler Epithelzellen im Blut und Knochenmark gesunder Personen muss jedoch noch auf konsistente Weise nachgewiesen werden. Hier wird eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus gesundem menschlichem und murinem Blut und Knochenmark (BM) mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) vorgestellt. Epithelzellen von gesunden Individuen wurden zunächst mittels Durchflusszytometrie mit Hilfe von Epithelzelladhäsionsmolekülen (EpCAM) identifiziert und isoliert. Diese EpCAM+-Zellen exprimieren Keratin mittels Immunfluoreszenzmikroskopie in Krt1-14;mTmG-transgenen Mäusen. Humane Blutproben wiesen 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ Zellen auf (REM; n=7 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate). Im humanen BM waren 3,53% ± 0,006 (REM; n=3 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) der mononukleären Zellen EpCAM+. Im Blut der Maus machten die EpCAM+-Zellen 0,45 % ± 0,0006 (REM; n = 2 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) aus, und im BM der Maus waren 5,17 % ± 0,001 (REM; n = 3 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) EpCAM+. In Mäusen waren alle EpCAM+-Zellen immunreaktiv gegenüber Pan-Zytokeratin, wie durch IF-Mikroskopie festgestellt wurde. Die Ergebnisse wurden anhand von Krt1-14;mTmG-transgenen Mäusen bestätigt, wobei eine geringe Anzahl (8,6 native GFP+-Zellen pro 106 analysierte Zellen; 0,085 % der lebensfähigen Zellen), aber eine signifikante Anzahl (p < 0,0005) von GFP+-Zellen in normaler muriner BM vorhanden war, die im Vergleich zu mehreren Negativkontrollen nicht das Ergebnis von Zufälligkeit waren. Darüber hinaus waren EpCAM+-Zellen im Mausblut heterogener als CD45+-Zellen (0,58% im BM; 0,13% im Blut). Diese Beobachtungen schlussfolgern, dass Zellen, die Zytokeratinproteine exprimieren, reproduzierbar zwischen mononukleären Zellen aus menschlichem und murinem Blut und BM nachweisbar sind. Wir demonstrieren eine Methode der Gewebegewinnung, Durchflusszytometrie und Immunfärbung, mit der die Funktion dieser Pan-Zytokeratin-Epithelzellen bei gesunden Personen identifiziert und bestimmt werden kann.

