Name: Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung humaner Endothelzellen aus der Vena saphena und deren Kultivierung unter kontrollierter Scherspannung und zyklischer Dehnung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanischer Stressantworten zur Analyse von Graft-Versagen.

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Das Venensegment saphena sollte mindestens 2 cm groß sein, um hSVECs erfolgreich zu isolieren. Kleine Segmente sind schwer zu handhaben und binden die Enden des Gefäßes zusammen, um die Kollagenaselösung zu erhalten und die Zellen zu isolieren. Die reduzierte luminale Oberfläche liefert nicht genügend Zellen, um die Kultur zu erweitern. Um das Risiko einer Kontamination mit Nicht-ECs zu minimieren, muss die Manipulation des Venenabschnitts saphena während des gesamten Eingriffs sehr schonend erfolgen. Es ist wichtig, bei...

Die Dysfunktion der Endothelzellen (EC) ist ein wichtiger Faktor beim Versagen des Venentransplantatssaphena 1,2,3,4. Die anhaltende Zunahme der Scherspannung und der zyklischen Dehnung induziert den proinflammatorischen Phänotyp der humanen Saphena-Endothelzellen (hSVECs)3,4,5,6. Die zugrunde liegenden molekularen Signalwege sind noch nicht vollständig verstanden, und standardisierte Protokolle für In-vitro-Studien könnten die Bemühungen um neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet unterstützen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Expansion von hSVECs und wie sie unterschiedlichen Scherbelastungen und zyklischen Dehnungen ausgesetzt werden können, um die venösen und arteriellen hämodynamischen Bedingungen nachzuahmen.
hSVECs werden durch Kollagenase-Inkubation isoliert und können bis zur Passage 8 verwendet werden. Dieses Protokoll erfordert im Vergleich zu den anderen verfügbaren Protokollen weniger Manipulation des Gefäßes7, was die Kontamination mit glatten Muskelzellen und Fibroblasten reduziert. Andererseits ist ein größeres Gefäßsegment von mindestens 2 cm erforderlich, um eine effiziente EC-Extraktion zu erreichen. In der Literatur wurde berichtet, dass ECs aus großen Gefäßen auch durch mechanische Entfernung gewonnen werden können 7,8. Obwohl der physikalische Ansatz effektiv ist, hat er die Nachteile einer niedrigen EC-Ausbeute und einer höheren Fibroblastenkontamination. Um die Reinheit zu erhöhen, sind zusätzliche Schritte mit magnetischen Beads oder Zellsortierung erforderlich, was die Kosten des Protokolls aufgrund des Erwerbs von Beads und Antikörpern erhöht 7,8. Die enzymatische Methode führt zu schnelleren und besseren Ergebnissen in Bezug auf EC-Reinheit und Lebensfähigkeit 7,8.
Die am häufigsten verwendeten ECs zur Untersuchung der endothelialen Dysfunktion sind humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs). Es ist bekannt, dass sich der EC-Phänotyp in verschiedenen Gefäßbetten ändert, und es ist wichtig, Methoden zu entwickeln, die das untersuchte Gefäß darstellen 9,10. In dieser Hinsicht ist die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung eines hSVEC und seiner Kultivierung unter mechanischer Belastung ein wertvolles Werkzeug, um den Beitrag der hSVEC-Dysfunktion bei Venentransplantaterkrankungen zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-0,02 % EDTA-Lösung</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 & Mikro-Objektträger I 0,4 Luer&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dilaktat (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>6-Wells äquibiaxiale Ladestation von 25 mm&nbsp;</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>LS-3000B25. VJW</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-Kammerobjektträger mit herausnehmbarer Vertiefung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure (Glazial)</td><td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Acrylplatte 1 cm dick</td><td>Plexiglas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31, FITC Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Bioflex-Platten Kollagen I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Baumwollnaht EP 3,5 15 x 45 cm</td><td>Brasuture</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophilin Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom designed</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophilin reverse primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom designed</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basalmedium</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots supplements</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 Spannsystem</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount wässriges Einbettmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium aus der Darmschleimhaut von Schweinen 5000 IE/ml</td><td>Blau Farmac&ecirc; utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Pumpensystem (Pumpe + Fluidikeinheit)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2 Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom KLF2</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom KLF4</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom KLF4</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>NOA 280 Stickstoffmonoxid-Analysator</td><td>Sievers Instruments</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kundenspezifischer</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsset 15 cm, ID 1,6 mm, rot, 10 mL</td><td>Reservoire Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR grünes PCR-Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K flex Plattform&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mikrokit&nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerglas (24 mm x 60 mm)</td><td>Knittel Glas</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Erststrangsynthesesystem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau gefärbt 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr></tbody></table>

humane endothelzellisolierung der vena saphena und exposition bei kontrollierter scherspannung und dehnung

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Die Koronararterien-Bypass-Transplantation (CABG) ist ein Verfahren zur Revaskularisierung des ischämischen Myokards. Die Vena saphena wird trotz der im Vergleich zu arteriellen Conduits reduzierten Langzeitdurchgängigkeit weiterhin als CABG-Conduit verwendet. Der abrupte Anstieg des hämodynamischen Stresses, der mit der Arterialisierung des Transplantats einhergeht, führt zu einer Schädigung der Gefäße, insbesondere des Endothels, die die geringe Durchgängigkeit des Venentransplantats saphena (SVG) beeinflussen kann. Hier beschreiben wir die Isolierung, Charakterisierung und Expansion von humanen Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Zellen, die durch Kollagenaseverdau isoliert wurden, weisen die typische Kopfsteinpflastermorphologie auf und exprimieren die Endothelzellmarker CD31 und VE-Cadherin. Um den Einfluss der mechanischen Beanspruchung zu beurteilen, wurden in dieser Studie Protokolle verwendet, um die beiden wichtigsten physikalischen Stimuli, Scherspannung und Dehnung, auf arteriale SVGs zu untersuchen. hSVECs werden in einer parallelen Plattenströmungskammer kultiviert, um Scherspannungen zu erzeugen, die eine Ausrichtung in Strömungsrichtung und eine erhöhte Expression von KLF2, KLF4 und NOS3 zeigen. hSVECs können auch in einer Siliziummembran kultiviert werden, die eine kontrollierte Zelldehnung ermöglicht, die venöse (niedrige) und arterielle (hohe) Dehnung nachahmt. Das F-Aktin-Muster der Endothelzellen und die Stickstoffmonoxid (NO)-Sekretion werden entsprechend durch die arterielle Dehnung moduliert. Zusammenfassend stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung von hSVECs vor, um den Einfluss von hämodynamischem mechanischem Stress auf einen endothelialen Phänotyp zu untersuchen.

Typischerweise können verklebte ECs 3-4 Tage nach der Extraktion beobachtet werden. hSVECs bilden zunächst Zellhaufen und weisen eine typische "Kopfsteinpflaster"-Morphologie auf (Abbildung 1B). Sie exprimieren die EC-Marker CD31 (Abbildung 1C,D) und VE-Cadherin (Abbildung 1D). hSVECs können leicht auf einer unbeschichteten, behandelten Zellkulturschale vermehrt werden und behalten den endothelialen Phänotyp in Kult...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung humaner Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Wir stellen auch detaillierte Methoden zur Erzeugung von Scherspannung und Dehnung zur Verfügung, um mechanische Spannungen in hSVECs zu untersuchen.

Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Die Vena saphena ist nach einer Bypass-Operation der Koronararterien plötzlich arteriellen Erkrankungen ausgesetzt. Das Verständnis seiner Anpassungsreaktion an mechanische Belastungen kann dazu beitragen, therapeutische Instrumente zu entwickeln, um das Versagen eines Venentransplantats zu verhindern. Dieses Protokoll zur Isolierung von Endothelzellen ist sehr einfach und erfordert nur eine Inkubation mit Kollagenase.Bei minimaler Gefäßmanipulation führt dies zu einer reduzierten Kontamination mit glatten Muskelzellen und Fibroblasten. Das Protokoll für die Isolierung humaner SVECs und deren Kultivierung unter Scherbelastung und zyklischer Dehnung ist unerlässlich, um den Beitrag mechanischer Kräfte bei der Dysfunktion von Endothelzellen im Zusammenhang mit dem Versagen des Venentransplantats saphena zu verstehen. Die vorherige Endothelzellkultur ist sehr anspruchsvoll in Bezug auf die Supplementierung mit Zellmedien.Es ist zwingend erforderlich, Wachstumsfaktoren hinzuzufügen, um eine Kultur, die menschlichen SVECs, erfolgreich zu isolieren. Für die Isolierung von primären humanen Endothelzellen der Vena saphena oder humanen SVECs wird ein mindestens zwei bis drei Zentimeter langes Venensegment der Vena saphena entnommen. Übertragen Sie das Venensegment unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube in eine Petrischale, die mit vorgewärmtem PBS gefüllt ist.Um das gesamte Blut aus dem Lumen zu entfernen, führen Sie eine Pipettenspitze, die an einer Pipette befestigt und mit PBS gefüllt ist, in ein Ende der Vene ein und spülen Sie sie vorsichtig aus. Spülen Sie es, bis der Waschfluss vollständig klar ist. Verschließen Sie dann ein Ende der Vene mit einer sterilen Baumwollnaht.Füllen Sie das Gefäß vorsichtig mit einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase-Typ-2-Lösung und verschließen Sie das andere Ende des Gefäßes mit einer Baumwollnaht. Inkubieren Sie das Gefäß mit Kollagenaselösung in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%igem Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Schneiden Sie dann ein Ende des Gefäßes über ein 15-Milliliter-Röhrchen, um die Kollagenase-Lösung aufzufangen, bevor Sie das andere Ende durchschneiden.Spülen Sie die luminale Oberfläche mit ein bis zwei Millilitern PBS, um alle abgelösten Endothelzellen in der Röhre mit Kollagenase zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Zellpellet in drei bis vier Millilitern vollständigem Endothelzellmedium mit einer zusätzlichen Heparinlösung wieder suspendiert.Legen Sie die Zellen in eine 60-Millimeter-Zellkulturschale, die mit 3 Gewichtsprozent Gelatine vorbeschichtet ist. Inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang in befeuchteter Atmosphäre, ohne das Medium zu wechseln. Wechseln Sie danach das Medium jeden zweiten Tag, ohne die Heparin-Supplementierung hinzuzufügen.Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden. Je nach Größe und Durchmesser des Venenabschnitts werden die humanen SVECs ein bis vier Tage nach der Extraktion mittels Phasenkontrastmikroskopie visualisiert, um den Grad der Konfluenz und ihre Kopfsteinpflastermorphologie zu beurteilen. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.Den Objektträger der Strömungskammer mit 0,1 Gew.-% Gelatine bestreichen und mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Fluidikeinheit und das sterile Perfusionsset mit 10-Millimeter-Reservoirs auszugleichen, inkubieren Sie diese über Nacht in einer befeuchteten Atmosphäre. Für das Scherspannungsexperiment werden 200.000 Endothelzellen, die in 100 Mikrolitern Nährmedium suspendiert sind, in den gelatinebeschichteten Strömungskammerschieber eingesessen.Um die Zellen an der Kulturoberfläche zu befestigen, inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang. Setzen Sie das Perfusionsset auf die Fluidikeinheit. Füllen Sie die Reservoirs und das Perfusionsset mit ca. 12 Millilitern vorgewärmtem Endothelzellmedium.Entfernen Sie Luftblasen aus dem Perfusionsset, um den Füllstand beider Behälter bei fünf Millilitern auszugleichen. Setzen Sie die Fluidikeinheit auf das montierte Perfusionsset ohne Kammerschieber im Inkubator und schließen Sie das Stromkabel an die computergesteuerte Pumpe an. Entfernen Sie durch Ausführen des vordefinierten Protokolls in der Pumpensteuerungssoftware alle Luftblasen aus den Behältern und dem Perfusionsset.Nehmen Sie die Fluidikeinheit mit dem montierten Perfusionsset an die Laminar-Flow-Haube und befestigen Sie die Objektträger mit einer Konfluenzzellen-Monoschicht. Nachdem Sie das gesamte Gerät mit den Objektträgern in den Inkubator gestellt haben, schließen Sie das Stromkabel an die Pumpe an. Passen Sie in der Pumpensteuerungssoftware die Einrichtung der Fluidikeinheit an, indem Sie den Schiebertyp auswählen und die Viskosität des Mediums einstellen.Geben Sie unter Strömungsparameter den Wert für die Schubspannung ein und legen Sie die Zyklusdauer und den Strömungstyp fest. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Abspielen", um das Experiment zu starten. Denken Sie daran, den Objektträger mit Zellen zu pflegen, die mit dem gleichen Medium behandelt wurden, ohne dem Durchfluss wie bei statischen Kontrollen ausgesetzt zu sein.Tragen Sie silikonbasiertes Schmiermittel auf die Oberseiten und Seiten der 25-Millimeter-6-Well-Beladestation auf. Säen Sie 400.000 Zellen, die in drei Millilitern suspendiert sind, in jede Vertiefung der 6-Well-Kulturplatten mit flexiblem Boden, die mit Kollagen beschichtet sind. Inkubieren Sie die Zellen in befeuchteter Luft, bis sie eine 100%ige Konfluenz erreichen.Bevor Sie mit dem Streckprotokoll beginnen, waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem PBS und fügen Sie drei Milliliter frisches Nährmedium pro Vertiefung hinzu. Setzen Sie die Grundplatte mit allen geschmierten Ladestationen in den Inkubator ein und verbinden Sie den Schlauch entsprechend mit der Steuerungsausrüstung des Spannzellen-Streckbioreaktorsystems. Befestigen Sie jede Kulturplatte an einer roten Dichtung, die vom Bioreaktorsystem bereitgestellt wird.Legen Sie sie dann in die Bodenplatte im Inkubator. Platzieren Sie alle vier Kulturplatten in der Grundplatte, um eine angemessene Vakuum- und Dehnungsbelastung zu erreichen. Schalten Sie die Controller-Geräte und das Computersystem ein.Öffnen Sie die FlexCell-Steuerungssoftware und konfigurieren Sie das gewünschte Regime, einschließlich des Prozentsatzes der Dehnung, der Wellenform, der Frequenz und der Zeit. Bewahren Sie die Kur auf. Schalten Sie das Vakuumsystem ein, wählen Sie dann das Programm aus und klicken Sie auf dem Computerbildschirm auf Start, um das Dehnen auszuführen.Überprüfen Sie, ob sich die Silikonmembran bewegt und die Zellen dehnt. Die adhäsiven Endothelzellen konnten 4 bis 10 Tage nach der Extraktion beobachtet werden. Sie bilden zunächst Zellhaufen, die eine typische Kopfsteinpflaster-Morphologie aufweisen.Sie exprimierten die EC-Marker CD31 und VE-Cadherin. Die hSVECs sind bei Kultivierung unter Scherbeanspruchung in Strömungsrichtung ausgerichtet. Die Scherspannung von 20 dyn pro Quadratzentimeter für 72 Stunden induziert die Expression der typischen mechanosensitiven Gene KLF2, KLF4 und NOS3, was auf die Wirksamkeit des Scherreizes hinweist.Das Ergebnis der zyklischen Dehnung hing von der Intensität ab, die auf die menschlichen SVECs angewendet wurde. Zellen mit geringer Dehnung zeigten ein kortikales F-Aktin-Muster, das statischen Zellen ähnelte. Ohne Veränderung der Stickoxidfreisetzung für bis zu 72 Stunden veränderten unsere arteriellen Dehnungsniveaus das Aktin-Zytoskelett nach 24 Stunden und verringerten die NO-Freisetzung nach 72 Stunden.Neben mechanischen Stressstudien können die Forscher die isolierten Zellen nutzen, um verschiedene Methoden durchzuführen, um das Wissen über die Funktion und Dysfunktion von Endothelzellen zu erweitern. Nach dem demonstrierten Protokoll ist es möglich, jede andere Art von Endothelzellen unter Scherbelastung und Dehnung zu untersuchen.