Mit diesen Methoden wurden seltene Populationen von Epithelzellen im Blut und Knochenmark von normalen Menschen und Mäusen sichtbar gemacht. Mit den richtigen Kompensationen und Kontrollen wie beschrieben zeigten die Ergebnisse durchweg, dass 4%-5% der Zellen im murinen Knochenmark EpCAM+ waren, unabhängig davon, wie viele Zellen gezählt wurden, wie in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt. In murinen Blutproben wiesen weniger als 0,5 % der Zellen EpCAM+ auf, wie in Abbildung 6 dargestellt. In menschlichen Knochenmarkproben wiesen 2%-5% der Zellen EpCAM+ auf, wie in Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Während 2 % bis 5 % eine große Spanne sind, waren die Prozentsätze bei jedem einzelnen Spender konsistent, da schrittweise mehr Zellen gezählt wurden. In menschlichen Blutproben enthielten etwa 0,3 % der Zellen EpCAM+, wie in Abbildung 9 dargestellt. Unsere Kontrollproben (keine Färbung, Isotypkontrolle und FMOs) ergaben nur sehr wenige falsch-positive EpCAM+-Ergebnisse, wie in Abbildung 4 und Abbildung 7 dargestellt. Zellen aus den EpCAM+- und EpCAM-Gruppen, die auf Objektträger sortiert wurden, zeigten eine positive Färbung für Pan-Zytokeratin in EpCAM+-Proben und waren negativ für Pan-Zytokeratin in EpCAM-Proben, wie in Abbildung 10 gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Experimente angemessen konzipiert und reproduzierbar waren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig01.jpg"> Abbildung 1: Krt14Cre;mTmG-transgene Mäuse mit inkrementellen Knochenmarkzählungen. Das Knochenmark von Krt1-14;mTmG-Mäusen wurde inkrementell gezählt. GFP-positive Zellen weisen auf eine Keratin-14-Expression hin und wurden mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Je mehr Knochenmarkzellen gezählt wurden, desto leichter war diese Keratin-14-positive Zellpopulation zu identifizieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig02.jpg"> Abbildung 2: Arbeitsablauf für EpCAM+- und Zytokeratin+-Zellen. Die Knochenmark- und Blutzellen wurden zunächst mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert, um EpCAM+- und EpCAM-Zellen zu trennen. Diese Zellen wurden in zwei verschiedene Reagenzgläser sowie auf zwei verschiedene Objektträger sortiert. Die in Reagenzgläser sortierten Zellen wurden mit einer Zytozentrifuge auf Objektträger geschleudert. Die Objektträger wurden dann mit einem Pan-Cytokeratin-Primärantikörper angefärbt und anschließend mit einem Sekundärantikörper angefärbt. Die Objektträger wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert, um die Pan-Zytokeratin-Expression zu beobachten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig03.jpg"> Abbildung 3: Software für die Durchflusszytometrie-Analyse. Bei der Analyse von Durchflusszytometriedaten mit einer Analysesoftware wird die No-Stain-Kontrolle verwendet, um die interessierenden Zellen auszuwählen. Die Zellen werden zunächst mit SSC-A und FSC-A selektiert, die die interne Komplexität und Größe der Zellen zeigen. (A) Ein Polygon-Gate wird um die Zellen gezeichnet. (B) Einzelne Zellen werden durch Gating von SSC-A durch SSC-W gewonnen. (C) Lebende Zellen werden durch Gating von FSC-A im Vergleich zu DAPI gewonnen. (D) EpCAM-negative Zellen werden ausgeschlossen, indem rechts neben den EpCAM-negativen Zellen angesteuert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchflusszytometrische Analyse von EpCAM+-Zellen im Knochenmark der Maus. Die Steuerelemente "Keine Färbung", "Isotyp" und "FMOs" werden im oberen Bereich angezeigt, während die inkrementellen Zählungen von 50.000, 100.000 und 500.000 Zellen im unteren Bereich angezeigt werden. Diese Diagramme veranschaulichen die Konsistenz der Prozentsätze über die Zählungen hinweg, trotz des allgemeinen Anstiegs der Gesamtzahl der gezählten Zellen. Die Felder auf der rechten Seite zeigen die Gating-Strategie, wie sie zuvor im Abschnitt Durchflusszytometrie-Analyse erörtert wurde und wie in Abbildung 3 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig05.jpg"> Abbildung 5: EpCAM+-Zellen im Knochenmark der Maus machen 5,17 % ± 0,001 % der Bevölkerung aus. Analysiert wurden die Knochenmarkszellen von drei einzelnen Mäusen. Die entsprechenden Kontrollen wurden einbezogen, um eine angemessene wissenschaftliche Genauigkeit zu gewährleisten. Der Prozentsatz der positiven Zellen blieb über die Proben hinweg konstant, da die Mäuse genetisch identisch waren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig06.jpg"> Abbildung 6: EpCAM+-Zellen im Mäuseblut machen 0,45 % ± 0,0006 % der Bevölkerung aus. Analysiert wurden die Blutzellen von zwei Mäusen. Es wurden Kontrollen einbezogen, um zu zeigen, dass das richtige Verfahren befolgt wurde, um schlüssige Ergebnisse zu erzielen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig07.jpg"> Abbildung 7: Durchflusszytometrische Analyse am humanen Knochenmark EpCAM+. Die Steuerelemente "Keine Färbung", "Isotyp" und "FMOs" werden im oberen Bereich angezeigt, und die inkrementellen Zählungen von 50.000, 100.000 und 500.000 Zellen werden im unteren Bereich angezeigt. Diese Diagramme veranschaulichen die Konsistenz der Prozentsätze über die Zählungen hinweg, trotz des Gesamtanstiegs der Gesamtzahl der gezählten Zellen. Die Felder auf der rechten Seite zeigen die Gating-Strategie, wie sie zuvor im Abschnitt Durchflusszytometrie-Analyse erörtert wurde und wie in Abbildung 3 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig08.jpg"> Abbildung 8: EpCAM+-Zellen im menschlichen Knochenmark machen 3,53 % ± 0,006 % der Bevölkerung aus. Es wurden drei verschiedene menschliche Knochenmarkproben analysiert. Geeignete Kontrollen für die wissenschaftliche Genauigkeit wurden einbezogen. Der Prozentsatz der positiven Zellen variiert aufgrund der genetischen Heterogenität beim Menschen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig09.jpg"> Abbildung 9: EpCAM+-Zellen des menschlichen Blutes machen 0,18 % ± 0,0004 % der Bevölkerung aus. Es wurden drei verschiedene menschliche Blutproben analysiert. Geeignete Kontrollen für die wissenschaftliche Genauigkeit wurden einbezogen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig10.jpg"> Abbildung 10: Immunfluoreszenz von EpCAM+ und EpCAM- Objektträgern. FACS wurde verwendet, um EpCAM+- und EpCAM-Zellen zu trennen. Pan-Zytokeratin wurde für die Verwendung des DAKO-Pan-Zytokeratin-Antikörpers gefärbt. Es wurde keine primäre Antikörperkontrolle in normalem Serum verwendet, da es sich bei dem Pan-Zytokeratin um einen polyklonalen Antikörper handelt. Diese Ergebnisse bestätigen die Genauigkeit von FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="3">Menschliches Knochenmark oder Blut</td>
		</tr><tr><td>Antikörper</td>
			<td>Rohr #</td>
			<td># Anzahl der Zellen</td>
			<td>AB Conc</td>
		</tr><tr><td>Ungefleckt</td>
			<td>1</td>
			<td>1x106</td>
			<td>X</td>
		</tr><tr><td>Nur DAPI</td>
			<td>2</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1 μl/ml</td>
		</tr><tr><td>Kontrolle des PE-Isotyps</td>
			<td>3</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>CD49f-PE Einzelfleckenbekämpfung</td>
			<td>4</td>
			<td>1x106</td>
			<td>20 uL in 100uL pro 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE Niedrige Titration</td>
			<td>5</td>
			<td>1x106</td>
			<td>3 uL in 100uL pro 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE Medium-Titration</td>
			<td>6</td>
			<td>1x106</td>
			<td>4 μL in 100uL pro 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE Hohe Titration</td>
			<td>7</td>
			<td>1x106</td>
			<td>5 uL in 100uL pro 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE Hohe Sortierung auf Objektträgern</td>
			<td>8</td>
			<td>10x106</td>
			<td>50 μl in 1 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Färbepanel für die Durchflusszytometrie. Ein Beispiel für ein Durchflusszytometrie-Färbepanel für mononukleäre Zellen im Blut oder Knochenmark. Enthaltene Kontrollen sind nur DAPI, ungefärbte Kontrolle und PE-Einzelfleckenkontrolle (PE-CD49f wurde als bessere Positivkontrolle verwendet). Fluoreszenz minus eins ist in diesem Panel nicht enthalten, da es sich nur um eine einzige Farbe (PE) handelt. Bei der Zugabe weiterer Fluorophorfarben, wie z. B. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) oder Allophycocyanin (APC), sollten FMOs einbezogen werden, indem ein Fluorophor für jede FMO-Kontrolle ausgeschlossen wird.
Ergänzungsdatei 1: Lebendzellzählung mit Hämatozytometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/Suppli-1_65118.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare Methode mit neuen Erkenntnissen über das Vorhandensein von Epithelzellen in normalem Blut und Knochenmark von Mensch und Maus mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Krt1-14;mTmG transgene Mäuse wurden als in vivo Methode verwendet, um diese Ergebnisse zu bestätigen.