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Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

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Die Mechanismen, die zur Entwicklung von Intimahyperplasie (IH) und Vene Transplantatversagen sind immer noch wenig verstanden. Diese Studie beschreibt eine Ex-vivo-System für die menschliche Venen unter kontrollierten Durchfluss und Druck durchströmen. Darüber hinaus die Effizienz der externen Mattenbewehrung zur Begrenzung der Entwicklung der IH bewertet.

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Es ist bekannt, dass verschiedene Niveaus und Muster der Flüssigkeitsscherung die endotheliale Genexpression, den Phänotyp und die Anfälligkeit für Krankheiten modulieren. Wir diskutieren den Aufbau und die Verwendung von "Scherringen": ein Modell, das unidirektionale, periodische Schubspannungsmuster erzeugt. Scherringe sind einfach zu montieren, wirtschaftlich und können hohe Zellausbeuten erzeugen.

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Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer für die Untersuchung der Echtzeitaktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen durch Scherspannung zu beschreiben.

Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung

Dieses Protokoll beschreibt eine Beschichtungsmethode, um das Wachstum von Endothelzellen auf einen bestimmten Bereich einer 6-Well-Platte für die Scherspannungsanwendung unter Verwendung des Orbitalschüttlermodells zu beschränken.

Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.

Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Hier haben wir ein Organ-on-a-Chip-Modell für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta entwickelt, um die in vivo biomechanische Belastung von glatten Muskelzellen in der menschlichen Aortenwand zu replizieren.

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

Hier wird ein einfacher Arbeitsablauf zur Unterscheidung von Endothelzellen von humanen pluripotenten Stammzellen beschrieben, gefolgt von einem detaillierten Protokoll für ihre mechanische Stimulation. Dies ermöglicht die Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie von Endothelzellen. Dieser Ansatz ist kompatibel mit nachgeschalteten Assays von lebenden Zellen, die nach mechanischer Stimulation aus dem Kulturchip entnommen wurden.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

Erfahren Sie die Isolierung humaner Endothelzellen aus der Vena saphena und deren Kultivierung unter kontrollierter Scherspannung und zyklischer Dehnung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanischer Stressantworten zur Analyse von Graft-Versagen.

Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung

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