Evidenz für EpCAM und Zytokeratin-exprimierende Epithelzellen in normalem menschlichem und murinem Blut und Knochenmark

Epithelial cells have been identified in the blood and bone marrow of patients with cancer and other diseases. However, the presence of normal epithelial ...

Diese Technik demonstriert eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Epithelzellen, die sich im Blut und Knochenmark gesunder Personen befinden, um sie für weitere nachgelagerte Analysen zu verwenden. Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Epithelzellen zu einem Bruchteil der Kosten der automatischen Isolierung zirkulierender Tumorzellen aufgrund der Zugänglichkeit der Durchflusszytometrie. Diese Methode kann Auswirkungen auf die Entwicklungs- und Stammzellbiologie sowie auf regenerative Therapien haben.Es kann auch verwendet werden, um die Wundheilung und den Gewebeerhalt in Epithelgeweben zu untersuchen. Die Knochen sind sehr klein und zerbrechlich, daher vorsichtig behandeln, um ein Brechen oder Verlieren der Knochen zu vermeiden. Das Knochenmark ist relativ stabil, so dass Sie langsam und vorsichtig arbeiten können, um eine ordnungsgemäße Ernte zu gewährleisten.Legen Sie die Maus zunächst in einen 500-Milliliter-Behälter und fügen Sie so viel Jod hinzu, dass die Hälfte der Maus bedeckt ist. Schütteln und schwenken Sie den Behälter vorsichtig, um eine gründliche Abdeckung zu gewährleisten. Anschließend mit deionisiertem Wasser abspülen.Führen Sie eine weitere Jodwäsche und dann zwei Wäschen mit 70%igem Ethanol durch. Legen Sie die Maus in eine Haube und legen Sie sie auf den Rücken auf das Tablett. Greife die Hinterbeine und ziehe sie auseinander, bis ein Knacken zu spüren ist.Machen Sie einen Ein-Zentimeter-Schnitt auf der Haut der Maus in der Nähe der Leistengegend. Führen Sie eine geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie die Schere unter der Haut, um sie vom Bauchfell zu trennen. Schneiden Sie die Haut am Bein um den Oberschenkel herum und schneiden Sie dann die Haut am Bein ab, um die Muskeln und Knochen freizulegen.Bevor Sie das Hinterbein abschneiden, tasten Sie den Hüftknochen ab, um die Schere genau zu führen und Schnitte am Oberschenkelknochen zu vermeiden, wo sich der größte Teil des Knochenmarks befindet. Entfernen Sie dann die Hinterbeine, indem Sie um das Hüftgelenk herum schneiden, ohne den Oberschenkelknochen zu durchtrennen. Legen Sie die Gliedmaßen in ein Röhrchen, das mit Gliedmaßen beschriftet ist.Entfernen Sie als Nächstes die Muskeln, das Gewebe und das Fett entlang einer der Gliedmaßen, indem Sie mit einer Schere parallel zum Knochen schneiden. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um verbleibendes Fett oder Muskeln vorsichtig zu entfernen, indem Sie eine Schabenbewegung senkrecht zum Knochen ausführen. Nachdem Sie den Knochen gründlich gereinigt haben, trennen Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein am Knie.Verwenden Sie dann ein Skalpell, um Schnitte an beiden Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins zu machen, wo kein sichtbares Knochenmark vorhanden ist. Führen Sie die vorbereitete Spritze und Nadel in den Knochen ein. Wenn ein Widerstand vorhanden ist, kürzen Sie das Ende des Knochens, bis kein Widerstand mehr auftritt.Halten Sie den Knochen fest über dem mit Knochenmark beschrifteten Röhrchen und injizieren Sie die Knochenmarkentnahmelösung in den Knochen. Dann das Knochenmark in die Tube ausröten. Wiederholen Sie dies für das andere Ende des Knochens, um den Rest des Knochenmarks zu sammeln, bis der Knochen vollständig weiß oder leer erscheint.Brechen Sie mit einer leeren 10-Milliliter-Spritze und einer 20-G-Nadel die Knochenmarkklumpen im Röhrchen auf, indem Sie das Knochenmark fünf- bis 10-mal in der Spritze auf und ab ziehen. Geben Sie einen 40-Mikron-Filter in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und spülen Sie es mit einem Milliliter Knochenmark-Erntelösung aus. Filtern Sie das Knochenmark durch den Filter, um verbleibende Klumpen zu entfernen.Beschriften Sie dann das röhrchenfiltrierte Knochenmark. Bewahren Sie das gefilterte Knochenmark bis zur Verwendung am selben Tag im Kühlschrank oder auf Eis auf. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen bei 170 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Saugen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern eines x Lysepuffers für rote Blutkörperchen und inkubieren Sie sie vier Minuten lang. Fügen Sie dann 30 Milliliter der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco hinzu, um die Reaktion des Lysepuffers zu stoppen.Zentrifugieren Sie die Zellen acht Minuten lang bei 170 G bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn in 10 bis 20 Milliliter Färbepuffer. Teilen Sie zunächst die Zellen in individuell markierte Röhrchen auf, basierend auf dem verwendeten Färbepanel, einschließlich Kompensationskontrollen.Bereiten Sie ungefärbte Kontrollen und Isotopenkontrollen vor, um unspezifische Färbungen zu blockieren. Fügen Sie für jede Fluora-Vier-Färbung eine Einzelfärbungskontrolle hinzu und fügen Sie auch Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen in Kombination mit den verbleibenden Fluora-Vieren hinzu. Als nächstes fügen Sie Antikörper gemäß der empfohlenen Verdünnung hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie den Boden der Röhrchen schnippen.Verwenden Sie vorzugsweise EpCAM, das an Phycoerythrin konjugiert ist, um niedrige Zellpopulationen sichtbar zu machen. 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Bringen Sie die Röhrchen nach der Inkubation in die BSL-Zweierhaube und geben Sie einen Milliliter Färbepuffer in jedes Röhrchen.Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 170 G bei vier Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Bringen Sie nach dem Zentrifugieren die verschlossenen Röhrchen zur BSL-Zweierhaube und saugen Sie den Überstand ab. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem Milliliter Färbepuffer und schnippen Sie den Boden der Röhrchen zum Mischen.Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren noch zweimal. Zum Schluss wird der Gaumen vor der Durchflusszytometrie in 500 Mikrolitern Färbepuffer resuspendiert. Fügen Sie DAPI oder Dead-Cell-Diskriminator gemäß den Empfehlungen des Herstellers hinzu.Mit Hilfe dieses Protokolls wurden seltene Populationen von Epithelzellen im Knochenmark von Mäusen sichtbar gemacht. Vier bis 5 % der Zellen im murinen Knochenmark waren EpCAM-positiv, unabhängig von der Anzahl der gezählten Zellen. In humanen Knochenmarkproben waren zwei bis 5% der Zellen EpCAM-positiv.Auch der Prozentsatz der Zellen innerhalb jedes einzelnen Spenders war konsistent, da inkrementell mehr Zellen gezählt wurden. In murinen Blutproben waren weniger als 0,5 % der Zellen EpCAM-positiv. In menschlichen Blutproben lag diese Zahl bei etwa 0,3 % der Zellen.Die Kontrollproben zeigten nur sehr wenige falsch positive EpCAM-positive Zellen. Weiterhin zeigten die Zellen, die in der EpCAM-positiven Gruppe sortiert waren, eine Färbung für Pan-Zytokeratin. Diejenigen aus der EpCAM-negativen Gruppe zeigten das Zytokeratin-Signal nicht.Es ist am wichtigsten, eine saubere und sterile Umgebung zu erhalten. Dadurch wird eine Kontamination der Probe verhindert. Es gibt mehrere nachgeschaltete Anwendungen, die auf die isolierten Epithelzellen angewendet werden können, um deren Funktion zu bestimmen.Dazu gehören RNA-Sequenzierung, Zellkultur-in-vivo-Experimente und Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

Ein 3D-Kultur für Hämatopoese wird unter Verwendung von humanem Nabelschnurblut und leukämischen Knochenmarkszellen. Verfahren basiert auf der Verwendung eines porösen, synthetischen Polyurethan Gerüst mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet ist. Dieses Gerüst ist anpassbar an eine Vielzahl von Zellen aufnehmen.

Ex-vivo-Mimikry von normalen und anormalen menschlichen Hämatopoese

Zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in mehreren metastatischen Krebsprognos. Dieses Manuskript beschreibt den Goldstandard Cellsearch System (CSS) CTC Aufzählung Plattform und Highlights gemeinsame Fehlklassifikation Fehler. Darüber hinaus werden zwei angepasste Protokolle für benutzerdefinierte Marker Charakterisierung von CTC und CTC Aufzählung in präklinischen Mausmodellen der Metastasierung mit dieser Technologie beschrieben.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

Eine Strategie zur quantitativen Analyse histologischer Daten im Knochenmark wird vorgestellt. Die konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen in Gewebeschnitten führt zu 2-dimensionalen Bildern, die automatisch analysiert werden. Co-Lokalisationsanalysen verschiedener Zelltypen werden mit Daten aus simulierten Bildern verglichen, um quantitative Informationen über zelluläre Interaktionen zu erhalten.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats"Myovascular".

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

Die Kultivierung von CTCs ermöglicht eine tiefere funktionelle Charakterisierung von Krebs, unter anderem durch die Untersuchung der spezifischen Markerexpression und die Bewertung der Arzneimittelresistenz und der Fähigkeit, die Leber zu besiedeln. Insgesamt könnte die CTC-Kultur ein vielversprechendes klinisches Werkzeug für die personalisierte Medizin sein, um das Patientenergebnis zu verbessern.

Zirkulierende Tumorzelllinien: ein innovatives Werkzeug für die Grundlagen- und Translationsforschung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Wir beschreiben Protokolle für die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymusepithelzellen der Maus und die Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse.

Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymus-Epithelzellen der Maus und Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse

Lernen Sie eine reproduzierbare Methode zur Isolierung epithelialer Zellen aus Blut und Knochenmark gesunder Individuen mittels Durchflusszytometrie. Diese Technik ermöglicht kostengünstige Analysen für Entwicklungs- und Stammzellbiologie.

Evidenz für EpCAM und Zytokeratin-exprimierende Epithelzellen in normalem menschlichem und murinem Blut und Knochenmark

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